Abstract
Beclin 1 samhandler med UV-bestråling-resistens-assosierte genet (UVRAG) for å danne kjerne komplekser som induserer autofagi. Mens celler med defekt autofagi er tilbøyelige til å genomiske ustabilitet som bidrar til tumorgenese, er det ukjent om Beclin1 eller UVRAG kan regulere DNA-skade /reparasjonsrespons til kreftbehandling i etablerte tumorceller. Vi fant at siRNA knockdown av
Beclin en
eller
UVRAG
kan øke strålingsinduserte DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin), vist ved pATM og γH2Ax, og fremme tykktarmskreft celledød. Videre knockdown av
Beclin en
,
UVRAG
eller
ATG5
økte andelen av bestrålte celler med atom foci uttrykker 53BP1, en markør for nonhomologous slutt bli med, men ikke RAD51 ( homolog rekombinasjon), sammenlignet med kontroll siRNA.
Beclin en
siRNA ble vist å dempe UVRAG uttrykk. Celler med en
UVRAG
sletting mutant defekt i Beclin en binding viste økt stråling-indusert DSB sin og celledød sammenlignet med celler med ektopisk vill-type
UVRAG
. Knockdown av
Beclin en
eller
UVRAG, etter men ikke
ATG5, etter resulterte i en betydelig økning i sentrosomen nummer (γ-tubulin flekker) i bestrålte celler sammenlignet med kontroll siRNA . Samlet utgjør disse dataene indikerer at Beclin en og UVRAG gi beskyttelse mot stråling-indusert DNA DSB sin og kan opprettholde sentrosomen stabilitet i etablerte kreftceller
Citation. Myung Park J, Tougeron D, Huang S, Okamoto K, Sinicrope FA (2014) Beclin en og UVRAG Confer Beskyttelse mot stråling-indusert DNA skade og opprettholde sentrosomen Stabilitet i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 9 (6): e100819. doi: 10,1371 /journal.pone.0100819
Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA
mottatt: 05.02.2014; Godkjent: 29 mai 2014; Publisert: 23 juni 2014
Copyright: © 2014 Myung Park et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute (5 K05 CA142885 og CA113681, både til FAS). DT er en mottaker av økonomisk støtte fra flerOrganisasjons Tematisk Institute for Cancer og den franske National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Macroautophagy er en katabolsk, lysosomal degradering bane som opprettholder celle biosyntese under metabolske, hypoksisk eller cytotoksiske stresset [1]. En viktig regulator av autofagi er Beclin en som protein er en sentral komponent i klasse III PI3K /Vps34 kompleks som er nødvendig for autophagosome dannelse og modning [2]. Beclin en samhandler med flere proteiner inkludert autofagi regulatorer, organ membran anker proteiner og BCL-2 og Bcl-x
L. En coiled-spole domene i Beclin en tjener som et protein interaksjon plattform for å rekruttere to store autofagi regulatorer, Atg14 og UV stråling motstand-assosiert genet (
UVRAG
) produktet [3]. UVRAG, opprinnelig identifisert gjennom sin evne til å utfylle UV-stråling følsomhet i tumorceller, forbinder med Beclin 1-BCL-2-PI (3) KC3 multiprotein kompleks der det og Beclin en samhandle via deres spole spole domene (CCD) og interdependently indusere autofagi [4].
Beclin 1 Hotell og
UVRAG
funksjon som tumorsuppressorgener, og
Beclin en
+/-
mus viste seg å være tumor-utsatt [5]. Beclin 1 kart til en region på kromosom 17q21, og
Beclin en product: [6] og
UVRAG product: [7] er monoallelically slettet i visse kreftformer. Allel tap av
Beclin 1 Hotell og defekt autofagi ble vist å bevisstgjøre celler til metabolsk stress [8], og for å aktivere DNA skade respons i forbindelse med Aneuploidy i udødeliggjort murine epitelceller og i brystsvulster [8].
