Abstract
Bakgrunn
Klokke gener kjøre ca 5-15% av genom-wide mRNA uttrykk, og forstyrrelse av biologiske klokke kan deregulere cellens normale biologiske funksjoner. Cryptochrome 1 er en viktig regulator av circadian tilbakekoplingssløyfen, og spiller en viktig rolle i organismer. Denne studien ble gjennomført for å undersøke uttrykket av Cry1 og dens prognostisk betydning i tykk- og endetarmskreft (CRC). I tillegg ble funksjon av Cry1 i human CRC undersøkt i cellekulturmodeller.
Måter
Sanntids kvantitativ PCR, Western blot-analyse og immunhistokjemi ble benyttet for å utforske Cry1 ekspresjon i CRC celle linjer og primær CRC kliniske prøver. MTT og kolonidannelse analyser ble anvendt for å bestemme effekter på cellulær proliferasjon evne. Den dyremodell ble brukt til å utforske Cry1 innvirkning på svulsten celleformering evne
in vivo
. Transwell analyser ble utført for å påvise migrering evne til cellelinjer. Statistiske analyser ble brukt for å evaluere den diagnostiske verdi og sammenslutninger av Cry1 uttrykk med kliniske parametre.
Resultater
Cry1 uttrykk ble opp regulert i de fleste av CRC cellelinjer og 168 primær CRC klinisk eksemplarer på proteinnivået. Klinisk patologisk analyse viste at Cry1 uttrykk var signifikant korrelert med lymfeknutemetastase (
p
= 0,004) og TNM stadium (
p
= 0,003). Høy Cry1 uttrykk var assosiert med dårlig total overlevelse i CRC pasienter (
p
= 0,010). Eksperimentelt, fant vi at oppregulering av Cry1 fremmet spredning og migrasjon av HCT116-celler, mens nedregulering av Cry1 hemmet kolonien dannelse og migrasjon av SW480 celler.
Konklusjoner
Disse resultatene tyder på at Cry1 spiller sannsynligvis viktige roller i CRC utvikling og progresjon andCry1 kan være en prognostisk biomarkør og et lovende terapeutisk mål for CRC
Citation. Yu H, Meng X, Wu J, Pan C, Ying X, Zhou Y, et al. (2013) Cryptochrome en Overuttrykte korrelerer med tumorprogresjon og dårlig prognose hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10,1371 /journal.pone.0061679
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 10 januar 2013; Godkjent: 13 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program, No. 2011CB504805, nr 2010CB52994), fra National Natural Science Foundation of China (30973448) og Guangdong rekrutteringsprogram for Creative Research Group. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
døgnrytme er daglige svingninger i ulike biologiske prosesser. I de senere år, har regulering av døgnrytmen bli bedre forstått. Den molekylære mekanismen for circadian svingninger i suprachiasmatic kjerner (SCN) og perifere celler er basert på tilbakemeldinger ledd av åtte kjerne circadian gener [1], [2]:
perioden1 (Per1)
,
perioden2 (Per2)
,
perioden3 (Per3)
,
Klokke
,
Bmal1
,
Kasein kinase jeg ε (CKIε)
,
Cryptochrome1 (Cry1) og Cryptochrome2 (Cry2)
. Blant de åtte gener, de Crys akkumuleres i cytoplasma og deretter gå inn i kjernen, fremme dannelsen av stabile Per /Cry /CK1ε komplekser. En gang i kjernen, de Crys bryte hverandre Bmal1 /klokke-forbundet transkripsjonen kompleks, noe som resulterer i hemming av Cry og Per transkripsjon og derepresjon av Bmal1 transkripsjon. Den molekylære klokke av de perifere vev koordinerer transkripsjon av de cirkadianske gener. Circadian gener er i stor grad vev spesifikke og knytte viktige vev funksjoner for å circadian miljøet, slik at disse viktige funksjoner skal være tilgjengelig på bestemte tider når de trengs mest [3], [4], [5].
