Abstract
Mitokondrie fisjon er en prosess som involverer spalting av mitokondrier i mindre fragmenter og er regulert av GTPase dynamin relatert protein 1 (Drp1). Høyere nivåer av mitokondriell spalting er forbundet med induksjon av apoptose i cancerceller. Men dagens metoder for å nøyaktig kvantifisere mitokondrie fisjon for å sammenligne legemiddelselskap som er rettet mot denne prosessen er ofte tvetydig eller er avhengige av subjektiv vurdering. Mitokondrier er også utsatt for aggregering, noe som gjør nøyaktig analyse vanskelig. Her beskriver vi en forbedret metode for kvantifisering av mitokondriell fragmentering involverer flere forskjeller fra i dag eksisterende metoder. Cellene blir først utsatt for cytologisk sentrifugering, noe som reduserer cellulær z-aksen høyde og sprer individuelle mitokondrier for enklere observasjon. Tre kommersielt tilgjengelige verktøy fluorescens analyse blir deretter brukt til disambiguate gjenværende mitokondrielle klynger som krever nærmere inspeksjon. Til slutt, cut-off scoring er brukt, som kan skreddersys til individuelle celletype. Den resulterende tilnærmingen muliggjør effektiv og objektiv vurdering av mitokondriell fragmentering som respons på behandling. Vi brukte denne teknikken til en eksperimentell spørsmål som involverer kjemosensitiv og kjemoresistent ovarialcancer (OVCA) celler. Cisplatin og phytochemical piperlongumine ble funnet å indusere både mitokondrie fisjon og apoptose i kjemosensitiv celler, mens bare piperlongumine var i stand til å fremkalle disse cellulære responser i kjemoresistent celler. Piperlongumine-indusert apoptose ut til å være formidlet av mitokondrienes Drp1 avhengig fisjons siden apoptotisk respons ble svekket ved nærvær av det Drp1 inhibitor mDivi-1. Vår undersøkelse gir grunnlaget for en mer objektiv tilnærming til kvantifisering av mitokondriell fragmentering, og kaster ytterligere lys over en potensiell virkningsmekanisme for piperlongumine i behandlingen av kjemoresistent OVCA
Citation. Farrand L, Kim JY, Im -Aram A, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) en forbedret Kvantitativ tilnærming for vurdering av mitokondrie Fragmentering i kjemoresistent eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10,1371 /journal.pone.0074008
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 8. mai 2013, Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Farrand et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra World Class University (WCU) program (R31-10056) gjennom National Research Foundation of Korea, finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi, og den kanadiske Institutes of Health Research (MOP-119381). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mitokondrier er dynamiske organeller som finnes i de fleste eukaryote celler som gjennomgår prosesser av fisjon (dele inn i separate strukturer) og fusjon (sammenslåing av to eller flere tilstøtende strukturer). Fisjon er kjent for å gå forut for apoptose i en rekke celletyper, og er tenkt å muliggjøre en mer hurtig frigjøring av mitokondrielle pro-apoptotiske faktorer, blant annet cytokrom c og SMAC [1]. Imidlertid er nøyaktig kvantifisering av mitokondriell fisjon teknisk utfordrende på grunn av det store antallet som finnes i mange celletyper, og deres morfologiske egenskaper. Celler som oppviser typisk varierende grad av spalting avhengig av celletype og miljøsammenheng [2]
De fleste av dagens metoder for kvantitativ vurdering av mitokondriell fisjons er varianter av to hovedstrategier [2] -. [7] . Den første fremgangsmåten krever måling av lengdene av de enkelte mitokondrier for å bestemme graden av fisjons [3] – [5]. Det er funnet at aggregering av mitokondrier [6], [7], spesielt kveiling og knutedannelse av strukturene [8], så vel som det store antall av mitokondrie-fragmenter i hver celle gjør denne metode upraktisk for i det minste noen celletyper. Det unnlater også å ta hensyn til den 3-dimensjonale strukturen av mitokondrier i cellene, som ikke tillater måling langs z-aksen hvis en enkelt to-dimensjonalt bilde som blir brukt. En annen tilnærming krever en subjektiv vurdering av mitokondriell morfologi, og krever at operatøren for å vise bilder som anses å være representative for celler med rørformede eller fragmentert mitokondriene (andre begreper som brukes for å beskrive morfologi inkluderer langstrakt, smeltet, middels, krydres og «kornete») . Kvantifisering ved hjelp av denne tilnærmingen er i hovedsak basert på meningene til observatøren, og hver celle er kategorisert i henhold til hvilke representative bildet det mer ligner [9] – [11]. Et stort problem i å bruke denne teknikken er dens avhengighet av subjektiv avgjørelse som introduserer variasjoner mellom de enkelte observatører. Tradisjonell immunocytochemistry i kamret fartøy produserer også bilder som vanligvis inneholder minst noen mitokondrier som er ute av fokus under fluorescens bildebehandling, og derfor ufullstendig gjengivelse av hele prøven.
