Abstract
For kreft medikamentell behandling, er det avgjørende å drepe de cellene med høyest karsinogent potensial, selv når de utgjør en relativt liten del av den samlet tumor cellepopulasjon. Vi har brukt den etablerte NCI /DTP-60-cellelinjen veksthemmende analyse som en plattform for å kunne se på sammenhengen mellom kjemisk struktur og veksthemming i både tumorigen og ikke-tumorigene cancercellelinjer. Ved hjelp av eksperimentelle målinger av «ta sats» i ektopiske implantater som en proxy for tumorigent potensiale, identifiserte vi åtte kjemiske midler som synes å sterkt og selektivt hemme veksten av de mest tumorigene cellelinjer. Biokjemiske analysen data og struktur-aktivitetsforhold indikerer at disse forbindelsene virker ved å hemme tubulinpolymerisering. Likevel, er deres aktivitet mot tumorigen cellelinjer mer selektiv enn den til de andre mikrotubul-inhibitorer i klinisk bruk. Biokjemiske forskjeller i tubulin subenheter som danner mikrotubuler, eller forskjeller i funksjonen av mikrotubuler i den mitotiske spindelenheten eller celledeling kan være forbundet med selektiviteten av disse forbindelser
relasjon:. Abdullah NM, Rosania GR, Shedden K (2009) Selektiv målretting av Svulstkreftcelle Grener microtubule hemmere. PLoS ONE 4 (2): e4470. doi: 10,1371 /journal.pone.0004470
Redaktør: Winston Hide, University of the Western Cape, Sør-Afrika
mottatt: 08.08.2008; Godkjent: 28 november 2008; Publisert: 13. februar 2009
Copyright: © 2009 Abdullah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. USA National Institutes of Health gi P20HG003890. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
aggressivitet ulike typer kreftceller avledet fra menneskelige pasienter kan vurderes i forhold til deres tumorigent potensiale i mus xenograft modeller. For eksempel har karsinogent potensial i mus xenotransplantater nylig blitt benyttet for å definere kreft «stamceller», som antas å tilsvare en undergruppe av maligne celler som driver dannelse og vekst av svulsten [1]. Følgelig er det blitt postulert at noen kreftformer er sammensatt av en heterogen samling av celler, bare et fåtall av disse er i stand til å danne nye tumorer [2]. Disse cellene kan anrikes fra heterogene tumorcellepopulasjoner på grunnlag av deres ekspresjon av celleoverflatemarkører. I brystsvulster, for eksempel celler som ko-uttrykker høye nivåer av CD44 og epitel spesifikt antigen (ESA), og lave nivåer av CD24 er de tumorcellene å initiere [2]. Likeledes, i tykktarm og hjernekreft, subpopulasjoner av celler som uttrykker høye nivåer av CD133 (PROML1) initiere tumorene [3], [4]. Viktigst ved transplantasjon inn i immunkompromitterte mus, tumorceller initiere fullt ut kan rekonstituere en svulst med heterogenitet som minner om den opprinnelige tumor [2] – [4]. Selv om konseptet med en kreft «stamcelle» er fortsatt kontroversielt, fra et terapeutisk synspunkt, cytostatika rettet mot tumorigene kreftceller kan være den mest effektive på å utrydde svulster.
medisiner og utvikling sektor av National Cancer Institute (NCI), den Therapeutics Program (DTP) Developmental, har benyttet et panel av 60 humane tumorcellelinjer utvunnet fra å screene det kjemoterapeutiske potensial på mer enn 75000 forbindelsene [5], [6]. Dette panelet av 60 cellelinjer som er kjent som «NCI60 cellelinjer». De cellelinjer som representerer forskjellige leukemier, melanomer og kreft i lunge, kolon, hjerne, eggstokk, bryst, prostata og nyre [5]. Bortsett fra deres anvendelse i legemiddelscreening, har karsinogent potensial av disse cellelinjene er målt ved xenotransplanting disse cellene inn i immunkompromitterte mus og evaluering av deres evne til å danne nye svulster [6]. Ulike cellelinjer i NCI60 panelet vise et utvalg av tumorigene potensialer ved transplantasjon i immunkompromitterte mus. Den tumorigent potensiale er registrert som hver cellelinje er «ta-rate.»
