Abstract
Bakgrunn
Ergp55 protein tilhører Ets familie av transkripsjonsfaktor. ETS proteiner er høyt konservert i sin DNA-bindende domene og involvert i ulike utviklingsprosesser og regulering av kreft metabolisme. Å studere strukturen og DNA bindende autoinhibition mekanisme Ergp55 protein, har vi produsert full lengde og mindre polypeptider Ergp55 protein i
E. coli Hotell og karakteriseres ved hjelp av ulike biofysiske teknikker.
Resultater
Ergp55 polypeptider inneholder store mengder a-spiral og tilfeldig viklingskonstruksjonene målt ved rundskriv dichorism spektroskopi. Den fulle lengde Ergp55 danner en fleksibel og langstrakt molekyl som avslørt av molekylær modellering, dynamikk simulering og strukturelle prediksjon algoritmer. Bindende analyser av Ergp55 polypeptider med target DNA-sekvenser av E74 og økonomisjefer arrangører indikere at lengre fragmenter av Ergp55 (utover Ets domene) viste tegn til auto-hemming. Denne studien viste også de delene av Ergp55 protein som medierer auto-hemming.
Betydningen
Den aktuelle studien vil hjelpe til med å utforme de forbindelser som stabiliserer hemmet form av Ergp55 og hemme binding til promoter DNA. Det vil bidra i utviklingen av legemidler rettet mot Ergp55 for prostata kreft behandling
Citation. Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) Strukturell modellering og DNA Binding Autoinhibition Analyse av Ergp55, en kritisk transkripsjonsfaktor i Prostatakreft. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10,1371 /journal.pone.0039850
Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA
mottatt: Mai 5, 2012; Godkjent: 31 mai 2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Gangwar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av stipend fra Institutt for vitenskap og teknologi (DST) New Delhi, India (No-SR /SO /HS-05/2009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ETS familie proteiner aksjen høyt konservert bevingede helix-turn-helix DNA-bindende domene og binder seg til konsensus DNA kjernesekvensen 5′-GGA (A /T) -3 «[1]. ERG proteiner tilhører Ets familie av transkripsjonsfaktor. Erg genet er omorganisert i human myelogen leukemi [2] og i 5-10% av pasienter med Ewing sarkom [3]. I begge tilfeller, translokasjon resulterer i ekspresjon av onkogene fusjonsproteiner bestående av Erg og medlem av Tet familien av RNA-bindende proteiner. Erg protein er viktig for definitiv hematopoiesis, voksen hematopoetisk stamcelle-funksjon og vedlikehold av normale perifere blodplatetall [4]. De TMPRSS2-Erg fusjon onkogene transkripsjoner observert i prostatakreftceller er signifikant assosiert med aggressiv kreft, metastatisk spredning og økt sannsynlighet for død [5].
Erg genet koder for fem proteiner, Erg-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 og Ergp38 som følge av forskjellig spleising, polyadenylation eller initieringskodon. Den Ergp55 isoformen inneholder fire funksjonelle domener som er involvert i DNA-binding, transkripsjonen aktivering og negativ regulering av transaktivering [6]. De Ergp55 proteinformer dimer med seg selv og med to andre isoformer Ergp49 og Ergp38, via PNT og Ets domene [7]. Den sentrale domenet av Ergp55 oppfører seg som inhiberende domene på dimerisering og fjerning forbedrer trans egenskapen (7). De kritiske rester av Ets domene Ergp55, som formidler Ergp55-jun /fos-DNA trefoldig kompleks formasjon, har blitt identifisert og karakterisert [8].
Så langt tertiære strukturen til noen full-lengde Ets protein er ikke bestemt. Imidlertid strukturer av DNA-bindende domener av flere Ets proteiner er blitt bestemt ved anvendelse av røntgen-krystallografi, og kjernemagnetiske resonansteknikker [9] – [16]. Den gonome bred analyse av Ets-familien DNA-bindende
in vitro Hotell og
in vivo
har nylig blitt undersøkt [17].