i etablerte tumorer, er basal autophagy oppregulert å overleve metabolske, hypoksiske eller kjemoterapi-relatert stress, noe som indikerer at autophagy kan tjene som en mekanisme for terapeutisk motstand [9]. Autophagy inhibering har vist seg å øke kreftcelle følsomhet for kjemoterapi eller strålebehandling, etablere autophagy som et nytt mål for terapi [10], [11]. Nyere data indikerer at celler med defekt autofagi er utsatt for genomiske ustabilitet med økt DNA-skade og Aneuploidy [8], [12]. Imidlertid er bevis som støtter en rolle for autophagy i genomet beskyttelse i etablerte kreft begrenset, og rollen til Beclin 1, hvis noen, er ikke kjent. Det har blitt rapportert at UVRAG spiller en dobbelt rolle i kromosomalt stabilitet som ble funnet å være uavhengig av autophagy [13]. Kreftbehandling induserer DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) som aktiverer DNA-reparasjonsmekanismer inkludert ikke-homolog ende bli (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) for å gjenopprette genomisk integritet [14]. Nyere data tyder på at UVRAG kan fremme DNA DSB reparasjon ved direkte binding og aktivere DNA-PK i NHEJ [13]. Histon H2Ax, et substrat av ataxia telangiectasia mutated (ATM) og DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PK) (nøkkelenzym i NHEJ), er fosforylert på serin 139 og utgjør brennpunktene på DSB områder som kan tjene som en markør av DSB sin [ ,,,0],15]. Vedlikehold av genomisk integritet krever skikkelig kromosom segregering under celledeling som er i stor grad avhengig av montering av mitotiske spindel apparatet ved centrosomes. Ekstra centrosomes nesten uunngåelig føre til at spindelen misdannelse og feilaktig kromosomal segregasjon [16] som i respons til DNA-skade, kan føre til Aneuploidy og genomiske ustabilitet [17]. Defekter i gener involvert i DNA-reparasjon har vist seg å føre til avvik i sentrosomen nummer som er vanlig i humane tumorer [18].
Selv om rollen Beclin en og UVRAG har blitt studert i innstillingen av tumorigenesis [4 ], [13], [19], er lite kjent om deres rolle i reguleringen av genomisk stabilitet og den potensielle betydning av deres interaksjon i denne prosessen i etablerte tumorer. For å få innsikt i mekanismen (e) der tumorcelle autofagi kan gi behandling motstand, undersøkte vi muligheten for Beclin 1 og /eller dets kofaktor UVRAG å regulere DNA skade respons og sentrosomen nummer i tykk- og endetarmskreft (CRC) cellelinjer. CRC er svært motstandsdyktig mot DNA skade behandling som cytostatika og stråling som vanligvis gis samtidig i klinikken. I denne forbindelse har vi tidligere har rapportert at Beclin en overekspresjon var assosiert med redusert overlevelse i tykktarmskreftpasienter behandlet med 5-fluoruracil som adjuvansterapi [20]. I denne studien fant vi at Beclin en og UVRAG samhandle for å regulere DNA-skader /reparasjon som utnytter ikke homolog ende bli med og opprettholder sentrosomen stabilitet som svar på stråling. En
UVRAG
sletting mutant defekt i Beclin en binding mislyktes i å beskytte mot DSB sin demonstrerer viktigheten av deres interaksjon i vedlikehold av genomisk stabilitet.
Materialer og metoder
Cell Culture , narkotika, reagenser, og Cell Stråling
menneske~~POS=TRUNC kolorektal kreft cellelinjer, HT-29 og DLD1, og HeLa livmorhalskreft celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika /antimycotic. 293T-celler ble dyrket i DMEM (Sigma Chemical Co.) og supplert som angitt ovenfor. Alle cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og som er beskrevet tidligere [21], [22], med unntak av HeLa-celler som ble oppnådd fra Dr. S. Kaufmann ved Mayo Clinic [23]. Celler ble behandlet med 5-fluoruracil, bafilomycin A1 (Sigma, B1793), og spautin-1 (Cellagen Technology, C3430-2s) som angitt. Legemidler ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) som også ble brukt som en kontroll behandling. Celler ble også behandlet med ioniserende stråling med et Cesium 137 kilde på en MARK 1-25 irradiator (JL Shepherd and Associates).