Hos pattedyr er ca 5-15% av genom-wide mRNA uttrykk drevet av circadian gener, inkludert viktige cellesyklus regulatorer (for eksempel
cyclin D1
), onkogener og tumor dempere, for eksempel
c -myc Hotell og
WEE-en product: (en slags kinase som blokkerer celledeling) [6]. Forstyrrelse av den biologiske klokke kan deregulere normale cellulære biologiske funksjoner og ha betydelige effekter på menneskers helse, forårsaker tilstander som søvnforstyrrelser, mage og hjerte sykdommer og depresjoner. Den biologiske klokke er også forbundet med en økt forekomst av flere epiteliale cancere [7], [8], [9], [10], [11], [12]. I musemodeller, transplanterte svulster vokser dobbelt så raskt i SCN skadede mus som i humbug-skadede dyr [13]. Disse funnene tyder på at en nær forbindelse mellom circadian organisasjon og utvikling av ulike kreftformer. Forholdet mellom circadian gener og kreft er påvist i de siste årene. Verten biologiske klokke er blitt rapportert å spille en viktig rolle i den endogene kontroll av tumorprogresjon [14] .Cry1, ett medlem av Cryptochrome-familien, har vist seg å være avgjørende for den negative arm av circadian tilbakekoblingssløyfen [15] [16].
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de tre viktigste årsakene til kreft-relaterte dødelighet over hele verden [17]. CRC pasienter ofte utvikler lymfeknutemetastaser i de tidlige stadier av sykdommen. I løpet av de avanserte stadier, de fleste av pasientene utvikler også lever, lunge og peritoneum metastaser. De som er involvert i CRC metastaser faktorer er i stor grad ukjent; imidlertid er feilregulering av molekylære prosesser anses for å resultere i vekst og metastasering av CRC. Derfor har betydningen av markører som fremmer utviklingen av CRC blitt vektlagt, ettersom de kan gi terapeutiske mål [18], [19].
Men studier som vurderer forholda Cry1 uttrykk til clinicopathological funksjoner og resultater i kolorektal kreft ikke er rapportert. Vi har derfor evaluert uttrykket nivåer av Cry1 i menneskelige kolorektal kreft vev og matchet ikke-tumor slimhinner og analysert den kliniske betydningen av Cry1 uttrykk inCRC pasienter. Våre data viser at Cry1 uttrykk er betydelig korrelert med TNM stadium og lymfeknute status. Dermed kan Cry1 tjene som en ny diagnose markør og terapeutisk mål for CRC terapi.
Materialer og metoder
Pasienter og oppfølgings
Ett hundre og sekstiåtte kolorektal kreftpasienter i alle TNM etapper på Cancer Center of Sun Yat-sun universitetet mellom september 1999 og desember 2005 ble inkludert i studien. Ti sammenkoblede vev fra de 168 prøvene ble brukt for en q-PCR-analyse.
Studiet ble godkjent av etikkomiteen av Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center Institutional styret, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle av pasientene.
Kliniske data, inkludert alder, kjønn, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, preoperativ carcinoembryonic antigen (CEA) nivåer og karbohydrat antigen 19-9 (CA199) nivåer, ble hentet fra ubehandlet kasuistikker.
patologiske parametere, for eksempel svulst invasiv dybde, differensiering klasse og histologiske mønster ble hentet fra patologiske rapporter og sjekket av patologer. Pasientene ble fulgt opp hver tredje måned for de to første årene, en gang hvert halvår under den tredje og fjerde år, og en gang i året etter det femte året etter operasjonen.
Alle pasientene ble kontaktet via telefon for å sjekk på deres helsetilstand; den siste oppfølgingsdato var 1. mars 2012. sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) ganger ble beregnet fra driften dato til metastaser eller residiv dato eller dato for død, eller den siste sensurere tid.
