Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv sykdom med dystre prognose. Det er av avgjørende betydning for å forstå de underliggende årsaksmekanismer og identifisere roman, logisk og lett-å-bruke prognostiske faktorer for presisjon terapi. TUSC3 (tumor suppressor kandidat 3) ble identifisert som en potensiell tumorsuppressorgen og tidligere studie viste TUSC3 er redusert i bukspyttkjertelkreft på mRNA-nivå, men det er antatt tumor suppressor funksjon gjenstår å bli bekreftet. I denne studien ble TUSC3 ekspresjon funnet å være undertrykket både mRNA og proteinnivåene i cellelinje modeller såvel som i kliniske prøver; redusert TUSC3 uttrykk var assosiert med høyere patologisk TNM staging og dårligere utfall. I tre par cellelinjer med forskjellig NF-kB aktivitet, ble TUSC3 ekspresjon funnet å være omvendt korrelert med NF-kB aktivitet. TUSC3-silenced bukspyttkjertelkreft cellelinje viste økt potensial for spredning, migrasjon og invasjon. I en orthotopic implantert mus modell, TUSC3 forstummet celler utstilt mer aggressiv fenotype med mer levermetastaser. I konklusjonen, denne studien viser at redusert immunologisk TUSC3 farging er en faktor prognostisk av dårlig overlevelse i bukspyttkjertelen kreftpasienter og redusert TUSC3 fremmer kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon, invasjon og metastasering. Det motsatte sammenheng mellom NF-kB aktivitet og TUSC3 uttrykk kan foreslå en ny forskrift mønster for dette molekylet
Citation. Fan X, Zhang X, Shen J, Zhao H, Yu X, Chen Y, et al. (2016) Redusert TUSC3 Fremmer kreft i bukspyttkjertelen spredning, Invasion og metastasering. PLoS ONE 11 (2): e0149028. doi: 10,1371 /journal.pone.0149028
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 1 august 2015; Godkjent: 26 januar 2016; Publisert: 12 februar 2016
Copyright: © 2016 Fan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Shanghai Municipal 415 Commission of Health and Family Planning (Grant No.201440345 til Xiaoqiang Fan) [https://www.wsjsw.gov.cn/WSJ /]. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv sykdom med dystre prognose. Det er den niende vanligste kreftformen i verden, men en fjerdeplass av kreftrelaterte dødsfall [1], med ca 227 000 mennesker dør av denne sykdommen hvert år [2]. Kirurgisk reseksjon er fortsatt det eneste alternativet for kur. Ikke desto mindre er fleste pasientene oppdaget på senere tidspunkt i mangel av spesifikke symptomer, å miste muligheten for kurativ reseksjon. Selv de som gjennomgår reseksjon med kurativ intensjon vil vanligvis tilbakefall innen to år [3]. Konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og nye molekylære målet narkotika har beskjedne effekter på sykdomsforløpet [4-6], og bare litt bedre sykdomsfri overlevelse i en adjuvant behandling innstillingen [3, 7]. Lagdeling av pasienter i henhold til gjentakelse risiko vil bidra til å maksimere tilpassing av intervensjon og forbedre terapeutisk effekt med minimale bivirkninger. I de senere år er blitt etablert mange patologiske forhold for å forutsi prognose inkludert tumorstørrelse, grad av tumor, vaskulær invasjon, lymfeknutemetastase og invasjon perinevral [8]. Systemisk inflammatorisk indeks- og sirkulerende tumormarkører som CA199 ble også undersøkt for deres prognostisk verdi [9-12]. Det er også noen molekylære markører som er kjent for å være prediktive for behandling effekt og langsiktig utfall som Kras [13], EGFR, og Her2 /neu et al [14]. Men de er fortsatt utilstrekkelig for pasienter rådgivning og individuell terapi. Det er av avgjørende betydning for å forstå mekanismene som bidrar til utviklingen av sykdommen og identifisere roman, logisk og lett-å-bruke prognostiske faktorer for presisjon terapi.