Små interfering RNA (siRNA)
celler ble transfektert med siRNA oligonukleotider bruker Lipofectamine RNAiMAX Reagens (Invitrogen) og målretting sekvenser for
Beclin en product: (GGGTCTAAGACGTCCAACA),
cytosol-assosiert protein lett kjede 3 B product: (
LC3B
) (GAAGGCGCTTACAGCTCAA),
UVRAG plakater (TCACTTGTGTAGTACTGAA), og
autofagi protein fem plakater (
ATG5
) (GGCATTATCCAATTGGTTT) i henhold til produsentenes protokollen. For å utføre dobbelt knockdown, ble cellene transfektert med to siRNA oligonukleotider rettet mot ulike proteiner, 24 timer i mellom for cellene å komme seg.
Lentiviral Kort hårnål RNA
Kort hårnål RNA (shRNA) mal oligonukleotider ( syntetisert ved Mayo Clinic Molecular Biology Kjerne Facility) ble ligert inn i lentiviral shRNA kloning og ekspresjonsvektor pSIH1-H1 (System Bioscience, Mountain View, CA. kontrollen shRNA sekvens var CAACAAGATGAAGAGCACCAA (Sigma). den målretting sekvens for ubiquitin spesifikke peptidase 10 (
USP10)
var GCCTCTCTTTAGTGGCTCTTT Lentivirus produksjon ved hjelp av 293T-celler og transduksjon av målceller ble utført som tidligere beskrevet [24] puromycin (2 ug /ml; Sigma, P8833).. ble tilsatt ved 48 timer post- transduksjon, og puromycin-resistente celler ble utnyttet.
Ektopisk Expression of Retroviral
UVRAG
cDNA av
UVRAG plakater (Origene) ble subklonet inn pBabe- puro vektor med en N-terminal 3-tag. generering av en mutert
UVRAG
med sletting av spolen-spiral domene (
ΔCCD
) [25] ble oppnådd ved PCR utnytte overlapp primere som strakte regionen av interesse. Pseudo-skrev retrovirus ble produsert ved hjelp av disse
UVRAG
konstruerer per en tidligere beskrevet prosedyre [24]. Aminosyrer 144-269 ble slettet for å få
UVRAG ΔCCD
mutant.
Cell Livskraftig og apoptose Analyser
3-4,5-dimetyltiazol-2-yl ) -5- (3-carboxymethoxyphenly) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) kolorimetrisk analyse ble brukt for å måle cellelevedyktighet. Apoptose-analyse ble utført ved anvendelse av annexin V /PI farging og caspase-3 spalting, slik som tidligere beskrevet [22].
Immunoblotting
Proteinprøver ble fremstilt og deretter påsatt på en SDS-PAGE-gel med elektroforetisk overføring på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Bio-Rad), som tidligere beskrevet [24]. Antistoffer mot disse proteinene ble benyttet: Beclin 1, kløyvde caspase-3, γH2Ax, H2Ax, pCHK2, LC3, UVRAG, ATM (alt fra Cell Signaling Technology, 1:1000), γ-tubulin, pATM (EPITOMICS, 1:2000 ) og p62 (MBL, 1:2000). Protein band kvantifiseres og normalisert mot γ-tubulin hjelp ImageJ (National Institute of Health).
klonogene Survival analysen
To hundre celler ble sådd i hver brønn av en seks-brønns plate og deretter bestrålt (4 Gy) alene eller i nærvær av 5-fluorouracil (5-FU) (2 uM). Etter inkubering i 7-14 dager, ble cellene fiksert med 10% metanol /10% eddiksyre og deretter beiset med 0,4% krystallfiolett i 10% metanol. Antallet kolonier med 50 celler ble bestemt og uttrykt som relativ endring i narkotika behandlet
vs
ubehandlede celler
Immunpresipitasjon
Celler ble lysert i CHAPS buffer. [5 mmol /l MgCl
2, 137 mmol /l KCl, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /liter EGTA, 1% CHAPS, 10 mmol /l HEPES (pH 7,5)] i 30 minutter på is og deretter klaret ved sentrifugering ved 17 000 g i 10 min ved 4 ° C. Lysatene ble inkubert med et antistoff over natten ved 4 ° C. Antigen /antistoff-komplekset ble tatt med magnetisk protein A /G perler (Thermo Scientific) i 2 timer ved 4 ° C. -Bundne proteiner ble vasket tre ganger med 1 ml CHAPS-buffer uten proteaseinhibitorer. Bundne proteiner på kulene ble eluert ved inkubering i LDS prøvebuffer i 10 min og ble deretter lastet for immunblotting.