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
humane CRC-cellelinjer SW480, SW620, HCT116, HT29, den humane embryonale nyrecellelinje GP293 og normal colon epitel cellelinje FHC ble oppnådd fra American Type Culture Collection . De THC8307 celler ble hentet fra vårt eget laboratorium samling. CRC-cellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). De FHC-celler ble dyrket i DMEM: F12 medium inneholdende 0,005 mg /ml insulin, 10 ng /ml koleratoksin, 100 ng /ml hydrokortison og 0,005 mg /ml transferrin og supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 ng /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin. Alle cellelinjer ble dyrket i et fuktet kammer med 5% CO
2 og ved 37 ° C.
kvantitativ revers transkriptase-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol Reagens ® (DSBIO, Guangzhou, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert fra 2 ug av total-RNA ved bruk av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI). cDNA ble amplifisert ved AmpliTaq® Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems, Foster, CA) og genspesifikke primere. De følgende primere ble anvendt for Cry1, 5′- GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 «(fremover), 5′-GGTTGTCCACCATTGAGT-3» (revers). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll.
Western Blot analyse
Totale celleproteiner ble ekstrahert og separert på SDS-PAGE-geler og Western blot-analyse ble utført i henhold til standardprosedyrer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting på den samme membranen. De primære antistoffene som ble brukt omfattet monoklonalt anti-Cry1 (1:1000, Abcam, USA) og anti-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteinene ble visualisert ved hjelp av ECL prosedyre (Amersham Biosciences, USA).
Cell transfeksjon
Den kodende sekvens av Cry1 ble forsterket og klonet inn i
NotI Hotell og
BamHI
stedet pcDNA3.1
+ for å generere en pcDNA3.1
+ – Cry1 uttrykke vektoren; den resulterende konstruksjon ble bekreftet ved sekvensering. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) og kontroll siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) ble kjøpt fra Shanghai Genepharma Co Ltd (Shanghai, Kina).
For transient transfeksjon, SW480 celler (6 × 10
5 celler per brønn) og HCT116-celler (5 x 10
5 celler per brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater ved 60% konfluens og transfektert med 100 nM av oligonukleotider eller 4 ug av plasmidet, ved hjelp av Lipofectamine 2000 ((Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. etter 6 timers inkubering ved 37 ° C, ble transfeksjon mediet erstattet med 3 ml komplett medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble samlet opp for Western blot, spredning og invasjons assays til forskjellige tider.
Retrovirus pakking og transduksjon
Cry1 og controlsequences ble klonet inn i
Xho
jeg og
Cla
jeg stedet av pLNCX2 Retrovirus vektoren. Virus pakking ble utført i GP293 celler. GP293 celler ble dyrket i DMEM med 10% FBS i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble supernatanten samlet opp ved sentrifugering ved 1000 g i 10 min. De HCT116 cellene ble transdusert med retrovirus som inneholder Cry1 eller kontrollsekvenser plasmider. Førtiåtte timer etter infeksjon, ble G418 (600 ug /ml) tilsatt til mediet i 2 uker for å velge de stabile celler infisert med retroviruset. Western blotting analyser ble anvendt for å detektere ekspresjon av Cry1 i to stabile cellelinjer som beskrevet ovenfor
Celleviabilitet assay
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl). – 2, 5-bifenyl tetrazolium-bromid (MTT) assay ble anvendt for å påvise celleformering. HCT116-celler ble sådd ut i 96-brønn på en 10 x
3 celler /brønn. Den spektrofotometriske absorbans av hver prøve ble målt ved 490 nm. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, og de gjennomsnittlige resultater ble beregnet.