Formålet med denne studien var å utvikle en forbedret fremgangsmåte for å kvantifisere graden av mitokondriell fragmentering i celler, og å anvende denne metode for å sammenligne innvirkningen av fytokjemikalier piperlongumine på mitokondrie spalting i kjemosensitiv og kjemoresistent eggstokkreft celler
in vitro
. Mens kvantifisering av mitokondriell fragmentering kan tenkes å ta hensyn til små mitokondrielle fragmenter som opptrer på grunn av syntesen av nye mitokondrier og fragmenteringen forårsaket av mitophagy, når kombinert med ytterligere bekreftelse ved hjelp av egnede markører, kan en mer nøyaktig vurdering av omfanget av mitokondriell fisjons bli gjort. Vår metode innebærer cytologisk sentrifugering som fanger apoptotiske og friske celler ved anvendelse av tre-dimensjonale bilder (via konfokal lasermikroskopi z-stakking), og produserer flattrykte celler med dispergerte mitokondrier som er lettere å skjelne under avbildning. I tilfeller av mitokondrie aggregering, er tre kommersielt tilgjengelige programvareverktøy (fluorescensintensitet profilering, Orthogonal seksjonering, og Heat Mapping) pleide å disambiguate klynger og identifisere antall individuelle mitokondriene. I tillegg er en cut-off scoring teknikk anvendes på en mer effektiv måte å vurdere celler som enten fragmentert eller rørformet.
Vi har søkt å demonstrere den praktiske anvendelse av den nye metode, ved å bruke den til å undersøke rollen av mitokondriell fisjon i kjemoresistent eggstokkreft (OVCA). Bestandighet mot CDDP (cisplatin: cis-diamminedichloroplatinum (II)) i eggstokkreft er en betydelig hindring for vellykket behandling [12]. Mens involvering av mitokondriene i caspase-mediert apoptose har blitt grundig undersøkt, forblir rollen av mitokondriell morfologi i chemoresistance å bli fullt ut forstått. Piperlongumine er en naturlig bestanddel av lang Pepper (
Piper longum
L.) og er blitt rapportert å oppvise en rekke bioaktive effekter inkludert hemming av blodplateaggregering [13], nedregulering av androgen-reseptorer [14] og brede virkninger mot en rekke kjemoresistent kreftcelletyper gjennom induksjon av reaktive oksygenarter [15]. Vi har brukt den ovennevnte kvantitativ tilnærming for å sammenligne effekten av CDDP og piperlongumine på mitokondrie fisjon og apoptose i kjemosensitiv og kjemoresistent OVCA cellelinjer.
Materialer og metoder
Reagenser
CDDP ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Piperlongumine ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Bristol, UK). Anti-GAPDH, anti-Drp1 og anti-fosfo-Drp1 (Ser637) antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Anti-TOM20 antistoff var fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX, USA). Alexa Fluor® 488 sekundært antistoff, TEMED, RPMI 1640 dyrkingsmedier, fetal bovine serum og forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI var fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Alle antistoffer ble fortynnet i Dako antistoffdiluent (Dako # s0809) fra Agilent Technologies (Glostrup, Danmark). Komplett Mini proteasehemmer cocktail tabletter og PhosStop fosfatase inhibitor cocktail tabletter ble hentet fra Roche Applied Sciences (Penzberg, Tyskland).