Som en hypotese, forskjeller i karsinogent potensial blant NCI kreftcellelinjer kan gjenspeile variasjoner i proliferativ aktivitet og tumor-initiering karakteristikker av den faktiske kreftceller etter hvert som de eksisterer i tumorer i kreftpasienter. Dermed kan NCI60 cellelinjer som viser høy take hastigheten være mer representativ for tumor initiere kreftceller funnet
in situ
. Her identifiserer vi forbindelser fra DTP-databasen som er mest aktive mot cellelinjer med høyest ta sats, og fortsett å etablere en antatt virkningsmekanisme for disse forbindelsene ved å utføre struktur-aktivitetsforhold studier, og sammenligne dem med vanlige legemidler mot kreft som virkningsmekanisme er kjent. I tillegg er forskjeller i karsinogent potensial og responsen til disse midler er vist å være relatert til forskjeller i genekspresjon mellom NCI60 cellelinjer med høy og lav tumorigene potensialer, så vel som til genekspresjon markører for tumorigene cancerceller.
Resultater
Identifikasjon av selektivt cytotoksiske forbindelser
Vekst hemmende aktivitet i DTP samling av kjemiske midler som representert ved -logGI50 kan sammenlignes med de fire kategoriene av take-hastighet ved hjelp av Pearson korrelasjonskoeffisienter. Ved bruk av denne tilnærmingen, ble ni forbindelser som har korrelasjonskoeffisient som er større enn 0,5 i størrelsesorden identifisert ut fra 34,909 forbindelsene som ble testet (figur 1). Alle ni korrelasjonskoeffisienter var positive, noe som indikerer at disse midler var mer aktive ved inhibering av cellevekst i de tumorigene cellelinjer (figur 2). Fordi det forventede antall av forbindelser av 34 909 som har en korrelasjonskoeffisient på over 0,5 i størrelse ved en tilfeldighet er 0,7 med en 95
persentil av to forbindelser, er det meget usannsynlig at to eller flere av disse ni forbindelser er falske positiver.
Ingen av de vanlige kreftlegemidler i DTP database overgå disse ni forbindelser i form av selektiv cytotoksisk aktivitet mot de tumorigene cellelinjer. Den største korrelasjonskoeffisient observert blant de vanlige anticancermidler er 0,47 for vinblastin, som er et antimitotisk middel. Faktisk, antimitotiske midler er de eneste mekanistiske klassen som viser konsekvent ikke-neglisjerbar positiv korrelasjon med take-hastighet. Til tross for deres positive korrelasjonskoeffisienter, ingen av de antimitotiske standard anticancermidler viser korrelasjon koeffisient som er større enn 0,5, noe som tyder på at de ni forbindelsene identifisert i vår korrelasjonsanalyse kan være entydig selektiv mot de tumorigene cellelinjer. Flere av disse ni forbindelsene utviser et bredt selektivitet vindu med forskjell i -logGI50 mellom tumorigen og ikke-tumorigene cellelinjer av to eller flere. Forbindelser 384634, 385177, 5468780, 361500 og 379512 er sammenlignbare med alle standard antimitotiske midler i forhold til deres cytotoksisitet; men er deres selektivitet vinduet mye bredere (figur 3)
Hemming av tubulinpolymerisering som mulig virkningsmekanisme
Forbindelsene identifisert peker på en stor struktur-aktivitetsforhold klasse.: fire av de forbindelsene som er identifisert dele en kjerne naftyridin struktur (se figur 1). Tre av disse forbindelsene (385177, 5468780, 5468781) er strukturelt beslektet, ved nærværet av en naphthelene gruppe i stilling R
2. Disse strukturene skiller seg fra hverandre kun basert på posisjoneringen av en eller to metyl- gruppe på A-ringen: forbindelser 385177 og 5468780 inneholder en metylgruppe i stillingene R
5 og R «sub> 2, henholdsvis, mens forbindelsen 5.468.781 inneholder to metylgrupper i posisjonene R
5 og R
2. Den annen forbindelse (384634) skiller seg fra de tre tidligere nevnte forbindelser fordi gruppen 3′-metoksy substituert benzenring erstatter den naftalen gruppen i stilling R
2. Denne forbindelse inneholder også en metylgruppe i posisjon R
5 på ring A. Nærværet av kjernestrukturen som er felles for alle forbindelsene i denne gruppen tyder på at den kan spille en rolle i hjørnevirkningsmekanismen for denne gruppen av forbindelser .