I kolonidannelsesbestemmelsen, HCT116-celler (4 x 10
3-celler per 10 cm
2 plate) overuttrykke Cry1or kontroll GFP og SW480-celler (5 x 10
3-celler per 10 cm
to plate) nedregulert for ekspresjon av Cry1 ved siRNA eller en negativ kontroll ble sådd ut i komplett medium. Cellene ble dyrket i 14 dager ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet luft. Kolonidannelse og vekst ble visualisert ved krystallfiolett farging. Antallet kolonier som inneholder 50 celler ble bestemt, og 12 felt ble talt
In vitro
migrasjon analysen
migrasjon evnen til cellene ble målt i Transwell kamre. (8 mikrometer pore, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Den nederste kammeret ble fylt med 700 ul DMEM inneholdende 10% FBS. For overføringen analysen, tumorceller (1 x 10
5-celler i et totalvolum på 200 pl) ble plassert i det øvre kammer og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet luft. Etter 24 timer kultivert, ikke-migrerende celler på den øvre overflaten av membranen ble fjernet, og cellene som migrerte til undersiden av polykarbonatmembran ble fiksert med etanol og farget med krystallfiolett i 10 min. Antallet migrerende celler ble deretter bestemt fra 5 uavhengige mikroskopiske felt. Gjennomsnittet av tredoble analyser for hver eksperimentell tilstand ble brukt for analyse.
Immunhistokjemisk analyse
uttrykk for Cry1 i primærsvulster og tilstøtende noncancerous tykktarmsslimhinnen ble undersøkt ved hjelp av en immunhistokjemisk analyse. Immunhistokjemisk analyse ble utført i løpet av fem dager i § forberedelse. Parafinsnitt ble skåret til en tykkelse på 4 um og er montert på silaniserte lysbilder. Seksjonene ble deretter avvokses, rehydrert og blokkert med 0,3% hydrogenperoksyd. Tissue antigener ble hentet med et mikrobølgeovnen innstilt på 95 ° C i 25 minutter og avkjølt til værelsestemperatur i 10 mmol /natriumsitrat-buffer (pH 6,0). Hver skive ble deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og inkubert over natten ved 4 ° C med Cry1 (1:400, klon ab54649, Abcam, Cambridge, UK). Primære antistoffer ble fortynnet med bakgrunn redusere komponenter (S2022, Dako, Glostrup, Danmark). Den sekundære antistoff ble ansatt i Envision Detection Kit (Dako). Platene ble farget i 2 minutter med diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) og deretter motfarget med hematoksylin. Vev behandlet med antistoff-fortynning løsning ble anvendt som en negativ kontroll. Alle kontroller gitt tilfredsstillende resultater.
Evaluering av flekker
Prøvene ble evaluert av to etterforskere, som ikke var klar over det kliniske resultatet og som uavhengig vurdert de fargede lysbilder. Hver side ble vurdert under mikroskopi ved × 200 forstørrelse. Uttrykket av Cry1 ble evaluert ved bruk av H-score. Til H-skårer besto av en vurdering av intensiteten av fargingen og prosentandelen av fargingen område med en gitt intensitet. Bare farget ondartede celler ble vurdert. Prøvene ble gruppert i følgende fire kategorier basert på intensiteten av nukleær farging: ingen (0), svak (1), middels (2) og sterk (3). Den indeksert sum ble oppnådd ved å multiplisere intensiteten karakteren med prosentandelen av flekker området.
Cry1 uttrykk nivået ble dikotomisert i henhold til DFS og OS ved en ROC kurve. Cut-off verdien av positiv rate var maksimert summen av sensitivitet og spesifisitet poeng.