TUSC3 (tumor suppressor kandidat 3), var identifisert som et potensielt tumorsuppressorgen tidligere. Det ligger på kromosom bandet 8p22, som ofte slettet i flere krefttyper, inkludert prostata [15] og bukspyttkjertelkreft [16-18]. Derfor er TUSC3 ment å være et tumorsuppressorgen. Det er en homolog av gjær Ost3p subenhet av oligosaccharyltransferase (OST) -kompleks, et integrert membranprotein-kompleks som katalyserer N-bundet glykosylering av proteiner i det endoplasmatiske retikulum (ER) [19, 20]. Senere, TUSC3 ble også funnet å være involvert i Magnesium transport og oksidoreduktase aktivitet [21]. Som N-glykosylering er en allestedsnærværende posttranslational modifisering av eukaryote proteiner ved å modulere proteinfolding, beskytte dem fra degradering, og regulerer deres funksjon samt deres immunogenisitet, nedsatt TUSC3 er ment å være innblandet i kreft patogenesen via glykosylering [22]. Krainer og hans kolleger testet TUSC3 uttrykk i 143 prostatapasienter ved hjelp av en vev microarray, og fant at 13,3% av vevsprøver demonstrerte tydelig redusert protein uttrykk for TUSC3, men oppfølging av kohorten ikke klarte å vise TUSC3 innflytelse på progresjonsfri eller generelle overlevelse [23]. I eggstokkene, ble TUSC3 også funnet å være signifikant nedregulert i høyere grad eggstokkreft prøver [24]. Videre studier viste sin lave uttrykk resultater fra TUSC3 promoter hypermethylation og metylering status for TUSC3 arrangøren har en betydelig og uavhengig innflytelse på progresjon og total overlevelse for eggstokkreft pasienter [25]. Så tidlig som i 2005, ble homozygot og heterozygot sletting av TUSC3 gen oppdaget i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og prøver med genomisk arraybaserte studier [16]. Ikke desto mindre forblir dens antatte tumor suppressor funksjonen som skal kjennetegnes i denne sykdommen. Det som gjenstår også å bli avklart er om dens uttrykk er forbundet med clinicopathological iscenesettelse, og om det bærer en prognostisk verdi for denne kreftformen enhet.
Vårt mål er å undersøke om TUSC3 uttrykket er assosiert med kreft i bukspyttkjertelen clinicopathological funksjoner og representerer en prognostisk faktor for denne kreftsykdommer og ytterligere å karakterisere funksjonen av molekylet i patogenesen av sykdommen ved hjelp av cellelinje-modeller og en musemodell
Materialer Metoder
Pasienter Prøver
parafininnstøpte prøver fra 117 pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (PC) som gjennomgikk kirurgisk reseksjon mellom januar 2002 og desember 2012 at vårt sykehus ble hentet. Prøver fra 69 menn og 48 kvinner med en gjennomsnittsalder på 60,2 år (range, 42 til 71 år, med en median alder, 61 år) ble funnet. Median oppfølgingstid på 19 måneder (fra 1 til 69 måneder.) Studien dannet de etiske retningslinjene i 1975 Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av komiteen for etikk Jimin Hospital, Shanghai, Kina. Alle pasienter inngått en skriftlig informert samtykke fra denne studien.
Immunohistochemistry
5 um tykke vevssnitt ble deparaffinized ved oppvarming til 60 ° C og deretter rehydrert i xylen og gradert alkoholer. Antigen gjenfinning ble utført med DEPP-9 epitop henting løsning, etterfulgt av behandling med 0,3% H
2o
2 i PBS (pH 7,4) for å stanse endogen peroksidaseaktivitet. Etter blokkering med 10% sekundært antistoff vertens serum i 10 minutter, ble seksjonene inkubert i primært antistoff (kanin polyklonalt til TUSC3, fortynning 1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK) i 1 time ved romtemperatur. Primære antistoff fortynninger ble gjort i 10% sekundært antistoff vertens serum. Seksjonene, etter 2 x PBS-vaskinger ble inkubert i respektive biotinylerte sekundære antistoffer [biotinylert anti-kanin-IgG (BA-10000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA], fortynnet 1: 200 i 10% serum i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 45 minutters inkubasjon i StreptABComplex /HRP (K0377 Dako, Glostrup, Danmark). Seksjonene ble igjen vasket to ganger med PBS og inkubert i Dako flytende DAB + Substrat-kromogen System (K3468) inntil utvikling av brun farge. Dette ble etterfulgt av kontra med Meyers hematoxylin, dehydrering og montering ved hjelp Histokit medium.