for å identifisere en mulig virkningsmekanisme, de ni forbindelsene ble gruppert sammen med de 168 vanlige legemidler mot kreft ved hjelp av de 881 viktigste CACTVS fingeravtrykk. Kutte dendrogram ved en Tanimoto koeffisient på 0,7, fem av de ni forbindelsene er gruppert med ni standard anticancermidler, inkludert forskjellige antitubulin midler slik som vinblastin og vincristin. Påfølgende analyse av den vitenskapelige litteraturen viser at mange av våre forbindelser gjør faktisk hemme polymerisering av tubulin
in vitro
. Forbindelse 384 634 er blitt syntetisert og har vist seg å demonstrere antitublin aktivitet i et tubulin polymerisasjon analyse [11]. Likeledes isosterer av sammensatte 385177, 5468780 og 5468781 potent hemmer tubulinpolymerisering [12]. Det er høyst sannsynlig at forbindelse 379512 er et antitubulin middel i tillegg, fordi en rekke forbindelser som inneholder den 2-fenyl-kinolon ringstruktur er blitt syntetisert og oppviser tubulin polymerisering [13] – [17]. Forbindelse 5388755 er nesten strukturelt identisk med Combretastatin A-4, som er en meget potent antitubulin middel [18].
LIKNE analyse [19] ble utført for ytterligere å karaktervirkningsmekanismen til forbindelsene. I SAMMENLIGN, er en korrelasjonskoeffisient på 0,6 generelt tatt for å indikere bevis for lignende virkningsmekanismer mellom de testede og referanseforbindelser. Jo høyere korrelasjonskoeffisienten, jo mer sannsynlig er det at forbindelsene har samme intracellulære mål-[9]. Korrelasjonskoeffisienten for sammenligningsberegningene for de åtte mest potente forbindelser og antimitotiske vanlige anticancermidler avslører flere forbindelser som viser en høy korrelasjon med mikrotubul-inhibitorer colchicin, maytansine, vinblastin og vinkristin (tabell 1). Ingen av disse forbindelser viser likhet med noen av de midler fra andre mekanistiske klasser som topoisomerase-inhibitorer, alkylerende midler og DNA /RNA-antimetabolitter (data ikke vist). Ingen av forbindelsene viser sterk korrelasjon med taxol, som er en antimitosemekanisme middel som virker ved å stabilisere mikrotubuli.
Antitubulin aktivitet paralleller selektiv cytotoksisitet
For å identifisere rollen antitubulin aktivitet ved generering selektiv cytotoksisitet, identifiserte vi tolv ytterligere DTP-forbindelser (figur 4) som er strukturelt beslektet med noen av forbindelsene ni vi identifisert i vår korrelasjonsanalyse men at mangel antitubulin aktivitet [11] – [15]. Hvis antitubulin aktivitet overfører selektiv cytotoksisitet, bør disse forbindelsene uten antitubulin aktivitet demonstrere ingen selektiv cytotoksisitet. Den scatterplot å sammenligne sammenhengen mellom cytotoksisitet og ta-prisen for disse tolv forbindelser tyder på at ingen av disse forbindelser viser selektiv cytotoksisitet (figur 5), og de er stort sett inaktive i celleveksthemmende analyse.