Immunfluorescens og Konfokalmikroskopi
Cellene ble dyrket i glassbunn retter belagt med poly- L-lysin (MatTeck Corp.) og deretter utsatt for y-stråling (2-8 Gy). Celler ble fiksert i 10 minutter med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS og blokkert i 3% bovint serumalbumin (BSA). Deretter ble cellene farget med primære antistoffer mot 53BP1 (Cell Signaling Technology, 4937, 1:100), eller RAD51 (Calbiochem, PC130, 1:100), etterfulgt av tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 eller 568, Molecular Probes, Invitrogen). Prøvene ble skyllet, nedsenket i 0,05 mg /ml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter, og montert med dekkglass ved hjelp forlenge gull (Invitrogen). Fluorescens konfokalmikroskopi ble utført ved hjelp av en Axiovert 100 M mikroskop utstyrt med en Plan-Apochromat 63 X /1.4 objektiv og Zeiss LSM510 programvare (Carl Zeiss). Prosentandelen av celler som inneholder mer enn 10 atom fluorescerende foci per total celle nummer ble beregnet ved å undersøke et minimum av 100 celler i fem felt på 63X for hver eksperimentell betingelse.
For farging av centrosomes, cytoplasma tubulin ble tømt med en microtubule stabilisering buffer (3 moll /liter EGTA, 50 mmol /l Rør, 1 mmol /l MgSO
4, 25 mmol /l KCl). Celler ble fiksert i 10 min i -20 ° C metanol [26], permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS, og inkubert i en blokkerende buffer (5% geiteserum, 1% glycerol, 0,1% BSA, 0,1% fisk hud gelatin). Deretter ble cellene farget med et primært antistoff mot γ-tubulin (Sigma, GTU-88, 1:5000) etterfulgt av tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer. Prosentandelen av celler med mer enn 2 centrosomes ble bestemt ved anvendelse av et fluorescerende mikroskop, hvorved minst 100 celler i fem felter ved 63X ble tellet for hver eksperimentell tilstand.
Statistical Analysis
statistiske sammenligninger for eksperimenter i dyrkede celler ble utført ved hjelp av t-test. Statistiske tester var tosidig med et signifikansnivå definert i
P .
0,05
Resultater
Cellebeskyttende Effekt av
Beclin en
i celler eksponert for 5-FU og /eller stråling
Vi avgjort om undertrykkelse av Beclin en kan forbedre chemoradiation-indusert cytotoksisitet. Koloncancercellelinjer ble behandlet med γ-stråling (4 Gy) alene eller i kombinasjon med 5-FU (2 uM). I behandlede celler,
Beclin en
knockdown
vs
kontroll siRNA ble vist å redusere celleviabilitet (Fig. 1A, B,
venstre paneler
).
Beclin en
knockdown også redusert langsiktig klonogene celle overlevelse etter stråling ± 5-FU i forhold til celler med kontroll siRNA (Fig. 1A, B,
høyre panel
). I disse eksperimentene, tilsetning av en klinisk oppnåelige dose av 5-FU hadde en minimal effekt på graden av stråling-indusert celledød.
A, B, etter HT-29 (A) eller DLD1 (B) celler ble transfektert med
Beclin en
vs kontroll siRNA og behandlet med stråling (RT; 4 Gy) alene eller i kombinasjon med 5-FU (2 uM). Resultatene av MTS (24 h) og klonogene overlevelses analysene er vist. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik for eksperimenter utført in triplo. Statistisk signifikans ble bestemt av en to-sidig Student t test og definert som *
P
0,05.
C
, celler med
Beclin en
eller kontroll siRNA ble bestrålt (4 Gy) og deretter ble undersøkt for ekspresjon av LC3I-II, γH2Ax, og kløyvde caspase-3 av immunoblotting på 24 timer . Protein band er kvantifisert og relativ intensitet ble merket under tilsvarende blot. Bare LC3II ble kvantifisert for LC3 protein.
D, etter Tid løpet av effekten av stråling på pATM uttrykk i celler med
Beclin en
siRNA vs kontroll siRNA.