Cellelinjer og kultur
CDDP følsomme human OVCA cellelinje (OV2008) [16] og dens motstandsdyktig motstykke (C13 *) [17] var gaver fra Dr. Rakesh Goel og Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Canada) og kultivert som tidligere rapportert [18]. De er av eggstokkreft endometrioid adenokarsinom opprinnelse med plateepitel differensiering.
Annexin V apoptose Analyse
OVCA celler ble farget med FITC-konjugert Annexin V (Bioline, London, UK) og propidiumjodid- å bestemme andel av cellene som var i de tidlige og sene faser av apoptose [19]. De fargede cellene ble deretter analysert ved anvendelse av en BD FACSCalibur Flowcytometer (BD Biosciences) og Cellquest /ModFit programvare.
Immunoblotting og Immunofluorescence Mikros
Immunoblotting ble utført som tidligere beskrevet [18]. Band tettheter ble analysert og kvantifisert ved hjelp av en BioRad ChemiDoc XRS + og bilde Lab V3.0 (Hercules, CA, USA). OV2008 celler ble fiksert med 4% paraformaldehyde i åtte-brønns kammer lysbilder, inkuberes med passende fluorescens-konjugert sekundære antistoffer og farget med forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI (blå, kjernefysiske flekken). De ble fotografert umiddelbart med en Zeiss LSM700 konfokal scanning mikroskop utstyrt med en Zeiss T-PMT digitalt kamera (Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Cytologisk sentrifugering og fiksering av celler
Celler ble sådd for 12 timer i RPMI-medium supplert med 10% FBS i 6-brønns plater. Etter behandling med egnede testmidlene, ble de høstet etter 2 minutters inkubering med 0,025% trypsin (200 ul) ved 37 ° C. Den trypsinering ble utført hurtig for å minimalisere mitokondrieskade og reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10% FBS i RPMI 1640. Cellene ble forsiktig vasket med 1 ml PBS (900 x
g
, 1 min, alt PBS ble filtrert med et 0,45 mikrometer sprøytefilter, Sartorius Biotechnology, Goettingen, Tyskland) og cellepelleten ble forsiktig resuspendert i 500 ul frisk PBS. Femti mikroliter av suspensjonen ble sentrifugert (900 ×
g
, 4 min) ved hjelp av cytologisk trakter sammen med silane-belagt glassplater og Whatman filterpapir (Hanil Science Cytospin cytologisk sentrifuge, Daejeon, Korea). Cellene ble deretter fiksert i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 timer. De ble deretter vasket (3 x 5 min) i PBS med forsiktig omrøring, permeabilisert med 0,02% Triton-X-fortynnet i PBS (inkubert i 10 minutter ved 4 ° C) og underkastet en annen PBS vaskesyklus (3 x 5 min). Cellene ble inkubert med TOM20 (mitokondrisk innførsel reseptor-subenhet) antistoff (1:250, 24 timer, 4 ° C), vasket med PBS og inkubert med Alexa 488 Fluor® sekundært antistoff (romtemperatur, 1 time). Cellene ble deretter vasket i PBS før fiksering med et dekkglass ved hjelp forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI, og confocal bildebehandling startet umiddelbart.