genekspresjonsanalyser
En rekke tidligere studier har identifisert CD44, CD24, og CD133 (PROML1) som å være markører for tumorigene potensielle eller stamcellelignende egenskaper, med CD44 og CD133 er relativt høyt uttrykt i tumorigen linjer, og CD24 blir uttrykt ved lave nivåer. Således, søkte vi for bestemte gener hvis ekspresjon kan være relatert til den selektive cytotoksiske aktivitet av forbindelsene identifisert. For dette formål ble transkripsjonen profilering data utvunnet for gener hvis ekspresjon på tvers av cellelinjer som korrelerer med karsinogent potensial. I dette datasettet, fant vi at take hastigheten er uavhengig av PROML1, CD44, og loggen forholdet CD44-CD24 i NCI60 cellelinjer. Vi har også analysert uttrykk for tjue eller så ulike tubulin isotypes (alfa, beta og gamma) og fant ingen sammenheng med take rate.
Selv om kandidaten tumorigenicity markørgener PROML1, CD44, og CD44-CD24 var ikke forbundet med take-rate, vi identifisere gener uttrykkes ved vesentlig høyere nivåer i de mer tumorigene cellelinjer. På U95A array plattform, en transkripsjonsfaktor (DBP), et integrin (ITGA6, to probe-sett), og en membran skjelettprotein (ADD3, to probe-sett) fulgt dette mønsteret av ekspresjon. Seks navngitte gener og to ikke navngitte gener uttrykkes ved vesentlig høyere nivåer i mindre tumorigent i forhold til de mer tumorigene cellelinjer på U95A array plattform: PTGIS, JAK1, MGC5560, XPC, NRG1, og SULF1. På U133A /B-plattformen TMEM18, ACACB, og GMCL1 ble positivt assosiert med karsinogent potensial, sammen med to unnanotated probesets (229930_at og 230312_at). Ingen negative assosiasjoner som oppfyller våre kriterier ble identifisert på U133A /B array plattform. Den funksjonelle betydningen av antatte stamcellemarkørgener i forhold til tumorigenicity eller økt følsomhet for mikrotubulidynamikk hemmere er ikke klart.
Diskusjoner
Etter Data Mining DTP arkivet, er vi i stand til å identifisere forbindelser som er fortrinnsvis toksiske mot de fleste tumorigen av NCI60 cellelinjer, basert på ta frekvensen av cellelinjene i en mus xenograft modell. Vi etablerte også at aktiviteten av disse forbindelser ikke var korrelert til ekspresjonen av celleoverflatemarkører stamcelle er rapportert i litteraturen. Likevel er karsinogent potensial det viktigste funksjonelle sammenhengen mellom de mest aggressive kreftceller og
in vitro
modell for narkotika screening. Derfor cytostatika identifisert basert på deres aktivitet mot de tumorigene cellelinjer kan betraktes som kandidat cytostatika som er spesielt rettet mot subpopulasjoner av kreftceller som driver veksten av svulster.
En av disse midlene ( 384 634) har vist seg å inhibere mikrotubuli-polymerisering. Likeledes isosterer av tre av våre agenter (385177, 5468780, 5468781) har også vist seg å hemme microtubule polymerisering, noe som tyder på en enkelt virkningsmekanisme. Interessant, Compound 5388755 er strukturelt relatert til den potente antitubulin agenten Combretastatin A-4. Det er også mulig at forbindelse 379512 virker ved inhibering av tubulin polymerisering, fordi flere forskjellige midler som inneholder kinolonet ringstrukturen har vist antitubulin aktivitet. SAMMENLIGN analyse bekrefter likhetene mellom cytostatika identifisert her og ulike mikrotubulidynamikk hemmere. Med unntak av forbindelse 319 428, alle våre forbindelser viser en sterk likhet med kolkisin, maytansine, vinblastin og vinkristin. Ingen av våre forbindelser viser signifikant sammenheng til taxol, som virker ved å stabilisere mikrotubuli.