E
, Effekt av
Beclin en
siRNA på autophagic flux i celler som ble behandlet med RT (4 Gy) og /eller 5-FU (4 mm).
for å finne ut om Beclin en kan regulere DNA skade respons, undersøkte vi effekten av stråling ved ekspresjon av DSB markører fosforylerte histone H2Ax (γH2Ax) [27] og fosforylert ataksi telangiectasia mutert (pATM). ATM er en kritisk sensor av DNA-skade som er involvert i DNA-reparasjon og G2-til-M sjekkpunkt kontroll [28], og hvis aktivering krever dens autofosforylering [29]. Undertrykkelse av
Beclin en
av siRNA øket γH2Ax ekspresjon todelt, indusert pATM, og økt caspase-3-spalting (2 ganger) i celler eksponert for stråling sammenlignet med kontroll siRNA (fig. 1 C, D). Modulering av γH2AX på 24 timer representerer trolig ikke reparert, rest DNA-skade etter bestråling. Vi så bestemt om
Beclin en
siRNA kan hemme stråleindusert autophagic forandring. Ved hjelp av bafilomycin A1 som hemmer vacuolar H + ATPase, observerte vi akkumulering av cytosolisk (LC3I) og membranbundet (LC3II) former av LC3 (fig. 1E), hvis forholdet er korrelert med graden av autophagosome formasjon [1], [30]. I celler behandlet med 5-FU + stråling og bafilomycin A1,
Beclin en
knockdown ble vist å dempe akkumulering av LC3I-II sammenlignet med kontrollceller og for å øke ekspresjon av autophagy substratet p62 /sequestosome1 [24] i overensstemmelse med inhibering av autophagic fluks (fig. 1E).
Vi deretter bestemmes evnen til Beclin 1 og UVRAG å modulere den DNA-skade respons i bestrålte celler. Uttrykk for 53BP1 er en sensor for DNA-skade og en tilrettelegger for NHEJ [31] mens RAD51 er en kritisk regulator av DNA-reparasjon gjennom HR [32]. Bestråling var assosiert med en økning i andelen av celler med 10 53BP1 atom foci etter 4 timer som var signifikant (p 0,05) forbedret i
Beclin en
,
UVRAG
eller
ATG5
knockdown
vs
kontrollceller (fig. 2A).
ATG5
knockdown celler ble brukt som en kontroll for deaktivering autofagi. Bestråling også økt antall RAD51 foci som ikke skiller seg vesentlig fra
Beclin en
,
UVRAG
eller
ATG5
knockdown
vs
kontrollceller (Fig . 2B).
A, B, etter immunfluorescens farging for 53BP1 (A) eller RAD51 (B) ble utført i HT-29 celler med knockdown av
Beclin en
UVRAG
eller
ATG5 Hotell og utsatt for stråling (2 Gy) ved de angitte tider. Prosentandelen av celler med 10 foci som uttrykker enten 53BP1 eller RAD51 ble beregnet og plottet som vist. 53BP1 og RAD51 er markører for nonhomologous slutten sammenføyning og homolog rekombinasjon, henholdsvis. DAPI ble benyttet for å counterstain kjernen. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik for eksperimenter utført in triplo. Statistisk signifikans ble bestemt av en to-sidig Student t test og definert som *
P
. 0,05
USP10 og USP13 har vist seg å megle deubiquitination av Beclin 1, for derved å stabilisere den Vps34 komplekset [33]. Hemming av disse deubiquitinases kan derfor representere en strategi for å undertrykke autofagi. Vi fant at undertrykkelse av
USP10
av shRNA induserte en to-dobling i DSB markør γH2Ax og caspase-3 cleavage, og også redusert klonogene overlevelse i bestrålte celler (fig. 3A). Inhibering av USP10 og USP13 ble også utført ved å bruke spautin-1, er en potent inhibitor av lite molekyl autophagy som fremmer degradering av Vps34 PI3 kinase komplekser [33]. Spautin-1 hemmet autofagi som antydet ved redusert LC3I-II omdannelse og akkumulering av p62 /sequestosome 1 (fig. 3B). Videre spautin-1 forbedrede DSB, beskjedent indusert apoptose (Fig. 3B, C), og redusert klonogene overlevelses i celler eksponert for stråling alene eller i kombinasjon med 5-FU (Fig. 3D).