In vivo
proliferasjonsanalyser
Kvinne atymiske Babl /c naken mus ( 4-5 uker gamle) ble kjøpt fra Medical Animal senter Guangdong-provinsen (Guangdong, Kina). Alle dyrestudier ble gjennomført inaccordance med NIH dyre useguidelines og dagens kinesiske forskrifter og standardson bruk av forsøksdyr. For å bestemme kapasiteten proliferasjon av celle linesstably høy som uttrykker Cry1
in vivo
, totalt 1 x 10
6-celler ble injisert subkutant inn i venstre på nakne mus og den negative kontrollgruppe ble injisert i høyre (n = 9). Tumorvolumet ble evaluert ved hjelp av følgende formel:. Tumorvolume = 4π /3 x (bredde /2)
2 x (lengde /2) .Four uker etter injeksjon, ble dyrene avlivet
Statistisk analyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, med mindre annet er angitt. En paret
t
test ble brukt til å teste for forskjeller i Cry1 uttrykk mellom matchet svulst og godartet slimhinner. Den statistiske betydningen av
in vitro
studier ble analysert ved hjelp av Student
t
-test. Kaplan-Meier og log-rank tester av likestilling av de overlevende ble brukt til å vise overlevelseskurver av høy versus lav Cry1 IHC score (som definert av ROC kurve). Alle
p
verdiene var tosidig, og
P
0,05 var nivået for statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS programvarepakke, versjon 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Kjennetegn på pasienter og svulster
En total 168 pasienter som fikk radikal reseksjon mellom januar 1999 og desember 2005 ble studert. Karakteristikken av alle pasientene er oppsummert i tabell 1. Den midlere pasientens alder var 54,6 år (SD-, 14.3). Median oppfølging varighet var 84 måneder (range, 4-146). Åttifem svulster (50,6%) ble plassert i tykktarmen. Ti av de 168 svulster (6,0%) var T1 eller T2. Ninety-fire svulster var TNM stadium I-II (56.0.0%). Median antall høstet lymfeknuter var 19 (intervall 0-48). Cry1 protein ekspresjonsnivåer ble anvendt for immunhistokjemisk analyse. Cry1 var farget hovedsakelig i cytoplasma og atom regioner av cellene. Høy Cry1 protein-ekspresjon ble påvist i 101 prøver (60,1%) og svak eller negativ farging ble observert i 67 tumorprøver (39,9%, figur 1).
Representative immunhistokjemiske bilder av kolorektal kreft vevsprøver indikerer negativ eller svakt påvisbar Cry1 farging (A og B); moderat Cry1 farging (C); og sterk Cry1 farging (D) er vist. Forstørrelse er × 200 (A, B, C og D).
Cry1 er overuttrykt i kolorektal kreft vev
Cry1 mRNA uttrykk ved kolorektalkreft ble undersøkt ved hjelp av RT- PCR; analyser av Cry1 mRNA ble henrettet på ti matchet par av kolorektal kreft prøver og tilstøtende prøver noncancerous vev. Cry1 mRNA ble uttrykt på et høyere nivå i åtte av kolorektal kreft vevsprøver enn i tilstøtende noncancerous vev. Den differensielle høy ekspresjon varierte fra 1,1 ganger til 13,1 ganger (figur 2D). I samsvar med disse dataene, ble Cry1 protein også opp regulert i kolorektal kreft sammenlignet med matchede vevsprøver kontroll (Figur 2A-C).
(A) En representant bilde av Cry1 flekker i kolorektal kreft vev vises. (B) En representant bilde av Cry1 flekker i tilstøtende noncancerous vev er vist. (C) Cry1 protein uttrykk nivået var høyere i tumorvev i forhold til tilstøtende kontroll vev som oppdaget av immunblotting (gjennomsnitt ± SEM, n = 109, * **,
P
0,001). (D) Gjennomsnittlig T /N-forhold på Cry1 mRNA-ekspresjon i sammenkoblet kolorektal kreft (T) og normalmucosa vev (N) ble kvantifisert ved qPCR og normalisert til GAPDH. Feilstolpene representerer standardavviket av den midlere (SD) beregnet ut fra tre parallelle forsøk. Forstørrelse er × 200.
Sammenhengen mellom Cry1 uttrykk og clinicopathological variabler
Foreningen for Cry1 uttrykk og clinicopathological variabler ble ytterligere analysert. Cry1 ekspresjon og alle de andre parametere ble clinicopathological dikotomisert i to grupper. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Det var en signifikant sammenheng mellom Cry1 uttrykk og både TNM stadium (
p
= 0,003) og lymfeknutestatus (
p
= 0,004).