Hver side var farget i seriesnitt og undersøkt av 2 patologer. Intensiteten av fargingen ble bedømt som følger: 0, negativ; 1+, svak flekker; 2+, moderat farging; 3+ sterk farging. For semikvantitativ analyse, ble H-stillingen [26] anvendt i denne studien. I korthet, ble mer enn 500 tumorceller regnet i hvert tilfelle, og den H-stillingen ble deretter generert ved tilsetning av verdiene av prosentandelene av sterk farging multiplisert med 3 pluss prosent av moderat farging multiplisert med 2 pluss prosent av svak farging multiplisert med en. , noe som gir en mulig spekter av 0-300. H-stillingen mer enn 100 ble notert som høy ekspresjon. Vi har også undersøkt TUSC3 uttrykk i lymfeknute (LN) metastaser i 24 tilfeller og sammenlignet TUSC3 uttrykk forskjeller mellom primær lesjon og lymfeknutemetastase. Ki 67 ble bedømt på samme måte som prosentandel, dvs. merking indeks, uavhengig av farging intensitet.
cellekulturbetingelser
femten humane PC-cellelinjer og en udødeliggjort ikke-tumorigen pankreas epitelcellelinje ( HPNE) ble valgt for dette studiet. Alle cellelinjer ble oppnådd som gaver fra Dr Paul J. Chiao laboratorium i MD Anderson, Texas University. ASPC-en, ASPC-1 mu [27], MDA pan28, MDA p28 mu [28], BxPC-3, Colo357, L3.6pl, MIAPaCa-2, PANC-en, PTAC43, PTAC50, PTAC53, PTAC66, og CAPAN -1 Cellene ble dyrket som et monolag cellekultur i DMEM inneholdende 4,5 mg /ml D-glukose og L-glutamin tilsatt 10% føtalt bovint serum. HPNE celler ble dyrket i medium D med en blanding av M3 medium og DMEM inneholdende ett volum av M3 Base F kulturmedium (Incell Corp., San Antonio, USA), tre volumer av glukose-fri DMEM, 10% FBS, 5,5 mM glucose , 10 ng /ml EGF og 50 mg /ml gentamycin. Den 293T cellelinje ble dyrket i fullstendig DMEM. HPNE /Kras /p16shRNA og HPDE /Kras /HER2 /p16shRNA /smad4shRNA var bukspyttkjertelkreft cellelinjer (en gave fra Dr Paul J. Chiao laboratorium, The University of Texas MD Anderson Cancer Center) ved transfeksjon av relevant plasmid inn HPNE og HPDE celle henholdsvis [29]. HPDE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium.
celleproliferasjon og klonogene Assay
For cellevekstkurve assay-celler ble sådd ut i 24-brønners plater (1 × 10
4 celler /brønn) i tre eksemplarer i vekstmedium. Cellene ble tellet på dag 1, 3 og 5. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien fra tre uavhengige eksperimenter. For å teste clonogenecity av TUSC3 stilnet PC-celler, trypanblått-utelukkelse testet levedyktige TUSC3 knockdown-cellelinjer og krafse kontrollcellene ble utplatet (100 /brønn) i et seks-brønns plate og deretter inkubert i 10-12 dager ved 37 ° C i en 5% CO
2/5% O
2/90% N
2 inkubator. Koloniene ble farget med 2% krystallfiolett. En representativ felt for hvert eksperiment ble fotografert ved 100 x forstørrelse. Minst tre uavhengige analysene ble utført i triplikat. Data ble vist som middelverdien av antall kolonier /per felt ± standardfeil av middelverdien fra tre uavhengige eksperimenter.