Den nøyaktige mekanismen som, Ergp55 protein fungerer på transkripsjon er ikke forstått. For å forstå strukturen og DNA bindende autoinhibition mekanisme Ergp55, utførte vi sirkulær dichorism, molekylær modellering og teoretisk strukturell prediksjon analyse på Ergp55 polypeptider. For å forstå den DNA-bindende autoinhibition anordning, ble bindingsstudier av Ergp55 polypeptider med DNA-sekvenser av E74 og CFOer promotorer gjennomføres. Våre resultater tydet på at (i) Ergp55 polypeptider som inneholder høye prosentandel av α-heliks og tilfeldige spiralstrukturer (ii) full lengde Ergp55 er et fleksibelt og langstrakt molekyl (iii) lengre fragmenter utover den kanoniske Ets domenet av Ergp55 viste tegn på autoinhibition.
Materialer og metoder
Bygging av Ergp55 plasmider
Den fulle lengde Erg
1-479 og Erg
112-399 gener ble klonet i pET28a (+ ) vektor. Den Erg
1-399 og Erg
307-399 gener ble klonet i pRSETA og pET21a (+) ekspresjonsvektor. Alle delesjonsmutantgener ble amplifisert fra full-lengde Erg
1-479 plasmid ved bruk av polymerase-kjedereaksjon.
(A) Vist her aminosyresekvensene i full lengde Ergp55 uten 6xHis tag og spaltingssete. Restene ble fremhevet i henhold til størrelsen på Ergp55 domener, NTD (gul), PNT (grønn), CAE /CD (blå /cyan), Ets (rød) og CTD (svart). (B) Vist her de Ergp55 konstruksjoner anvendt i eksperimentene (farge ordningen samme som i fig. 1A). De merkede rester som definerer sekvensen av begynnelsen og slutten av konstruksjoner.
Aestericks
betegne posisjonen 6xHis tag på ulike Ergp55 konstruksjoner.
Rensing av Ergp55 polypeptider
Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 og Erg
307-399 plasmider ble forvandlet til
E. coli
. BL21 (DE3) celler. Cellene ble dyrket i 3 liter Luria-Bertani-medium inneholdende egnede antibiotika ved 37 ° C, inntil OD
600 nådde 0,6. Den 0,125 mM IPTG ble indusert ved 37 ° C og kultur ytterligere ristet i 4 timer ved 220 rpm. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 6000x
g
til 10 ° min ved 4 ° C. Cellene ble suspendert i 50 ml lyseringsbuffer inneholdende (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCl, 0,1% triton X-100, 5% glycerol, 3 mM 2-merkaptoetanol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid fluor og 0,5 mg /ml lysozym) og avbrutt ved sonikering ved 4 ° C. Det urene lysat ble sentrifugert ved 25000 x
g
i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble applisert på Ni-NTA kolonne pre-ekvilibrert med bindende buffer (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCl, 5% glyserol, 2 mM 2-merkaptoetanol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 10 mM imidazol). Proteinene ble eluert fra kolonnen med elueringsbuffer (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCl, 5% glyserol, 3 mM 2-merkaptoetanol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 250 mM imidazol). De eluerte fraksjoner ble samlet, konsentrert og applisert på Sephacryl S-200 HR gelfiltrering-kolonne pre-ekvilibrert i buffer (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 3 mM 2-merkaptoetanol og 5% glyserol). De rensede proteiner ble konsentrert til 10 mg /ml ved å bruke Amicon ultra sentrifugal-filteranordning (Mw cutoff 10 kD). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av UV-bestråling ved 280 nm ved hjelp av ekstinksjonskoeffisienten beregnet med EXPASY programvare (https://us.expasy.org/tools/protparam.html).