A,
Celler med
USP10 vs
kontroll shRNA ble bestrålt og analysert for uttrykk av USP10, LC3I-II, γH2Ax og kløyvde caspase-3 i 24 timer ved immunoblotting (
venstre
) eller for klonogene overlevelse (
midt
).
B,
Cellene ble behandlet med bestråling alene eller i kombinasjon med spautin-1 (10 pM), og ekspresjon av de angitte proteiner ble analysert på 24 timer ved immunblotting.
C, D,
Cellene ble behandlet med spautin-1 (10 pM) alene eller i kombinasjon med RT (4 Gy) (C) eller RT ± 5-FU (2 uM) (D). I disse cellene, annexin V
+ PI
– merking ved 24 timer (C) og klonogene overlevelses (D) ble analysert. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik i forhold til kontroller for triplikate eksperimenter. **
P
. 0,01
UVRAG
samhandler med
Beclin en
å regulere DNA Damage Response
Nyere bevis tyder på at redusert uttrykk for
UVRAG
sett i noen kreftformer kan gjengi kreftceller sårbare for kromosomskade [34]. Vi fant at
Beclin en
siRNA kan potent redusere UVRAG ekspresjon i nærvær eller fravær av stråling (fig. 4A). Knockdown av
UVRAG
av siRNA øket strålingsinduserte DSB (γH2Ax) (Fig. 4B), er nivåene av pATM (fig. 4C), og caspase-3 spaltning sammenlignet med kontroll siRNA (Fig. 4B). For å avgjøre om
Beclin en
har en additiv effekt med
UVRAG
på regulering av stråling-indusert DNA skade og apoptose, sammenlignet vi celler med knockdown av
UVRAG vs
de med dobbel knockdown av
Beclin 1 Hotell og
UVRAG
. Mens tilsvarende nivåer av γH2Ax og pCHK2 ble funnet, viste bestrålte celler med dobbelt-knockdown økt caspase-3 cleavage antyder at modulering av apoptose ved Beclin en oppstår uavhengig av
UVRAG plakater (fig. 4D). Vi deretter studert samspillet mellom Beclin en og UVRAG i kontroll og bestrålt cellelinjer. Immunopresipitert UVRAG ble vist å assosiere med Beclin 1 i nærvær eller fravær av stråling (Fig. 5A).
A, B, etter HT-29 og DLD1 celler ble transfektert med
Beclin en product: (A) eller
UVRAG product: (B)
vs
kontroll siRNA. Celler ble bestrålt og ekspresjon av de angitte proteiner ble analysert på 24 timer etter bestråling ved immunblotting.
C, etter Tid løpet av effekten av stråling på pATM uttrykk i celler med
UVRAG vs
kontroll siRNA.
D, etter Effekt av stråling på DNA skade og apoptose markører i celler med dual knockdown av
Beclin 1 Hotell og
UVRAG
vs
UVRAG
siRNA alene ( 24 h). Densitometry ble utført og normalisert mot tubulin.
A, etter Immunpresipitasjon av UVRAG fulgt ved sondering for Beclin 1 ble utført i HT-29 cellelysatene (4 h) Følgende stråling (4 Gy)
vs
ubehandlede celler. Normal IgG ble anvendt som en kontroll for antistoffspesifisitet. Både kort (SE) og lengre (LE) eksponeringer vises for UVRAG.
B; Eksporter HT-29 celler overekspresjon
UVRAG
villtype (wt) eller en sletting mutant på sitt spiral-spiral domene (ΔCCD), begge merket med en tre-tandem-tag [ ,,,0],3tag: s-tag, 2XFLAG og streptavidin bindende protein (SBP)], ble utsatt for immunoprecipitation for FLAG. Utfelte proteiner ble analysert ved hjelp av antistoffer mot Beclin 1, UVRAG eller FLAG. Normal IgG ble anvendt som en kontroll.
C; Eksporter Cellelysater fra bestrålt (4 Gy) celler ble probet for LC3I-II og γH2Ax på 24 timer etter bestråling av immunoblotting. Stabil
UVRAG
vekt eller
ΔCCD
mutante celler ble brukt her og i fig. 5B.