real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved å bruke TRIzol henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). RNA kvalitet og kvantitet ble målt ved et ND-2000 spektrofotometer (Nanodrop). cDNA ble syntetisert ved bruk av PrimeScript RT Master Mix (Bio-Rad). cDNA (20 ng) ble utsatt for real-time PCR utført med SYBR reagenser som bruker IQ5 PCR system (Bio-Rad, Hercules, CA). β-aktin ble benyttet som intern kontroll-genet. Spesifikke primere ble syntetisert ved Sigma-Aldrich og sekvensene som ble beskrevet som følger: hTUSC3: forover primer: 1275-AGACGGATAATTTGCCTAGTGGG-1297, revers primer: 1417-AGTGCCATGGTCCAAATCACA-1397. Plottet sammenligner den relative ekspresjon av mRNA-nivå i flere pankreatiske tumorcellelinjer sammenlignet med den ikke-tumorigen immortalisert pankreas epithelial cell HPNE. Hvert eksperiment ble utført tre ganger, og hver gang med tre gjentak.
Lentiviral transduksjon
knockdown av TUSC3 i bukspyttkjertelkreft cellelinje Colo357 ble utført ved lentiviral levering med Plko.1 vektor som inneholder TUSC3 shRNA ( SKU: SR305331, OriGene Technologies, CO USA), og HEK293T emballasje cellelinje.. Transduserte celler ble valgt og holdt i medium som inneholdt puromycin (3ug /ml).
Matrigel assay
50.000 celler ble sådd i tre paralleller til en 24-brønns plate med modifiserte Boyden kammere (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Det nedre kammer inneholdt 10% FCS /kulturmedium som kjemotiltrekkende. Cellene ble inkubert i 18 timer, farget med krystallfiolett og telles under et mikroskop.
Immunoblotting
Celler ble lysert med RIPA buffer supplert med komplett proteasehemmer Cocktail Tabletter (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland ) og PhosSTOP fosfatase inhibitor Cocktail tabletter (Roche Diagnostics). Etter inkubering i 10 minutter på is, ble cellelysater ble klarert ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analysen absorbans (Sigma Aldrich). Like mengder protein lysates (40μg) ble separert med SDS-PAGE, blottet på PVDF membraner (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK), inkuberes med riktig primære antistoff og pepperrot (HRP) konjugert sekundære antistoffer og oppdaget med forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Pierce ECL Western Blotting Underlag, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Følgende antistoffer og fortynninger ble brukt: p-aktin (1: 500, sc-1616, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), TUSC3 (1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK).
dyr og ortotopiske Implantasjon av bukspyttkjerteltumorceller
Balb /C nakne mus ble kjøpt fra Animal Production Area of National Cancer Institute Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Musene ble holdt under spesifikke patogen-frie forhold i anlegg som er godkjent av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health and Human Services, og National Institutes Helse. Musene ble anvendt i samsvar med institusjonens retningslinjer når de var 8 til 12 uker gamle.
For å fremstille pankreatiske tumorer, TUSC3 stilnet PC-celler ble høstet fra subsammenflytende kulturer ved en kort eksponering til 0,25% trypsin og 0,02% EDTA . Trypsinering ble stanset med medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, og cellene ble vasket en gang i serumfritt medium og resuspendert i Hanks «balanserte saltløsning (HBSS). Bare suspensjoner som består av enkeltceller med mer enn 90% levedyktighet ble anvendt for injeksjonene. En million celler suspendert i 50 ul HBSS ble injisert i bukspyttkjertelen fra nakne mus som beskrevet tidligere. Musene ble drept etter 5 uker injeksjon og obdusert. Størrelsen og vekten av levermetastaser ble registrert.
Statistisk analyse
Alle statistiske beregninger ble utført ved hjelp av grafen Prism 5.0-programvaren (San Diego, California, USA). Cox regresjon ble utført med SPSS versjon 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Sammenligning av midler i normalfordelte data ble utført ved anvendelse av Students «t-test ellers den parametriske Mann-Whitney U-test ble påført eller som angitt. P-verdier på lik eller mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle søylediagrammer er avbildet ved hjelp av gjennomsnitt og standardavvik som feilfelt, med mindre annet er oppgitt.