Kromatogrammet av (A) fullstendig lengde Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 og (D) Erg
307-399 polypeptider vises. SDS-PAGE-analyse og beregnet molekylvekt på hvert protein er betegnet på hvert kromatogram.
N-terminal proteinsekvensering og ione-spray massespektrometri bekrefter identiteten og renheten av Ergp55 polypeptider. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av absorbansen ved 280 nm. Coomassie brilliant blå farget SDS-PAGE-analyse indikerte at alle Ergp55 polypeptider ble renset på mer enn 95% renhet. Alle proteiner ble lagret ved -20 ° C.
Surface plasmonresonans eksperiment
biosensor studiene ble utført ved hjelp av BIAcore 2000 (Biacore Pharmacia Biosensor AB, Uppsala Sweeden) utstyr [18]. Alle forsøkene ble utført ved 25 ° C i HBS-buffer inneholdende [10 mM HEPES-buffer pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0,005% P20 som overflateaktivt middel). Ettersom alle Ergp55 polypeptider inneholde 6xHis signal enten på N- eller C-terminal, er sensorbrikke som inneholder høy tetthet av immobilisert Ni-NTA en ideell kode for å immobilisere disse proteinene. Initialt ble strømnings cellene i chip aktiveres ved å føre nikkel-klorid-oppløsning i løpet av den. 40 ul av hver Ergp55 polypeptid
f.eks
., Erg
1-479 (0,14 ug /ul), Erg
1-399 (0,19 ug /ul), Erg
112-399 (0,92 ug /ul) og Erg
307-399 (0,17 ug /ul) ble injisert i forskjellige strømnings celler av Ni-NTA chip ved en strømningshastighet på 10 ul /min.
i figurene (A ) Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 og (D) Erg
307-399 polypeptider ble immobilisert på Ni-NTA chip. Tre konsentrasjon (1, 2, 3 uM) av DNA-sekvensen av promotor E74 injisert på hver immobilisert Ergp55 polypeptid.
i forskjellige strømnings celler fra Ni-NTA-brikken, etter RU enhet av hvert polypeptid ble Ergp55 immobilisert
f.eks
., Erg
1-479 (2904 RU), Erg
1-399 (2848 RU), Erg
112-399 (2825 RU) og Erg
307-399 (247 RU), hvor en RU svarer til immobilisert proteinkonsentrasjon av ~ 1 pg /mm. Bindingsforsøk ble utført med tre forskjellige konsentrasjoner [1, 2, 3 uM) av DNA-sekvensen av promoteren E74 (5 «TACCGGAAGT 3») i HBS-buffer og injiseres over immobilisert Ergp55 polypeptider ved en strømningshastighet på 10 ul /min. Lignende forsøk ble utført ved anvendelse av DNA-sekvensen av promotor CFOer sekvens (5 «GACAGGATGTG 3»). Den sensogram lov til å kjøre for en annen 4 min. Regenereringen av biosensor overflate ble gjort ved hjelp av 30 s puls av 1 mM NaOH ved strømningshastighet på 10 mL /min. Førsteamanuensis og dissosiasjon kinetiske konstanter ble beregnet ved BIAeveluation 3.0-programvaren ved hjelp av enkle 01:01 Langmuir modell med antagelsen om at tettheten av Ergp55 polypeptider på sensorbrikken ikke var høy nok til å støtte bivalent DNA bindende.
I tall ( A) Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 og (D) Erg
307-399 polypeptider blir immobilisert på Ni-NTA chip. Tre forskjellige konsentrasjon (1, 2, 3 mm) av DNA sekvensen av økonomisjefer promoter injisert på hver immobilisert Ergp55 polypeptid.
Circular dichorism
CD målingene ble registrert ved hjelp av Chirascan
TM CD spectropolarimeter (Applied photophysics) med et vannbad for å opprettholde konstant temperatur. De Ergp55 polypeptider ble fortynnet til 0,2 mg /ml i 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,0 og applisert på 0,1 cm kvartskuvette. Emnet på alle forsøkene var 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,0. Den endelige spekteret var i gjennomsnitt tre sekvensiell skanning.