D
, Celler med vekt
UVRAG
eller
UVRAG ΔCCD
mutant vs tom vektor kontroll ble behandlet med kjøretøy eller stråling, og langsiktig klonogene overlevelse ble bestemt. Dataene ble normalisert i forhold til ubehandlede celler for hver celle fenotype. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik for eksperimenter utført in triplo. Statistisk signifikans ble bestemt av en to-sidig Student t test og definert som * P. 0,05
I HT-29 cellene der UVRAG ble immunopresipitert, var dens induksjon av stråling sett sammenliknet med ubehandlede celler og UVRAG ble også vist å binde seg til Beclin 1 (fig. 5A). For å studere virkningen av Beclin en og UVRAG samhandling i reguleringen av Radiosensitivity, genererte vi HT-29 celler som stabilt uttrykker villtype (wt)
UVRAG
eller
ΔCCD
mutanter som formidler dets interaksjon med Beclin 1 [25].
UVRAG ΔCCD
mutante celler viste nær fullstendig tap av binding til Beclin 1 i kontrast til UVRAG vekt celler (fig. 5B). Ektopisk vekt
UVRAG
ble vist å forbedre LCI-II konvertering i bestrålte celler (Fig. 5C). Vi ønsket å finne ut om
UVRAG ΔCCD
kan føre til tap /demping av autofagi induksjon av stråling.
UVRAG ΔCCD
celler viste en beskjeden reduksjon i stråleindusert LC3I-II konvertering i forhold til WT celler (Fig. 5C) som kan være relatert til sameksistens av endogen UVRAG. Celler med UVRAG
ΔCCD
var mer utsatt for stråling-indusert DSB sin, vist ved økt γH2Ax (Fig. 5C) i forhold til vekt
UVRAG
og tomme vektorkontrollceller. Videre celler med
UVRAG ΔCCD
var mer utsatt for stråling-indusert celledød vist i et langsiktig klonogene overlevelse analyse i forhold til UVRAG vekt celler (fig. 5D).
Beclin 1 Hotell og
UVRAG
Regulering sentrosomen Stabilitet
Selv om celler med defekt autofagi er utsatt for genomisk ustabilitet, er bevis som støtter en rolle for autofagi i genomet beskyttelse begrenset og rollen Beclin en eller UVRAG, om noen, er dårlig forstått. Vi undersøkte evnen til autofagi regulatorer å mekle genom beskyttelse ved analyse av sentrosomen forsterkning. Sentrosomen forsterkning er påvist i humane kreftceller med DNA-skade indusert av ioniserende stråling eller cytostatika [35], og kan føre til mitotisk svikt og påfølgende celledød [36]. Autophagy hemming av undertrykkelse av
ATG5
eller
LC3
av siRNA ble vist å forbedre stråleindusert γH2Ax og caspase-3 cleavage (Fig. 6A), noe som indikerer mulighet for autophagy å regulere disse prosessene . Vi er fast bestemt da om Beclin 1 og /eller UVRAG kan regulere sentrosomen stabilitet. I ubehandlede HT-29 eller Hela celler, fant vi en statistisk signifikant økning i sentrosomen antall etter knockdown av
Beclin en
eller
UVRAG Hotell og i mindre grad for ATG5, sammenlignet med kontroll siRNA vist ved γ-tubulin immunfluorescens (fig. 6B). I bestrålte celler, ble en statistisk signifikant økning i sentrosomen antall begrenset til celler med knockdown av
Beclin en
eller
UVRAG, etter men ikke
ATG5 plakater (Fig. 6B). Disse funnene tyder på at Beclin en og UVRAG kan regulere sentrosomen stabilitet uavhengig av autofagi.
A, etter Effekt av knockdown av
LC3 product: (
venstre
) eller
ATG5 product: (
midt
) på markører for DSB sin (γH2Ax), apoptose (caspase-3), og autofagi (LC3I-II konvertering) i HT-29 og /eller DLD1 celler eksponert for stråling
vs
kontroll 24 timer etter bestråling.