Resultater
TUSC3 uttrykk i kliniske prøver
immunohistochemically, er TUSC3 fraværende i bukspyttkjertelen stroma celler, men nesten alle pankreasgang epitelceller, akinærceller og holmer viste immunoreaktivitets (fig 1A og 1C). Vi evaluerte korrelasjonen mellom ekspresjonsdata og kliniske parametere, inkludert pasientens alder, kjønn, tumor størrelse, plassering, karakter, primær tumor klassifikasjon (PT), lymfeknutemetastase (PN), fjern metastase (pM). TUSC3 ekspresjon ble observert i varierende grad i bukspyttkjertelen carcinomceller i cytoplasma (fig 1B og 1C). TUSC3 ble påvist i 38/117 (32,48%) pT eksemplarer med H-scorer 83,42 ± 2,882, i 14/58 (24,14%) pN eksemplarer med H-scorer 66,81 ± 4,265, og i 4/11 (36.36%) pM eksemplarer med H-scorer 79,55 ± 7,818. Uttrykket av TUSC3 er dramatisk redusert i metastatisk LNS sammenlignet med de sammenkoblede primærtumorprøver (H-score: p 0,001). (Fig 1D)
(A) TUSC3 uttrykk i ikke-neoplastiske bukspyttkjertelen vev (acinar , kanal og holmer). (B) TUSC3 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler. (C) Lav TUSC3 uttrykk i bukspyttkjertelen kreftceller sammenlignet med holmer. (D) Sammenligning av TUSC3 farging i primær PC og LN metastase (paret t-test, p 0,001, n = 58). Original forstørrelse × 200.
Redusert TUSC3 uttrykket er assosiert med høyere patologisk TNM staging og dårlig prognose
Totalt 69 mannlige og 48 kvinnelige pasienter med PC ble inkludert i denne studien kohort. Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 64,6 ± 10,3 år. Median overlevelse var 19 måneder (spredning: 3-78 måneder). Svulsten scenen er definert som T
1N
0M
0 i 8 pasienter (6,84%), T
2 N
0M
0 i 20 pasienter (17,09%), T
3N
0M
0 i 24 pasienter (20,51%), T
1N
1 mill
0 i ni pasienter (7,69%), T
2 N
1 mill
0 i 18 pasienter (15,38%), T
3N
1 mill
0 i 21 pasienter (17,95%), T
4 N
0M
0 i to pasienter (1,71 %), T
4N
1 mill
0 i fire pasienter (3,42%), T
2-3N
0M
1 i fem pasienter (4,27%) og T
1-4N
1M
1 i seks pasienter (5,13%). 101 pasienter fikk kjemoterapi, inkludert 75 pasienter som fikk adjuvant kjemoterapi, og 26 pasienter som fikk palliativ kjemoterapi. For 11 pasienter med levermetastaser oppdaget under drift, ble alle synlige metastatiske lesjoner fjernet.
Forholdet mellom TUSC3 uttrykk nivå og clinicopathological karakteristikker av pasienter med PC er vist i Tabell 1. Lav TUSC3 uttrykk var assosiert med større tumorstørrelse (p = 0,039), høyere serum CA199 nivå (p = 0,034), mer lymfatisk gjennomtrengning (p = 0,031), og høyere Ki-67 merking indeks (p 0,001)
å. undersøke om TUSC3 protein uttrykk nivå og andre clinicopathological faktorer er assosiert med klinisk utfall av PC pasienter, univariate og multivariate Cox proporsjonale hazard modeller for CSS (Cancer Spesifikk Survival) og RFS (Gjentakelse overlevelse) ble beregnet. Blant de 117 pasientene, skjedde død i 62 av 79 (78,5%) pasienter med lav TUSC3 protein nivå og i 22 av 38 (57,9%) pasienter med høyt TUSC3 protein uttrykk nivå (P 0,021). 2A viser Kaplan-Meier kurver for CSS og avslører at lav TUSC3 nivå er en faktor prediktiv av dårlig prognose i PC-pasienter (p = 0,0416, log-rank test). Blant de 117 pasientene, skjedde tilbakefall i 69 av 79 (87,3%) pasienter med lav TUSC3 protein nivå og i 24 av 38 (63,2%) pasienter med høyt TUSC3 protein uttrykk nivå (p 0,0001). Fig 2B viser Kaplan-Meier kurver for RFS og avslører at lav TUSC3 nivå er en faktor prediktiv for høyere risiko for tilbakefall hos PC pasienter (p = 0,0043, log-rank test).