(A) CD spektra av Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 og Erg
307-399 polypeptider registrert fra 200 nm til 260 nm. (B) Temperatur indusert utfoldelsen av full lengde Ergp55 protein. Tomten (indre) som inneholder gjennomsnittlig rest ellipticity versus temperatur indikerer denaturering av a-helikser av brettet full lengde Ergp55.
For termisk denaturering studie av full lengde Ergp55, CD spektra ble registrert ved 10 ° C økning fra 10 ° C til 90 ° C. Før målingen ble prøven kyvetten ekvilibrert ved hver temperatur. Temperaturmålinger ble tatt innen kyvetteholderen avtalt med temperaturen i vannbad. Alle CD-data ble konvertert til å bety rester ellipticity (gr. Cm
2 /dmol). Den Dichroweb server [19] ble brukt til å beregne mengden av sekundærstruktur i Ergp55 polypeptider fra CD spektra.
Sekundær struktur prediksjon
SOPMA [20], GOR [21] og PSIPRED [ ,,,0],22] algoritmer ble brukt til å forutsi den sekundære strukturen innholdet i full lengde Ergp55, som viste ~21% α-heliks, 12-15% β-ark og 65-69% tilfeldig viklingskonstruksjonene.
(A) PSIPRED program analyse av full lengde Ergp55. (B) strukturell modell av full lengde Ergp55 etter molekylær modellering og dynamikk simulering analyse ved hjelp av GROMACS program (C) Den uordnede forutsigelse foretas ved DISOPRED for (a), NTD (b), PNT (c), CAE /CD (d), ETS og (e), CTD regioner av Ergp55.
modellering av Ergp55 polypeptider
Phyre server [23] ble brukt for å få strukturen i full lengde Ergp55 protein (1-479 rester). Serveren ga strukturen PNT domene (95-221 rester) av Ergp55 å bruke malen PDB-2YTU (løsning struktur av SAM-PNT domene av menneskelig venn leukemi integrering faktor-en transkripsjonsfaktor, ennå ikke publisert). NMR løsning strukturen PNT domene (108-201 rester) ble hentet fra protein data bank (PDB-1SVO) [24]. Den Phyre serveren også gitt strukturen Ets domene (284-412 rester) av Ergp55 bruker malen PDB-2NNY (Regulering av transkripsjonsfaktoren Ets-en ved DNA-mediert homodimerization) [13]. NMR strukturen Ets domenet Fli1 (306-403 rester) ble hentet fra protein data bank (PDB-1FliA) [25]. Det strukturelle modellering av N- terminal (1-94 rester), sentrale domenet (222-283 rester) og C- terminal (413-479 rester) av Ergp55 ble ikke forsøkt grunn av mangel på innspill modell.
den Modeler [26] og LOMETS threading [27] programmer som ble brukt til å bygge strukturen i full lengde Ergp55 bruker følgende innganger (i) strukturell modell av PNT domene (95-221 rester) av Ergp55 (ii) strukturell modell av Ets domene ( 284-412 rester) av Ergp55 (iii) NMR-strukturen av PNT domene (residuer 108-201) av Ergp55 og (iv) NMR-strukturen av Ets domene (residuer 306-403) av Fli1. Energy minimering ble utført på modellert Ergp55 hjelp Gromacs program versjon 4.0.5 [28]. 100 skritt av bratteste anstendig og 500 trinnene konjugerte gradient algoritmer ble brukt i energi minimalisering beregningen.