Kvantifisering av mitokondrie Fisjon
Etter cytologisk sentrifugering, fiksering og farging av cellene, 3-dimensjonale bilder av individuelle celler ble oppnådd ved bruk av konfokal mikroskopi ved overlagring av i det minste 12 tverrsnitt bilder tatt i intervaller langs Z-aksen, og som omfatter hele cellevolumet. Standard eksponeringsinnstillinger involvert en piksel holdetid av 50 mikrosekunder og felt dimensjoner på 300 × 300 mikrometer. Et minimum av 100 celler per behandlingsgruppe ble vurdert for mitokondrie fisjon i hvert replikat, med erfaringstall fra tre uavhengige replikater. Hver enkelt celle analysert ble klassifisert som enten fragmentert eller ikke-fragmentert i henhold til hvorvidt det møtte cut-off score på 8. Celler som oppfylte definisjonen av «fragmentert» derfor inneholdt 8 eller flere enkelt mitokondrielle fragmenter som var hver 3 mikrometer i lengde over den lengste aksen. I tilfeller av tvetydighet grunn aggregering av mitokondriene, tre kommersielt tilgjengelige programvareverktøy inkludert i Zeiss LSM programvarepakken (fluorescensintensitet Profilering, Orthogonal Seksjonering og Heat Mapping) ble brukt for å løse usikkerhet. Fluorescensintensitet Profilering muliggjør deteksjon av fluorescensmerkede mitokondrielle grenser (merket med TOM20), noe som reflekteres av skarpe økning eller reduksjon i fluorescens intensitet [20]. Operatøren trekker en rett linje gjennom en hvilken som helst del av bildet, og en automatisert graf av fluorescens-intensitet er konstruert. Ortogonale Seksjonering lar enhver region i bildet som skal inspiseres fra en x- eller y-aksen point-of-view (POV). Dette skaper en virtuell tverrsnittsperspektiv og gir informasjon om mitokondrie grenser som normalt vil bli skjult hvis du ser fra den tradisjonelle top-down POV. Varme Kartlegging fargekoder alle fluorescerende gjenstander innenfor et tre-dimensjonalt bilde i henhold til posisjonen til objektet langs z-aksen. I visualisere mitokondrier, er verktøyet mest nyttig for å skille separate mitokondrier som er plassert på motsatte sider av kjernen (og ellers fremstår som entall mitokondrier). I de fleste tilfeller ble disse verktøyene ikke nødvendig å anerkjenne fragmentert mitokondriene, som cytologisk sentrifugering spredte organeller for enklere visning. Den mitokondrielle morfologi på minst 80 celler pr behandlingsgruppe ble bestemt, med observatøren blindet til identiteten av behandlingsgruppene. Kvantifiseringen var avledet fra tre uavhengige eksperimenter.
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført av enveis, toveis eller treveis variansanalyse ved hjelp Sigmaplot programvare (versjon 12, Systat Software, Chicago, IL, USA). Forskjeller mellom flere eksperimentelle grupper ble bestemt ved Bonferroni post-hoc test. Statistisk signifikans ble utledes på
p
. 0,05
Resultater
Cytologisk Sentrifugering Forbedrer Mitokondrie Imaging ved å øke Skille Avstander mellom Individuell Mitokondrier
Vi først sammenlignet effekten av cytologisk sentrifugering på konfokal bildekvaliteten mitokondriene. Optimalisering avslørte at de ideelle rotor innstillingene for cytologisk sentrifuge for bildebehandling OV2008 celler inkludert en 900 × g spinn i 4 minutter. Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved bruk av disse innstillingene. I fravær av sentrifugeringstrinnet, ble mitokondriene observert å aggregere tett til kjernen og til å krølle seg mot vinkelen betraktningslinsen (Figur 1, Figur S1A). Side profilering av celler uten sentrifugering avslørte en stor z-aksen høyde på minst 8 mikrometer, noe som gjør individuell forskjell fra separate mitokondrier vanskelig. Med inkluderingen av et sentrifugeringstrinn, ble mitokondrier adskilt lenger fra kjernen, og økt avstand mellom individuelle fremkom mitokondriene. Sentrifugerte celler oppviste en redusert z-aksen høyde på omtrent 3 mikrometer, noe som resulterer i en enklere observasjon av individuelle mitokondrielle strukturer (figur 1B, Fig S1B-C). En sammenligning av bildekvalitet med og uten sentrifugering, ved hjelp av identiske bildeinnstillinger, avslørte at sentrifugering forbedret den generelle klarhet i mitokondrie funksjoner (figur 1C). Dette skyldes delvis det faktum at uten sentrifugering, de fluorescerende bilder som er inkludert en høyere grad av «ut-av-fokus «bakgrunnsfluorescens (f.eks. Fra mitokondrier som ikke var klart synlig i z-aksen planet ved hvilken bildet ble tatt). Sentrifugering forbedrer bildefokus ved å flate cellefunksjoner innenfor samme fokusplan.