Immunhistokjemisk farging av TUSC3 er assosiert med total overlevelse (A) og tilbakefall overlevelse (B) etter kurativ reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen
Univariat analyse identifisert høy tumor stadium (stadium i + II vs III vs IV P 0,001)., høy serum CA199 nivå (CA199 300IU /ml vs CA199≥00IU /ml, p = 0,034), ingen administrasjon av kjemoterapi (cellegift vs ingen behandling, p = 0,025), og redusert TUSC3 uttrykk nivå (p = 0,015) som dårlig prognostisk faktorer for RFS i denne studien kohort. Og disse faktorene er også prediktive for dårlig total overlevelse i denne kohorten. Kjønn, alder ved diagnose og tumor grad ble ikke signifikant assosiert med klinisk utfall (tabell 2).
For å bestemme uavhengig prognostisk verdi av TUSC3 for CSS og RFS, en multivariat analyse ved hjelp av en Cox proporsjonal hazard modellen ble utført. I multivariat analyse som inkluderte alder, tumor klasse, tumor stadium, administrasjon av kjemoterapi, serum CA199 nivå og TUSC3 uttrykk nivå, vi identifisert tumor stadium, administrasjon av kjemoterapi, og lav TUSC3 protein uttrykk nivå som uavhengige prognostiske faktorer for CSS og RFS ( TUSC3 uttrykk for RFS, p = 0,020; TUSC3 uttrykk for CSS, p = 0,027, Tabell 2)
TUSC3 uttrykk er redusert i bukspyttkjertelkreft cellelinjer mediert av NF-kB
for å karakterisere.
in vitro
funksjon av TUSC3, vi først undersøkte TUSC3 uttrykk for ulike bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Real-time PCR avslørt TUSC3 ble redusert på mRNA nivå i alle de testede 11 bukspyttkjerteltumorcellelinjer (figur 3A). Western blotting viste at det var også trykket på proteinnivå i disse cellelinjer (figur 3B).
TUSC3 er redusert i bukspyttkjertelcancercellelinjer både på mRNA-nivå (A) og proteinnivå (B).
for å undersøke om TUSC3 uttrykk er korrelert med NF-kB aktivitet, undersøkte vi TUSC3 uttrykk både på RNA-nivå og proteinnivå i tre par bukspyttkjertelkreft cellelinjer med ulik NF-kB aktivitet. ASPC-1 mu er en datter-celle fremstilt av Paul J. Chiao et al ved å transfektere IκBαM (S32,36A) inn i foreldrebukspyttkjertelkreft cellelinje ASPC-1, noe som resulterer i en tumorcellelinje med redusert NF-kB aktivitet og nedsatt lever metastasepotensialet [27]. I dette paret av cellemodell, ble det vist at TUSC3 ekspresjon av ASPC-1 mu er høyere enn den for ASPC-1 (figur 4A), noe som tyder på at TUSC3 er regulert av NF-kB aktivitet. Det samme uttrykksmønster er funnet i et annet par av cellelinjer, MDA P28 og MDA p28 mu (figur 4B). MDA p28 mu er datter cellelinje også produsert i Dr. Paul J. Chiao laboratorium ved trans IκBαM (S32, 36A) Iκ mu inn MDA p28 cellelinje, noe som resulterer dempes NF-kB aktivitet og undertrykte levermetastaser (data ikke publisert). TUSC3 uttrykk er forbedret i MDA p28 mu sammenlignet med MDA p28. L3.6pl er datter cellelinje med mye mer potensial av levermetastaser fra påfølgende injeksjoner av foreldre Colo357 i nakne mus. Det ble påvist tidligere at L3.6pl oppviser høyere NF-kB aktivitet enn Colo357 [30]. Og interessant, er TUSC3 uttrykk høyere i Colo357 enn i L3.6pl både mRNA og proteinnivå (fig 4C). Alle disse tre par cellelinjer syntes å vise det samme mønsteret av TUSC3 uttrykk i relevans til NF-kB aktivitet som innebærer at TUSC3 er negativt korrelert med NF-kB aktivitet.