molekylær dynamikk simuleringer
10 ns molekyldynamikk (MD) simulering ble utført på minimeres Ergp55 modellen ved hjelp GROMACS programmet (versjon 4.0.5) med Gromacs43a2 kraftfelt [28]. Den Ergp55 modellen ble nedsenket i en kubisk boks som strekker seg 0,5 nm fra protein overflaten og oppløst med eksplisitte SPC vannmolekyler. Klorid og natriumioner ble tilsatt for å nøytralisere de systemer, som så ble simulert med periodiske grensebetingelser. Den oppløst Ergp55 Modellen består av 4832 protein atomene omgitt av ~390, 000 vannmolekyler. Før du kjører simuleringen, hele systemet var energi minimert for 200 gjentakelser av bratteste utforkjøringer og deretter likevekt for 20 ps holde protein atomene behersket. Alle begrensninger ble fjernet fra proteinet og temperaturen ble gradvis øket i løpet av 10 distinkte trinn på 5 ps simuleringer hver.
Berendsen kobling ble anvendt for å opprettholde en konstant temperatur på 300 K med en koblingskonstant τ på 0,1 ps. Van der Waals interaksjoner ble modellert med 6-12 Lennard-Jones potensialer med en nm cutoff. Den coulomb avskåret var 1,0. Tiden trinnet var 2 fs og koordinater ble reddet hvert fem ps for analyse av MD baner.
Stereokjemien simulert Ergp55 modellen ble sjekket av PROCHECK program av CCP4 suite [29]. Sekundær struktur sammensetning ble målt ved DSSP programmet [30] og struktur visualisering av PyMOL programmet [31].
Resultater
Rensing av rekombinante Ergp55 polypeptider
Vi produserte full lengde og mindre polypeptider (som inneholder undergruppe av predikerte domener) av Ergp55 i
E. coli
og renses ved bruk av standard kromatografiske teknikker (fig. 1A-B). Under størrelse utelukkelse kromatografi, renset Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 og Erg
307-399 polypeptider eluert ved volumer som tilsvarer deres molekylvekt (Fig. 2A-D). Den fulle lengde Erg
1-479 elueres på størrelsen på 53,8 kD, Erg
1-399 polypeptid eluert ved 51,1 kD, Erg
112-399 eluert ved 44,9 kD og Erg
112-399 elueres på 15,1 kD. Den Erg
1-479 og Erg
1-399 polypeptider har tendens til å bli dårligere hvis de oppbevares i 7 dager ved 4 ° C. Den Erg
112-399 og Erg
307-399 polypeptider ikke brytes ned over tid og mer stabil enn Erg
1-479 og Erg
1-399 polypeptider.
DNA bindende studier med E74 og økonomisjefer promotersekvenser
funksjonaliteten renset Ergp55 polypeptider ble vurdert ved DNA-bindende eksperiment ved hjelp overflaten plasmon resonans teknikk. Den observerte
K
D
verdien av Ergp55 polypeptider med DNA-sekvensen til E74 arrangøren var
f.eks
., Erg
1-479 ~ 704 nM, Erg
1- 399 ~ 217 nM, Erg
112-399 ~ 115 nM og Erg
307-399 ~ 65 nM (fig. 3A-D). Resultatene indikerte at Ets domenet Ergp55 (Erg
307-399) har høyest affinitet for E74 promoter DNA-sekvens. DNA bindende affinitet reduserer ~ 2 ganger for Erg
112-399 polypeptid, ~3 brett for Erg
1-399 polypeptid og -10 brett for full-lengde Erg
1-479, sammenlignet med Erg
307-399 polypeptid (Ets domene). Disse resultatene indikerer at N- og C-terminale områder med hensyn til Ets domenet er involvert i auto-inhibering av DNA-binding til Ergp55 protein.
Den observerte
K
D
verdien av Ergp55 polypeptider med økonomisjefer promotersekvens var
f.eks
., Erg
1-479 ~ 232 um, Erg
1-399 ~ 196 um, Erg
112-399 ~ 38 mikrometer og Erg
307-399 ~ 0,45 mikrometer (fig. 4A-D). Disse resultatene indikerer også at Ets domenet har den høyeste affinitet for DNA-sekvenser av CFOs promoter. Begge N- og C- terminale områder med hensyn til Ets domene er involvert i hemming av økonomisjefer DNA binding til Ergp55 protein.