Blant de 168 pasienter med kolorektal kreft, ble ingen signifikant korrelasjon finnes mellom Cry1 uttrykk og kjønn, alder, plassering av primære masse, tumorstørrelse, tumor differensiering klasse, histologisk type Preoperativ CA199 eller CEA nivå (
p
. 0,05)
Sammenhengen mellom Cry1 uttrykk og overlevelse
Bruk av Cry1 uttrykk som en prognostisk markør for CRC pasienter ble også undersøkt. På slutten av oppfølgingsperioden (01.03.2012), hadde 32 pasienter døde av kolorektal kreft-relaterte sykdommer. De fem års overlevelse av DFS var 74,7% for Cry1 høy uttrykk gruppe. Denne prisen var betydelig lavere enn overlevelsen (89,1%) for den lave utfoldelse gruppe (
p
= 0,011). Tilsvarende fem års overlevelse av OS var 77,6% i Cry1 high-uttrykk gruppen og 92,3% i lav-uttrykk gruppe (
p
= 0,010) (tabell 2 og figur 3).
Kaplan-Meier-kurver med univariat analyse (log-rank) for pasienter med kolorektal kreft med høy Cry1 uttrykk (n = 101) versus lav eller ingen Cry1 uttrykk for total overlevelse (n = 67) (A) og sykdomsfri overlevelse (n = 67) (B) er vist. Høyere uttrykk for Cry1 positivt korrelert med de fattige patientoutcomes.
Cry1 er sterkt uttrykt i de fleste av CRC cellelinjer
For å undersøke potensielle rolle Cry1 i tumorigenesis av tykktarmskreft, ble uttrykket av Cry1 mRNA og protein bestemmes i fem CRC cellelinjer (SW480, HT29, SW620, THC8307 og HCT116) og en normal kolon epitel cellelinje, FHC. Cry1 mRNA uttrykk var høyst 10 ganger høyere i kolorektal kreft cellelinjer enn i FHC celler (figur 4A). Cry1 protein ble sterkt uttrykt i kolorektal kreft cellelinjer og bare svakt uttrykt i FHC celler (figur 4B).
Uttrykk for Cry1 mRNA og protein i kolorektal kreft cellelinjer (SW480, SW620, HT29, THC8307, og HCT116) og FHC ble undersøkt ved qPCR (A) og Western blotting (B). Expression nivåer ble normalisert til GAPDH. Feilfelt representerer standardavviket for gjennomsnittet (SD) beregnet ut fra tre parallelle forsøk, *,
P
0,05
Cry1 fremmer tumorvekst og spredning
Deretter undersøkte vi effekten av Cry1 manipulering (ved forsterkning-av-funksjon og tap-av-funksjon) på proliferasjonen av kreftceller.
eksogent overuttrykt Cry1 i HCT116-celler, som har en lavere endogen uttrykk. Virkningen av Cry1 på celleproliferasjon ble deretter evaluert ved hjelp av MTT og klonogene analyser. Resultatene viste at overekspresjon av Cry1 kan fremme cellulær proliferasjon i momentane transfeksjon HCT116-celler (
p
0,001, figur 5B.). I motsetning til dette viste kontrollgruppen ingen signifikant effekt på cellulær proliferasjon. De kolonidannelse analysene viste også at overekspresjon av Cry1 betydelig økt antall kolonier dannet etter 14 dager med kultur sammenlignet med kontrollcellene (
p
= 0,033, fig. 5C, D). Koblingen mellom Cry1 og tykktarmskreft cellevekst ble videre etablert ved hjelp av kolonidannelse analyser etter Cry1 knockdown. Som vist i figur 5E og 5F, knockdown av endogen Cry1 ekspresjon av siRNA resulterte i en dramatisk inhibering av klon dannelsen av SW480-celler (
p
= 0,007)
(A) Cry1 proteinnivåer var oppregulert i HCT116 cellene og nedregulert i SW480 celler. (B) MTT-analyser for HCT116-celler 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med Cry1 eller GFP kontroll (***, p 0,001). (C-D) kolonidannelse analyse av HCT116-celler transfektert med Cry1 eller GFP kontroll (*,
p
= 0,033). (E-F) Hemming av SW480 cellekolonidannelse kapasiteten med Cry1 siRNA i forhold til kontroll (**,
p
= 0,007). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger, og representative data er presentert;
barer
, SD *,
P
. 0,05; **
P
0,01, ***,
p
. 0,001
Cry1 fremmer themigration av kolorektal kreft celler
Som for Cry1 ekspresjon var forbundet med lymfeknute status, ble effekten av Cry1 på migrering av kolorektal kreft celler undersøkt ved hjelp av transwell analyse for å undersøke effekten av Cry1 overekspresjon eller delesjon. I transwell analysene, ble HCT116-celler transfektert med Cry1 eller GFP kontroll plasmider podet inn i kamrene, og deres migrasjon potensial ble bestemt 24 timer etter transfeksjon. Analysene viste at spredningsevne av HCT116-celler som overuttrykker Cry1 ble øket med 112% sammenlignet med kontrollceller (
p
= 0,019, fig. 6A).