Fra vår analyse, er sannsynlig å være ansvarlig for selektiv cytotoksisitet mot tumorigen cellelinjer antitubulin aktivitet. En utvalgt antall strukturelt beslektede forbindelser uten antitubulin aktivitet ble analysert for deres mønster av cytotoksisitet mot NCI60 cellelinjer. Ingen av disse forbindelsene demonstrerte selektiv cytotoksisitet. Faktisk er de fleste av disse forbindelser var inaktive. Sammen med deres antitubulin aktivitet, selektivitet av forbindelsene våre mot høyt tumorigene cellelinjer som tyder på at mikrotubuli av tumorigen og ikke-tumorigene cellelinjer kan være forskjellig. Interessant nok ble det ikke observert noen forskjell i tubulin genekspresjon nivå mellom høyt tumorigene og ikke-tumorigene cellelinjer. Det er sannsynlig at observerte selektiv cytotoksisitet er ikke på grunn av forskjellen i tubulin genekspresjon men snarere et resultat av forskjeller i posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs) [20]. Nylig har ulike eksperimentelle resultater støttet tanken om at tubulin PTMs føre til funksjonelle mangfold av mikrotubuli. Mange tubulin PTMs har blitt identifisert blant detrysosination, glutamylation, glycylation, acetylering fosforylering og palmitoylation [20] – [22]. Forskjeller i tubulin isotype uttrykk og PTMs har vært assosiert med celledifferensiering og utviklingsmessige overganger [23] – [25]. Fordi mikrotubuli er nøkkelen til mitotiske spindelenheten og celledeling, kan forskjeller i mitotisk spindel struktur og funksjon mellom tumorigen og nontumorigenic cellelinjer være forbundet med selektiviteten av disse forbindelser.
Som konklusjon, har vi identifisert en familie av mikrotubulidynamikk hemmere som er mest giftig mot tumorigene cellelinjer. Etablerte kreftcellelinjer som viser høy tumorigenicity i xenograft modeller kan fange opp noen av egenskapene til kreftcellepopulasjoner som er ansvarlig for å initiere og spre svulster. Derfor foreslår vi at denne familien av mikrotubulidynamikk hemmere eller beslektede forbindelser med liknende selektivitet egenskaper, bør vurderes som førsteklasses kandidater for videre evaluering som cytostatika.
Materialer og metoder
Primærdata
forbindelsen vekstinhibering av data ble erholdt fra cellelinje NCI antitumor skjerm 60. Den vekstinhibitoriske aktivitet av hver forbindelse svarer til den molare medikamentkonsentrasjon som kreves for å forårsake 50% veksthemning (GI50). De fleste analyser bruke en maksimal konsentrasjon på 0,0001 M (cellelinjeraster og GI50 parameter er beskrevet i [7]). For microarray genekspresjonsanalyser, brukte vi fem offentlig tilgjengelige datasettene for NCI60 cellelinjer: tredoble eksperimenter ved hjelp av Affymetrix U95A plattformen som Novartis, et enkelt U95A datasett levert av GeneLogic, og en enkel Affymetrix U133A /B datasett gitt av GeneLogic. De GI50 data ble hentet fra https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html og alle genuttrykk data ble hentet fra https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html . Alle genuttrykk og GI50 analysedata analyseres på stokken skala.
vurdering av karsinogent potensial
NCI60 cellelinjer har blitt eksperimentelt evaluert for karsinogent potensial ved transplantasjon av cellelinjer i immun- kompromittert mus. Eksperimentene og resultatene er gitt i Anticancer Drug Development Guide [6]. For ulike cellelinjer, blir disse dataene gitt enten kvantitativt eller kvalitativt, eller noen ganger som perioder, som «ta sats», eller andel forsøkt implantater som ga en svulst. Vi konverterte take hastighetsdata i fire bestilte kategorier for analyse: 0 for ingen vekst, en for 1-60% take hastighet, 2 for 60-80% take rente og 3 for 80-100% take rate. Cellelinjer som overlapper to kategoriene er vurdert til laveste kategori. For eksempel er en cellelinje med 70-90% take rente rangert som kategori 3. Disse rangeringer av karsinogent potensial er merket «TP».