CD målinger av Ergp55 polypeptider
For å identifisere de sekundære struktur innholdet i Ergp55 polypeptider, helt til UV-CD-spektroskopi ble anvendt (fig. 5A). CD data ble de-convoluted hjelp DICHROWEB webserveren [19] og prosentandel av α-helix, β-ark og tilfeldige viklingskonstruksjonene ble estimert. CD-spektret av full-lengde Erg
1-479 (fig. 5A) viste to minima rundt 208 nm og 222 nm, karakteristisk for α-heliks struktur. Dekonvolvering av data forutsier ~35% α-heliks, 15% β-ark og 49% vilkårlig viklingskonstruksjonene i full lengde Ergp55. CD data fra Erg
1-399 polypeptid spår -25% α-helix, 17% β-ark og 57% tilfeldig viklingskonstruksjonene, som viser mindre α-heliks og β-sheet struktur i forhold til full lengde Erg
1-479 struktur.
Ved Erg
112-399 polypeptid, anslår CD data ~29% α-helix, 15% β-ark og 55% tilfeldig viklingskonstruksjonene. Dette polypeptidet inneholder mindre α-helix, lik β-sheet struktur i forhold til full lengde Erg
1-479. For Erg
307-399 polypeptid, anslår CD data ~31% α-helix, 10% β-ark og 59% tilfeldig viklingskonstruksjonene, som har mindre α-heliks og β-sheet struktur i forhold til full lengde Erg
1-479 struktur. Men disse verdier er nær sekundærstrukturinnhold i krystallstrukturen av Ets domene av Fli-en (35,7% α-heliks, 4,1% β-ark, 60,2% tilfeldig spiral). ETS domene Fli-en er det nærmeste homolog til Ets domenet Ergp55 [32].
termo av full lengde Ergp55
For å vurdere termo av full lengde Ergp55, et langt UV- CD-spektrum av protein ble målt fra 10 til 90 ° C (fig. 5B). Det er klart fra spektra den sekundære struktur av Ergp55 denatures som temperaturen øket. Når midlere rest elliptisitet ved 222 nm er plottet mot temperatur, infleksjonspunktet av sigmoidal kurve angir T
m av 45 ± 2 ° C av full lengde Ergp55.
Molekylær modellering og dynamisk simulering av full lengde Ergp55
Den sekundære strukturen prediksjon på full lengde Ergp55 hjelp PSIPRED programmet er vist i (fig. 6A). De Modeler og automatisk gjenge LOMETS programmer som ble anvendt for å konstruere full lengde Ergp55 modellen ved anvendelse av (i) strukturen av 95-221 rester av Ergp55 ved hjelp av malen PDB-2YTU (ikke publisert) som har 57% sekvensidentitet (ii) strukturen av 284- 412 rester av Ergp55 ved bruk av templat PDB-2NNY [13] som har 40% sekvensidentitet og (iii) NMR-strukturen til 108-201 rester av Ergp55 og (iv) NMR-strukturen til 306-403 rester av Ets domene av Fli-1 med 90 % sekvensidentitet. Energi minimalisering og dynamikksimuleringer analyse ble utført på konstruert Ergp55 modell, som ga et fleksibelt og langstrakt struktur (fig. 6B). Den Ergp55 struktur vært svært stabil under hele simulerings tid, noe som bekreftes av alle indikatorene som vanligvis brukes til å analysere MD simulering.