(A) ASPC-en og ASPC -1 mu med deprimert NF-kB aktivitet. (B) MDA p28 og MDA p28 mu med deprimert NF-kB aktivitet. (C) Colo357 og datter L3.6pl cellelinje med forbedret NF-kB aktivitet. For hver figur, representerer venstre graf RT-PCR resultat, representerer høyre graf Western blot for TUSC3.
Redusert TUSC3 fremmer celle spredning, migrasjon og invasjon
For å studere svulst undertrykkende funksjon av TUSC3 ble shRNAs designet for å knockdown uttrykk for TUSC3 i
in vitro
bukspyttkjertelkreft modell. Som en foreldrecellelinje fra et høyt metastatisk datter-celle med tilsvarende NF-kB aktivitet, ble valgt for Colo357 det følgende eksperiment. Både mRNA og proteinnivåer ble detektert for å bekrefte effektiviteten av stanse (figur 5A og 5B). Vi undersøkte effekten av TUSC3 stanse på celleformering, kolonidannelsen, migrering og invasjon betingelser. Spesielt Etter 72 timers dyrking, de TUSC3 forstummet cellene fått en betydelig overlevelse fordel i motsetning til kontroller (figur 5C og 5D). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011). Flere og større kolonier dannet for TUSC3 forstummet tumorceller (Fig 5E og 5F). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). Deretter ble Matrigel basert test som benyttes for å analysere virkningene av TUSC3 knockdown om migrasjon og ekstracellulære matriks (ECM) invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Med 10% FCS som tiltrekkende, TUSC3 forstummet celler vises økt migrasjon og invasivitet gjennom innsatsen membranen i motsetning til kontrollcellene (fig 5G, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001 Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001, fig 5H og 5I, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001)). En sårheling assay videre støttet disse resultatene, som viser økt migrasjon og derav følgende forbedret lukning av epitel monolag av celler i lave serum betingelser (5% FCS) etter 18 timer (fig 5J).
(A, B ) TUSC3 er effektivt slått ned i Colo357 cellelinjer fremkommer av (A) RT-PCR og (B) Western blot. (C, D) Proliferation er forbedret med TUSC3 knockdown, celle nummer teller er signifikant forskjellig på 72 timer (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011) (D). (E, F) Colony Dannelse er forbedret med TSUC3 knockdown (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (G) Migration Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (H, I) Invasion Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (J) sårtilheling test viste raskere lukking av gapet i TUSC3 forstummet celler. Alle forsøkene ble utført tre ganger med representative tall vist som ovenfor.
Redusert TUSC3 fremmer levermetastaser i orthotopic implantert mus modell
For ytterligere å undersøke effekten av TUSC3 på PC metastase, vi injisert TUSC3 forstummet kreftceller orthotopically i bukspyttkjertelen i hårløse mus og etablerte dyremodeller. Fem uker etter injeksjon av Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3 celler, alle av musene ble syke, og ble avlivet. Fra bildene kan vi tilsynelatende se levermetastaser fra TUSC3 forstummet svulst er større enn kontrollgruppen en (figur 6A). Da levermetastaser ble veid og sammenlignet med t-tekst, Colo357 shRNA2 vs Colo357 Scramble (p = 0,0444), Colo357 shRNA3 vs Colo357 Scramble (p = 0,0443). Til sammen TUSC3 forstummet celler utstilt mer aggressiv fenotype med mer metastaser vises i lever etter musene ble ofret. Vi utførte IHC samt RT-PCR for å sammenligne TUSC3 nivå mellom primærbrennpunktene og metastatiske lesjoner fra ortotopiske injisert modellprøver. Sammenlignet med prøver fra mus injisert med TUSC3 krafse cellelinjer, de fra TUSC3 shRNA2 og TUSC3 shRNA3 viser redusert uttrykk nivåer av TUSC3 både med IHC (S1 figur) og på mRNA nivå (S2 figur).