Compound utvalg
Forbindelser aktivt mot høy oppkjøps rente cellelinjer ble identifisert ved å sammenligne veksthemming måling (-log GI50) til de fire-nivå rating på take-rate, ved hjelp av Pearson korrelasjon. Terskler på 0,4 og 0,5 ble brukt for å definere moderate og sterke sammenhenger. Statistisk signifikans ble vurdert ved å beregne forventet antall forbindelser av alle testede forbindelser som kan forventes å ha en sammenheng overskrider en gitt terskel ved en tilfeldighet (basert på bruk Fishers Z-transformasjon og ved hjelp av en standard normale referanse distribusjon).
genekspresjonsanalyser
Forbindelser aktiv mot cellelinjer som uttrykker relativt høye nivåer av PROML1 eller CD44-CD24 ble identifisert ved hjelp av Pearson korrelasjonskoeffisienter mellom -log
10GI50 og enten logge skala uttrykk for PROML1, eller forskjellen mellom log skala uttrykk nivåer av CD44 og CD24. PROML1 er representert med en unik probeset på begge plattformer, er CD44 representert med to U95A probesets og etter seks U133A /B probesets, og CD24 er representert med en U95A probeset og etter seks U133A /B probesets. Når flere probesets er tilgjengelige, er alle analysert separat, og forskjeller mellom alle par av CD44 /CD24 probesets analyseres separat. For alle analyser, forbindelser som færre enn 50 cellelinjer hadde en GI50 verdi, eller som hadde ingen variasjon i sine GI50 verdier, ble ekskludert fra analysen.
Standard cytostatika
Et sett av 168 forbindelser med anticancer aktivitet ble kompilert, og en undergruppe av 121 av disse ble merket i henhold til deres antatte virkningsmekanismen [8] – [10]. Dataene vi brukte ble hentet fra https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism_list.html, og inkluderer følgende mekanisme handling klasser og antall unike strukturer: alkylerende midler (35), antimitosemekanisme midler (13), topoisomerase-1-inhibitorer (24), topoisomerase II-inhibitorer (15), DNA anti-metabolitter (16), og RNA /DNA-anti-metabolitter (18).
kjemiske struktur sammenligninger
alle forbindelser diskutert her er en del av pubchem, og alle rapporterte strukturelle sammenligninger er basert på Tanimoto koeffisienter ved hjelp av 881 nøkkel CACTVS fingeravtrykk. Beregninger av Tanimoto koeffisienter og hierarkisk clustering av kjemiske strukturer basert på Tanimoto koeffisienter ble gjort ved hjelp av NCBI portal til pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Vi konverterte alle sammensatte identifikatorer fra DTP er NSC identifikator til pubchem sin CID identifikator for strukturell analyse.
Sammenlign analyse
Sammenlign beregninger for alle de kraftige forbindelser mot vanlige legemidler mot kreft fra ulike mekanistiske klasser er utført . Pearson korrelasjonskoeffisienter tilsvarende høy konsentrasjon av 0,0001 M er rapportert for et flertall av forbindelsene. For forbindelser som er testet med en alternativ høy konsentrasjon er Pearsons korrelasjons- koeffisienter oppnådd fra parene med den nærmeste høy konsentrasjon.
Selektivitet vindu
Selektiviteten vinduet ble beregnet ved å ta differansen mellom den gjennomsnitt -logGI50 av de mest tumorigene cellelinjer (ta-rate kategori 3) og de minst tumorigene cellelinjer (ta-rate kategori 0).