De 93% rester av Egp55 modell ligge i mest favorisert regionen Ramachandran plott og en Prosa Z- score på -4,87. DISOPRED [33] analyse på Ergp55 modell indikerte at N-terminal (1-118 rester) og C-terminal (397-479 rester) er i stor grad uordnede (unntatt N-terminal 4-23 rester) og gjenværende Ergp55 struktur (119-396 rester) ble bestilt (fig. 6C). Den strukturerte PNT domene inneholder tertiære arrangement av fire a-helikser, karakteristisk for stor gruppe av SAM domene [34]. ETS domene består av fire a-helikser og fourβ-ark, en karakteristikk av Ets familie proteiner. I N-terminal domene, spådde 15 rester strekning å danne α-heliks og tre rester lang helix (219-221 rester) er observert i in CAE /CD domene Ergp55. De strekninger av rester i C-terminale domene av Ergp55 forutsagt å ha bare tilfeldig spiral struktur.
N-terminale og C-terminale domene av Ergp55 er plassert vekk fra Ets domene. DNA-bindings spor av Ets domene er utsatt for oppløsningsmiddel og fritt til å binde promoter DNA-sekvenser. Den CAE /CD domenet er plassert mellom PNT og Ets domene for å regulere aktiviteten til Ergp55. De N- terminale og C-terminale områder i Ergp55 er plassert i et område som ikke hindrer DNA-bindende aktivitet av Ets domene og spille en rolle i transkripsjonen aktivering og lokalisering av Ergp55.
Diskusjoner
i denne studien har vi uttrykt full lengde og mindre polypeptider av Ergp55 i
E. coli
. Kombinasjoner av to kromatografiske trinn (Ni-NTA affinitet og størrelseseksklusjonskromatografi) har gitt mer enn 95% rene Ergp55 polypeptider basert på massespektrometri og SDS-PAGE-analyse. Før strukturelle studier, ble aktiviteten til rensede Ergp55 polypeptider sjekket ved å binde studier med DNA-sekvenser av E74 og økonomisjefer arrangører. Den overflate-plasmonresonans teknikk som ble brukt for binding analyse. Resultatene indikerte at Ergp55 polypeptider produsert i
E. coli
var i god konformasjon og binde spesifikt DNA-sekvenser av E74 og økonomisjefer arrangører med forskjellige slektskap.
DNA-bindende autoinhibition av Ergp55.
Ved E74 promotorsekvens, etter
K
D
verdier ble observert for Ergp55 polypeptider (i) Erg
307-399, 65 nM (ii) Erg
112-399, 115 nM (iii) Erg
1-399, 217 nM og (iv) full lengde Erg
1-479, 704 nM. Sammenligning av (i) og (ii) viste at N-terminale område (PNT + CAE /CD-domener) forut for å Ets domene inhibere E74 DNA-bindende domene til Ets. Sammenligning av (ii) og (iii) viste tegn på øket DNA-binding hemming ved å ha NTD domene i Erg
1-399 polypeptid. Sammenligning av (iii) og (iv) viser at tilsetning av CTD domene i Erg
1-399 polypeptid viste forbedret inhibering i DNA-bindende domene til Ets. Disse resultatene indikerer at E74 DNA-binding til Ergp55 er negativt påvirket av CAE /CD, PNT og ntd domener lokalisert ved N-terminal og CTD-domene lokalisert C-terminale område i Ergp55.
Med CFOer promoter DNA-sekvens, som følge
K
D
verdier ble oppnådd for Ergp55 polypeptider (i) Erg
307-399, 0,4 mikrometer (ii) Erg
112-399, 37 mikrometer (iii) Erg
1-399, 196 mikrometer og (iv) full lengde Erg
1-479, 232 mikrometer. Disse resultatene indikerer at CFOer promotersekvens bindes med forskjellig affinitet til Ergp55 polypeptider enn E74-promotersekvensen, men mekanismen for DNA-binding hemming var tilsvarende som observert i tilfellet med E74 promoter DNA-sekvens.