(A) brutto~~POS=TRUNC utseendet på resected leverprøver fra mus injisert med to grupper av TUSC3 forstummet PC (Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3) og kontroll (Colo357 Scramble). Store levermetastaser er synlige i gruppe Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3. (B) levermetastaser ble veid og sammenlignet ved hjelp av t-test.
Diskusjoner
Den aktuelle studien viser at TUSC3 uttrykk er redusert i bukspyttkjertelkreft primære prøver og dens nedregule er prognostisk av dårlig langtids utfall.
In vitro
cellelinje studie og
in vivo
dyremodell gir direkte bevis som tyder på sin rolle tumor suppressor funksjon i bukspyttkjertelkreft initiering og progresjon. Videre avslører undersøkelsen TUSC3 uttrykket er redusert med forbedret NF-kB aktivitet, en indikasjon på en roman reguleringsmodellen for dette molekylet.
Selv om det har blitt rapportert TUSC3 mRNA er redusert i bukspyttkjertelkreft prøver sammenlignet med nabo ikke -cancerous vev, og tilbakevendende tap av 8p22, som inneholder TUSC3 genet er funnet i bukspyttkjertelkreft [17, 18], har ingen tidligere studie noensinne oppdaget TUSC3 uttrykk på proteinnivå i sykdommen. Dette er i virkeligheten helt nødvendig gitt at proteinet er faktisk utøver av genet og genetisk informasjon. I denne studien har vi ikke bare oppdaget TUSC3 mRNA ved hjelp av cellelinjer, men også oppdaget sitt uttrykk på proteinnivå med immunhistokjemi i kliniske prøver og western blotting i cellelinjer. Resultatene er konsistente og bekreftet at TUSC3 er dramatisk deprimert i kreft i bukspyttkjertelen, både i grunnskolen prøver og i tumorcellelinjer, både på mRNA-nivå og proteinnivå. Mer interessant, TUSC3 hadde omvendt korrelasjon med NF-kB aktivitet i det minste i en del pankreatiske tumorcellelinjer, og er i konsistens med de forskjellige grader av malignitet. IκBαM-transfektert ASPC-en mu og MDA p28 mu er mindre ondartet med svekket NF-kB aktivitet, og deres TUSC3 uttrykk økes. Det er bemerkelsesverdig at denne negative forhold er også funnet i et annet par av cellelinjer, for hvilke datter-cellelinjen ble kjøpt via påfølgende injeksjoner opphavelige cellelinje inn i nakne mus i stedet for ved transfeksjon manipulering. Alle disse resultatene tyder på TUSC3 ekspresjon kan bli regulert av NF-kB aktivitet, i det minste i visse tumorcellelinjer. Tidligere har TUSC3 nedregule blitt demonstrert på grunn av homozygot og heterozygot delesjon i prostatakreft, arrangøren hypermethylation i eggstokkreft [25]. Selv om det er ofte funnet å bli slettet i bukspyttkjertelkreft [16-18], tyder våre resultater en roman transkripsjonsregulering for dette molekylet i denne kreft enhet. Det er mulig at TUSC3 nedregule mekanismer variere i henhold til forskjellige tumortyper. For eksempel, tidlig studie viste TUSC3 ikke hypermethylated i kolorektal karsinom [31], men hypermethylation er den viktigste mekanisme for TUSC3 nedregulering in ovarian cancer og selv bærer en prognostisk verdi [25]. Det er også mulig at TUSC3 ekspresjon kan reguleres ved forskjellige midler, selv i den samme tumortype, avhengig av ulike pasienter eller cellelinjer. Det utelukker ikke andre mulige mekanismen for regulering, slik som mikro-RNA-mediert stanse.