(A) 3-dimensjonale topp og side profiler av ubehandlede OV2008 celler, med og uten cytologisk sentrifugering før fiksering. Gule piler indikerer typiske områder av separasjon som vises mellom mitokondrier etter sentrifugering. (B) Ortogonale deler av de samme bildene sett i (A) tatt med identiske kameraeksponeringsinnstillinger. Celler ble løst i 3,7% paraformaldehyde og farget for kjernekraft (DAPI, blå) og mitokondrielle (TOM20, grønn) signal. (C) sammenligning av mitokondriell bildekvalitet mellom konvensjonell immunocytokjemi og cytologiske sentrifugeringsfremgangsmåter. Bilder av klassisk rørformet og fragmentert mitokondriell morfologi blir synlig skarpere etter sentrifugering på grunn av reduksjon av fluorescens som stammer fra bakgrunns kilder utenfor fokusplanet. Utvidelsen av kjernen etter sentrifugering er på grunn av utflating av cellene ved sentripetalkraft. Skala barer = 5 mikrometer.
fluorescensintensitet Profilering, Orthogonal seksjonering og Heat kartleggingsverktøy Tillat for Rapid Skillet av Individuell Mitokondrie Fragments innen Aggregater
Vi har merket oss at selv om sentrifugeringstrinn styrket vår evne til å skille mitokondriene, i noen tilfeller aggregering av mitokondriene dukket uunngåelig tross innsats for å løse problemet. Vi har vedtatt tre verktøy fluorescens analyse (fluorescensintensitet profilering, Orthogonal seksjonering og Heat Mapping) for å supplere kvantifisering av mitokondrier stede i aggregater. Disse verktøyene gir bedre informasjon om den romlige orientering av mitokondrielle membraner, slik disambiguation av fluorescerende signal som ellers kan virke forvirrende. Fluorescensintensitet profilering (Zeiss LSM programvarepakken) er et verktøy som normalt brukes for å bestemme signal-til-bakgrunnsforhold på tvers av fluorescerende deler av et bilde [20]. Dette verktøyet kan alternativt brukes til å bestemme antall individuelle mitokondrier innenfor et aggregat, som intensiteten av fluorescensen er direkte proporsjonal med antallet av mitokondrielle membraner. Ved hjelp av gjennomsiktige overlegg, kan antallet mitokondrier ekstrapoleres i store grupper ved enkel deling av toppen signal av intensiteten av fluorescens oppnådd fra en enkelt mitokondrie (figur 2A). Heat Mapping gir informasjon om z-aksen mitokondrielle steder ved hjelp av et fargekodet spektrum (figur 2B, Figurer S2A-C) [21]. Mitokondrier som er overlagret eller flate bak eller foran kjernen kan lett identifiseres etter deres farger oppdraget. Endelig Orthogonal Seksjonering (Zeiss LSM) gir tverrsnitt av alle x-y sted fra et perspektiv vinkelrett på z-aksen, slik at nær inspeksjon av mitokondrie grenser som ellers ville bli skjult fra en tradisjonell ovenfra og ned (figur 2C). Ved tilstrekkelig høy oppløsning, og med optimal ekspansjon av cytoplasma via sentrifugeringstrinnet, har vi funnet at disse fluorescens verktøy ble bare nødvendig i 10% av tilfellene, hvor en avgjørelse ikke kan nås på grunn av uregelmessig mitokondrie aggregering. Den effektive bruk av disse verktøyene er avhengig av flere forutsetninger, for eksempel at alle mitokondrier i et aggregat er like farget, det fluorescente signalet har et tilstrekkelig signal-til-støy-forholdet og at mitokondrielle membraner kan skilles ved tilsvarende endringer i fluorescenssignalet.