B
, sentrosomen nummer ble bestemt ved immunofluorescens i
Beclin en
,
UVRAG, etter eller
ATG5
knockdown celler (HT-29 eller HeLa) behandlet med stråling (4, 8 Gy)
vs
kontroll. Cellene ble deretter farget for γ-tubulin (rød farge) og representative bilder vises (
forlot
). Prosentandelen av celler med mer enn to centrosomes (multi-centrosomes) ble talt opp og plottet (
midt
). Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik for eksperimenter utført in triplo. Statistisk signifikans ble bestemt av en to-sidig Student t test og definert som *
P
. 0,05 sammenlignet med kontrollcellene
Diskusjoner
Mens rollen Beclin en og UVRAG i DNA skade har blitt studert i innstillingen av tumorigenesis [4], [13], [19], er lite kjent om de molekylære detaljene for sin rolle i tumorcelle respons på kreftbehandling. Forstå cellulære mekanismene for resistens mot DNA skade og reparasjon svar er avgjørende for å forbedre terapeutiske resultater hos kreftpasienter. Hensiktsmessig utførelse av DNA DSB reparasjon er kritisk for tumorcelleoverlevelse etter DNA-skade og for vedlikehold av genomisk stabilitet. Vi fant ut at Beclin 1 og dens kofaktor UVRAG kan regulere DNA skade /reparasjon respons og sentrosomen stabilitet i menneskelige CRC celler. Spesielt undertrykkelse av
Beclin en
eller
UVRAG
var forbundet med opphopning av DSB sin og med økt apoptotisk celledød i respons til stråling ± 5-FU, indikerer deres evne til å regulere disse prosessene. En mekanisme som
UVRAG Hotell og
Beclin en
regulere DNA skade respons er foreslått av den finner at undertrykkelse av enten genet betydelig økt antall bestrålte celler med atom foci uttrykke 53BP1 som bidrar til NHEJ ved å samhandle med kromatin på DSBs nettsider for å regulere 5 «enden reseksjon [31]. Denne observasjonen er i samsvar med data i
53BP1
-deficient mus som viser overfølsomhet for bestråling og utviser kromosomavvik som tyder på DNA reparasjon defekter [37]. I motsetning til 53BP1, fant vi at antall RAD51 atom foci var upåvirket av
Beclin en
eller
UVRAG
undertrykkelse, men videre studier er nødvendig for å fastslå fortrinnsrett involvering av NHEJ
vs
HR i denne innstillingen. Siden Beclin en stabilitet kontrolleres av ubiquitinering har hemmende deubiquitinases at downregulate Beclin en vist seg å deaktivere cytoprotective effekten av Beclin 1. I likhet med
Beclin en
knockdown, fant vi at undertrykkelse av ubiquitin-spesifikke peptidase, USP10, eller et lite molekyl inhibitor av deubiquitinases USP10 og USP13, dvs. spautin-1 [33] kan øke strålingsinduserte DSB og markeds tumor celledød. Nyere data viser en nær sammenheng mellom Beclin 1 og p53 via deubiquitinases USP10 og USP13 [33]. Siden USP10 medierer deubiquitination av p53, kan regulering av deubiquitinase aktiviteten av USP10 og USP13 ved Beclin en tilveiebringe en mekanisme hvorved den kan kontrollere de p53 protein nivåer. Men relevansen av disse funnene til celler med mutert
p53
, som brukt i denne studien, er ukjent. Mens vi utnyttet knockdown tilnærminger og en autofagi inhibitor (spautin), erkjenner vi at enkelte autofagi regulatorer kan direkte eller indirekte regulere cellulære prosesser som er uavhengige av autofagi [13], [38].
Vi fant at undertrykkelse av
Beclin en
ble assosiert med nedregulering av UVRAG, i samsvar med bevis på at stabiliteten av komponentene i PI (3) KC3 kompleks som regulerer autofagi er innbyrdes avhengige på en post-transkripsjonelle nivå [3], [4 ]. For å bestemme funksjonell overlapping mellom disse genene, genererte vi celler med dual knockdown av
UVRAG Hotell og
Beclin en
som ble vist å øke apoptose, men ikke DSB sin, sammenlignet med
UVRAG
knockdown alene. Dette funnet tyder på at Beclin en kan regulere apoptose uavhengig av UVRAG.