(A) for overføring av analyser HCT116-celler transfektert med Cry1 eller GFP kontroll. (N = 3, *,
p
= 0,019) (B) Migrasjons analyser av SW480 celler transfektert med Cry1-siRNA eller negativ kontroll. (N = 3, ***,
p
0,001). Representative bilder er vist ovenfor, og gjennomsnittlig antall celler per felt på de angitte tidspunkter er vist nedenfor. Dataene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Bekreftelse på at Cry1 fremmet migrasjon av kolorektal kreft celler ble vurdert av transfeksjon av SW480 celler med Cry1-siRNA eller negativ siRNA. Etter 24 timer med kultur, ble migrasjon kapasiteten på knock-down Cry1 SW480 celler redusert med 52,4% sammenlignet med kontrollceller (
p
. 0,001, figur 6B).
Cry1 fremmet CRC vekst
in vivo
for ytterligere å undersøke onkogene egenskaper Cry1
in vivo
, bygget vi et retrovirus vektor overexpressingCry1 og etablert to stabile cellelinjer, som var heter ctrl-HCT116 og Cry1-HCT116 (fig. 7A). Disse to cellelinjer ble injectedsubcutaneously inn flankene av nakne mus. Tumorprogresjon ble undersøkt over tid. Ved 4 uker etter implantering ble musene avlivet og tumorene ble fjernet. Som shownin Fig. 7B-C, volumet og vekten av tumorene som følge av injeksjon av Cry1-HCT116-celler var betydelig større og tyngre enn de som stammer fra ctrl-HCT116-celler. Takentogether, disse observasjonene er konsistente med
in vitro
resultater og indikerer at Cry1 har muligheten til å fremme barnekonvensjonen cellevekst
in vivo
.
(A) Uttrykket av Cry1 ble markert økt i stallen cellelinje Cry1-HCT116 sammenlignet med kontroll stabil cellelinje ctrl-HCT116. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (B) Representative bilder av svulster som stammer fra Cry1-HCT116 eller ctrl-HCT116, etter subkutan xenograft transplantasjoner i hårløse mus (C) Overuttrykte Cry1 fremmet kolorektal kreft vekst. Tumorceller ble injisert subkutant i nakne mus. Mus ble avlivet etter 4 uker, og volumet av hver tumor ble målt hver 4. dag. Barer, ± SEM; *
P
0,05, **
p
= 0.01
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette den første studien som. evaluere protein uttrykk nivåer av Cry1 i human kolorektal kreft. Åpenbart Cry1 ekspresjon var høyere hos kreft vev og celler enn det som i normale vev og celler. Vi har også studert forholdet mellom uttrykket nivåer av Cry1 til pasientens utfall og clinicopathological funksjoner. Våre resultater tyder på at overekspresjon av Cry1 genet kan være et nyttig prediktor for lymfeknutemetastaser, TNM stadium og dårlige resultater hos pasienter med tykktarmskreft.