(A) fluorescensintensitet profilering av en enkelt celle med fragmenterte mitokondrier. Intensiteten av mitokondriell signal langs en lineær profil valgt av operatøren (lys blå pil) er representert kvantitativt. (I) Utslipp toppen av en enkelt mitokondrie indikeres grafisk (gul pil). (Ii) Separerte mitokondrier er tydelig som selvstendige topper. (Iii) Høyere topper (gul pil) antyder tilstedeværelse av multiple mitokondrier, overlagret under sentrifugeringen. 3D-bildedata er lagdelt transparent, med individuell mitokondrielle antall er direkte proporsjonal med intensiteten av fluorescens. (B) Termisk kartlegging av en enkelt celle ble behandlet med CDDP (10 pM, 12 timer). Forskjeller i z-akse plassering verdier av mitokondrie fragmenter er representert som farger. (I) zoom (gul boks) avslører tydelig mitokondrier ved forskjellige z-aksen høyder (grønne vs oransje). (Ii) Den motsatte riss av den samme celle i (i), noe som indikerer ytterligere individuelle fragmenter (cyan vs blå, gul pil). (C) Orthogonal seksjon verktøy som viser tverrsnitt av en enkelt celle langs y-aksen (innfelt stiplet gul boks, forstørret som grønne boksen) og x-aksen (forstørret som rød boks). Y. (i) zoom (grønn boks) av y-aksen ortogonal delen. (Ii) zoom (rød boks) til x-aksen ortogonal delen. Gule piler indikerer områder som skiller enkelt mitokondriene.
Bruk av Cut-off Poeng Lar Skillet mellom celler som inneholder forskjellige grader av mitokondrie Fisjon
Selv om det er mulig å bestemme nøyaktig antall mitokondrier i en gitt celle, er det tidskrevende og upraktisk hvis vurdering av et stort antall celler. Vi neste utviklet en semi-kvantitativ metode for en mer effektiv og mindre arbeidskrevende vurderingen av bildene. Vi fortsatte med å vurdere den mitokondrielle fenotype (rør eller fragmentert) basert på en cut-off poengsum definert av et minimum antall mitokondrie fragmenter av en definert lengde tilstede i hver celle. Den stringens for kategorisering bestemmes av cut-off poengsum valgt (figur 3). Hvis 8 eller flere mitokondrier som var hver kortere enn 3 mikrometer i lengde ble funnet hvor som helst i cellen, ville hele cellen kvalifisere som «fragmentert». Oppfyllelse av kriteriene gjengir ytterligere vurdering av de resterende mitokondrier unødvendige (vist i figur 3).
Figuren viser tre celler med varierende grad av fisjon. (I) En cut-off score på to (utfallet er «Ja», hvis 2 eller flere mitokondrie-fragmentene har oppdaget at er 3 mikrometer i lengde over den lengste aksen) setter alle 3 celletyper i samme kategori. (Ii) En cut-off poengsum hevet til fem skiller Cell En som annerledes Cells B og C (et kriterium for å klassifisere Cell En som «rør») (c) En cut-off score på 10 plasser Cells A og B i samme kategori, atskilt fra Cell C. bruk av mer enn en cut-off poengsum åpner for forskjellsbehandling av varierende grad av mitokondrie fisjon.
kjemosensitivitet til CDDP og Piperlongumine er forbundet med mitokondrie fisjon
neste påført denne teknikk for å undersøke innflytelsen av piperlongumine og CDDP (0 og 10 uM, 12 h) på mitokondrie spalting i kjemosensitiv (OV2008) og kjemoresistent (C13) OVCA-celler (figur 4). Begge forbindelser som skyldes økninger i mitokondrie fisjon og apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte i OV2008. Men bare piperlongumine hadde samme effekt i C13, noe som tyder på at sistnevnte ikke bare fremmer apoptose men induserer også mitokondrie fisjon i kjemoresistent OVCA celler. Et minimum av 100 celler per behandlingsgruppe ble vurdert for mitokondrie fisjon i hvert gjenskape, med erfaringstall fra tre uavhengige replikater.