A samvirkende virkende DNA-inhiberende region ( 468-510 rester) ble identifisert ved C-terminal av Ets-en transkripsjonsfaktor [34]. Ved ERM og PEA3 transkripsjonsfaktorer, to hovedområder som ligger ved N- og C-terminal med hensyn til deres ETS- domene inhibere DNA-bindende affinitet [35] – [38]. Ett domene tilsvarer rester 280-360 rester av ERM transkripsjonsfaktor, som er involvert i hemming av ERM DNA bindingskapasitet. Disse domenene er rike på prolinrester generelt blottet a-heliske strukturer. Mekanismen ved hvilken to domener samvirkende inhibere ERMen DNA-bindende er annerledes enn observert i tilfelle av Ets-en transkripsjonsfaktor. Den DNA-bindende aktivitet av Ets domene er avhengig av autoinhibitory Modul [39]. Bindingen affinitet Ets domene Ergp55 til E74 og økonomisjefer promoter DNA var konsekvent til observasjon oppnådd ved ovennevnte transkripsjonsfaktorer.
Rundskriv dichorism analyse av Ergp55 polypeptider.
Den sirkulære dichorism teknikk benyttes til å identifisere de sekundære og tertiære strukturer av Ergp55 polypeptider. Den fulle lengde og mindre Ergp55 polypeptider som inneholder høye α-heliks og tilfeldig spiral strukturer. CD data anslår at 35% α-heliks og 49% vilkårlig viklingskonstruksjonene i full lengde Ergp55 protein. Undersøkelser av termisk stabilitet og temperatureffekten på full lengde Ergp55 protein indikerte at proteinet gjennomgikk en endring av sekundærstruktur etter oppvarming. Den sekundære strukturen er gjenvunnet etter avkjøling av proteinet fra 80 ° C til 20 ° C. Kort endring i temperatur er usannsynlig å ha noen effekt på sekundære strukturen Ergp55 protein.
Modellering og dynamikk simulering av full lengde Ergp55.
molekylær modellering og dynamikk simulering analyse indikerte at full lengde Ergp55 får en fleksibel og meget langstrakt struktur. Bare PNT og Ets domener er strukturert i protein og lange fleksible regionene er observert ved N- og C- endestasjonen Ergp55. Strukturen av PNT domene av Ergp55 består av fire-heliksbunt Sam liknende struktur (34). ETS domenet av Ergp55 er strukturert på en bevinget helix-turn-helix med ordningen α
1β
1β
2α
2α
3β
3β
4α
4 [40] – [41]. De sentrale CAE /CD-domener inneholde en liten helix i posisjon 220. Den sekundære og uordnede prediksjon analyse på Ergp55 støttet også funn observert i modellering og dynamikk simuleringsstudier av Ergp55. Alle disse observasjonene støttet fleksible, ikke-globularity og svært langstrakt struktur av Ergp55 protein.
I konklusjonen har vi preget det rekombinante full lengde og mindre polypeptider Ergp55 produsert i
E. coli
. De Ergp55 polypeptidene ble renset på mer enn 95% renhet som bestemt ved massespektrometri og SDS-PAGE-analyse. De strukturelle data som presenteres her viste bevis for fleksibel og svært langstrakt struktur av full lengde Ergp55 protein. Bindingen analyse ved hjelp av DNA-sekvenser av E74 og økonomisjefer arrangører indikere at lengre fragmenter av Ergp55 (utover den kanoniske Ets domene) viste tegn på autoinhibition.
Takk
Forfatterne takker Sita R. Meena og Pratibha for sine forslag i nåværende prosjekt. Vi erkjenner hjelp av avansert instrumentering forskning anlegget (AIRF) og sentral instrumentering anlegget (CIF) av Jawaharlal Nehru University for å tillate oss å gjennomføre CD eksperiment. Forfatterne takker SPR utstyr innretningen av AIIMS, Delhi for å tillate oss å gjennomføre DNA-bindende eksperimenter.