Flere tidligere studier har sammenlignet uttrykket nivåer av Cry1 mellom kreft vev og tilstøtende normal slimhinne. En studie fant at Cry1 og andre biologiske genet (Cry2, Per2 og BamlI) mRNA uttrykk nivåer var lik i tykktarmskreft og tilstøtende normal slimhinne [20]. En annen studie fant at mRNA uttrykk nivåer av Cry2 og Per2 ble nedregulert i tykk- og endetarmskreft. Denne studien fant også høyere Cry1 uttrykk i svulsten slimhinnen av kreft lokalisert i distale kolorektal segmenter. Cry1mRNA nivåer i CRC-vev ble også signifikant assosiert med pasientens alder og kjønn [21]. I human epitelial eggstokkreft, Cry1 mRNA uttrykk nivået var klart høyere i kreftvevet enn i normalt vev [22]. Våre funn er i delvis uenig i disse studiene. I vår studie, Cry1 genet protein expression nivåene var høyere i kreftvevet enn i tilstøtende noncancerous vev. De samme resultatene ble funnet i kolorektale tumorceller og normale celler, og overekspresjon av Cry1 ble funnet å fremme vekst og vandring i kolorektale svulstceller. Men ingen signifikant korrelasjon ble funnet mellom Cry1 uttrykk og kjønn, alder, plassering av primære masse, tumorstørrelse, tumor differensiering klasse, histologisk type preoperativ CA199 eller CEA nivå (
p
0,05). Disse resultatene synes å være rimelig for følgende grunn. Cry1 protein uttrykk nivåer kan være i strid forbundet med mRNA uttrykk nivåer for disse miljøfaktorer. Men proteiner spiller den viktigste rollen i de biologiske virkningene, og vi oppdager protein uttrykk for Cry1 i CRC vev.
Vi har også undersøkt forholdet av Cry1 uttrykk med clinicopathological funksjoner og pasientutfall. De Cry1 proteinnivåer var signifikant assosiert med AJCC /TNM trinn (med de høyeste nivåer påvist i TNM trinn III-IV) og lymfeknute engasjement (med høyest nivå detektert i tilfelle av positive lymfeknuter). Cirkadianske gener har vært implisert i cellesyklusregulering [23]. Cry1 mutante mus har et forhøyet nivå av Wee1 i mange vev, inklusive lever. Wee1 kinase blokker celledeling ved å inhibere G2-M overgang. Høy Cry1 uttrykk kan hemme evnen til Wee1 å fremme celleproliferasjon, og tilveiebringer derved en overlevelsesfordel for CRC [24] .Moreover blir Cry1 protein som er kjent for å kompleks med adenylyl cyclase, og overekspresjon av Cry1 reduserer cAMP-produksjon som reaksjon på PGE2, isoproterenol, og selv direkte adenylylcyklase aktivator, forskolin [25]. Studier har rapportert at høye konsentrasjoner av cAMP kan hemme migrering og metastasering av humane prostatacancerceller. PKA er en proteinkinase som er relatert til den cAMP signalveien. Studier har antydet at PKA hemmer aktiviteten og funksjon av RhoA [26], [27]. RhoA er et nøkkelmedlem av Rho familie av små GTP-bindende proteiner og formidler aliserte relatert til cytoskeletal ordning, migrering, proliferasjon og genekspresjon [28], [29], [30]. Tidligere studier har funnet at invasiv vekst og metastase ble undertrykt i en rekke kreftceller (inkludert CRC-celler) når RhoA aktivitet ble inhibert [26], [31]. De nåværende funn tyder på at en Cry1-cAMP /PKA-RhoA mediert veien er involvert i migrasjon og metastasering av CRC.
Våre farging data er enig med disse studiene. Høyere TNM stadium og tilstedeværelsen av lymfeknutemetastase ble signifikant korrelert med høyere nivåer av Cry1 ekspresjon, noe som tyder på at Cry1 kan brukes som en markør for å bestemme utviklingen av CRC.