(A) Representative bilder av rørformede og fragmenterte mitokondrier i kjemosensitiv celler (OV2008) og deres motstandsdyktig kolleger (C13). Mitokondrier og kjerner ble farget med TOM20 (grønn) og DAPI (blå), respektivt. (B) Effekt av piperlongumine og CDDP på mitokondrie fisjon i OV2008 og C13 celler, som vurderes med en enkelt cut-off score på 8 (celler som inneholder 8 eller mer mitokondrielle fragmenter 3 mikrometer i lengde ble klassifisert som å ha fragmentert mitokondriene). (C) Effekt av CDDP og piperlongumine på apoptose, som vurdert av Annexin V analysen (*,
p
0,05, **,
p
0,01; ***
p
. 0,001 versus respektive ubehandlet kontroll)
CDDP og Piperlongumine-indusert mitokondrie fisjon og apoptose er Drp1 avhengige i kjemosensitiv OVCA
Som svar på ulike typer av celle stress, blir Drp1 aktiveres av defosforylering ved Ser637. Dette etterfølges av dens rekruttering til mitokondriene hvor det oligomerizes for å tilveiebringe den mekaniske styrke som er nødvendig for spalting for å forekomme [22]. Vi antok at dersom Drp1 avhengig mitokondrie fisjon er en determinant av kjemosensitiv respons, bør både CDDP og piperlongumine behandling resultere i defosforylering av Drp1. Dette var faktisk tilfelle i OV2008 celler (figur 5A). Enda viktigere, behandling av OV2008 celler med en farmakologisk inhibitor av Drp1, mDivi-en, betydelig dempet både mitokondrie fisjon og apoptose indusert av de to forbindelser (figur 5B). Disse dataene støtter en utløsende kobling mellom fisjon og apoptose. Et minimum av 100 celler per behandlingsgruppe ble vurdert for mitokondrie fisjon i hvert gjenskape, med erfaringstall fra tre uavhengige replikater.
(A) CDDP (10 mm) og piperlongumine (10 mm) nedregulert av fosfor -Drp1 (Ser637) innhold i OV2008 celler
in vitro
. (B) (i) Effekt av mDivi-1 (0-10 mm) på CDDP- og piperlongumine-indusert mitokondrie fisjon og (ii) apoptose som vurderes av Annexin V analysen (**,
p
0,01; ***,
p
0,001 versus respektive DMSO kontroll behandlet med identisk mDivi-en konsentrasjon, #,
p
0,05 versus respektive PL eller CDDP behandling i fravær av mDivi-1).
Drp1 avhengig mitokondrie~~POS=TRUNC fisjon er med på å bestemme Piperlongumine-indusert apoptose i kjemoresistent OVCA
Våre tidligere studier har vist at mitokondrie fisjon er assosiert med kjemosensitivitet, mens CDDP motstand er markert med en mangel på slik aktivitet (figur 4). Vi neste søkt å fastslå om piperlongumine var forårsaker apoptose i kjemoresistent C13 * celler via Drp1 avhengige mitokondrie fisjon. Konsentrasjon-responsanalyse viste at piperlongumine, men ikke CDDP, indusert defosforylering av Drp1 ved Ser637 (figur 6A). Tilsetning av Drp1-inhibitor mDivi-en også delvis svekket piperlongumine-indusert mitokondrie fisjon og apoptose (figur 6B). Et minimum av 100 celler per behandlingsgruppe ble vurdert for mitokondrie fisjon i hvert gjenskape, med erfaringstall fra tre uavhengige replikater.
(A) Piperlongumine men ikke CDDP (0-10 mm) nedregulerer fosfor-Drp1 (Ser637) innhold. (B) (i) Effekt av mDivi-1 (0-10 uM) på piperlongumine-indusert mitokondriefisjons og (ii) apoptose, som vurdert av Annexin V-analyse (**, p 0,01; ***, p 0,001 versus respektive DMSO kontroll behandles med identisk mDivi-en konsentrasjon, #,
p
0,05; ##,
p
0,01; ###,
p
0,001 versus respektive PL eller CDDP behandling i fravær av mDivi-1))
Diskusjoner
Mens kvantifisering av mitokondriell fisjon er foretatt i flere godt designet.. studier, beskrivelser av publiserte tilnærminger er noe uklare og subjektive [2] – [7]. Vi merker oss to betydelige vanskeligheter i nøyaktig kvantifisere fisjon. Den første er aggregering av mitokondriene, spesielt rundt kjernen, noe som gjør forskjellen på separate organ vanskelig. Den andre er den tiden det tar å kvantifisere mitokondriene, selv om alle individuelle fragmenter kan skilles ved hjelp av avanserte tre-dimensjonale kartlegging teknikker.
Vi erkjenner at det finnes flere publiserte automatiserte metoder som vi har undersøkt og funnet å være interessant. Vi mener imidlertid at disse metodene krever omfattende bakgrunnskunnskap om beregningsalgoritmer for å brukes effektivt. En metode bruker automatisert fluorescerende pulserende ved 30 Hz og ansettelse av dataassistert analyse [23]. I vårt forsøk på å følge trinnene som tilbys av forskerne, fant vi betydelige vanskeligheter med å tolke en rekke av de instrukser som krever betydelig bakgrunnskunnskap, og var ikke i stand til å lykkes i å produsere meningsfulle data. Generering av et syntetisk binært bilde som en testmodell krever også omfattende fortrolighet med passende dimensjoner av mitokondrier i hver celletype, et krav som ikke er nødvendig for vår tilnærming.
Et annet interessant beregningsorientert tilnærming [24] omfatter automatisert subtyping mitokondriell morfologi. Vi har også forsøkt å ansette MicroP programvare skrevet av forfatterne for våre eksperimentelle behov, men det var på samme måte svært vanskelig for oss å lære som følge av tekniske (beregnings kunnskap) som trengs. MicroP krever at brukeren å kunne kalibrere programvaren før bruk.
I de nåværende studier, har vi adressert spørsmålet om aggregering ved å bruke en cytologisk sentrifugeringstrinn, som flater cytoplasma langs planet av raset og gjør skillet av individuelle mitokondrier betydelig enklere. Spørsmålet om tidsbegrensning ble løst ved bruk av cut-off score for å tillate mindre arbeidskrevende kategorisering av mitokondrielle fenotyper. Mens den mest nøyaktige metode for kvantifisering av spalting vil være et absolutt telling av det totale antall av individuelle fragmenter, den tid som kreves gjør denne fremgangsmåten upraktisk, spesielt for studier med en stor prøvestørrelse. Vårt forslag til tilnærming åpner for kjøp av mitokondrie fisjons data sammenlignes med det som kreves i tidligere studiedesign [2] – [7], men med mer spesifikke retningslinjer for uavhengig reproduserbarhet. En oversikt over den nye tilnærmingen er vist i Figur 7.
Mens vår tilnærming har åpenbare fordeler, vi også oppmerksom på flere potensielle fallgruver. Mangfoldet i mitokondriell morfologi over celletyper er betydelig, og kan kreve finjustering og validering av protokollen. For eksempel kan noen celletyper ha et stort antall mitokondria og en forholdsvis lavere volum av cytoplasma. I slike tilfeller kan imidlertid optimalisering av sentrifugen trinn og et større antall av z-aksen bilder per celle være nødvendig. Høyere sentrifugehastigheter forbedre mitokondrie dispersjon, men kan også fremme ruptur av kjernen (vist på fig S3). Vi har også forsøkt å bruke vår tilnærming med
in vivo
OVCA tumorprøver farget med TOM20, og fant at manglende evne til å sentrifugere solide svulster kombinert med overdreven uspesifikk bakgrunn signal gjort det umulig. 20 minutter.
