Abstract
Kreft assosiert fibroblaster (kafeer) er ansvarlig for tumorvekst, angiogenese, invasjon og metastasering. Matrise-metalloproteinase (MMP) -9 utskilt fra kreft stroma befolket av kafeer er en forutsetning for kreft angiogenese og metastase. Omega-3 flerumettede fettsyrer (omega-3 PUFA) har blitt rapportert å ha anti-tumor-effekter på forskjellige typer av maligniteter. Fat-1-mus, som kan konvertere omega-6 og omega-3 PUFA er uavhengig av diett, er anvendbare for å undersøke funksjonene til endogent omega-3 PUFA. For å undersøke virkningen av omega-3 PUFA på tumorgenese, TC-1-celler, en murin epitelcellelinje udødeliggjort av humant papillomavirus (HPV) onkogener, ble injisert subkutant inn i fett en eller villtype mus. Tumorvekst og angiogenese av TC-1 tumor ble betydelig undertrykt i fett-1 sammenlignet med villtype-mus. cDNA microarray av tumorer avledet fra fett-1 og villtype-mus avslørte at MMP-9 er nedregulert i fett-1 mus. Immunhistokjemisk studie viste immunoreaktivitets for MMP-9 i tumor stromale fibroblaster var diffust positiv i villtype mens midt i fett-1 mus. MMP-9 ble uttrykt i primære dyrkede fibroblaster isolert fra fett-1 og villtype mus, men ble ikke uttrykt i TC-1-celler. Ko-kultur av fibroblaster med TC-1-celler forsterket ekspresjon og proteinase aktiviteten til MMP-9, selv om protease aktiviteten av MMP-9 i fett-1-avledet fibroblaster var lavere enn i villtype-fibroblaster. Våre data tyder på at omega-3 PUFA undertrykke MMP-9 induksjon og tumor angiogenese. Disse funnene kan gi innsikt i mekanismene som omega-3 PUFA utøve anti-tumor effekt ved å modulere svulstens mikromiljø
Citation. Taguchi A, Kawana K, Tomio K, Yamashita A, Isobe Y, Nagasaka K, et al. (2014) matriksmetalloproteinase (MMP) -9 i Cancer-assosiert fibroblaster (kafeer) er undertrykt av Omega-3 flerumettede fettsyrer
In Vitro
og
In Vivo
. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10,1371 /journal.pone.0089605
Redaktør: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 10. oktober 2013, Godkjent: 22 januar 2014; Publisert: 27 februar 2014
Copyright: © 2014 Taguchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Tokyo IGAKUKAI (KK), Japan Science and Technology Agency precursory Forskning for Embryonic Science and Technology (PRESTO) (MA), departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (MA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumor mikromiljøet består av mikrovaskulære endotelceller, ved siden av normale epitelceller og kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), og er rapportert å være en viktig regulator av tumorigenesis [1], [2]. Som den vanligste cellulære populasjon som finnes i svulsten mikromiljøet, kafeer er ansvarlig for syntesen av proteiner som er involvert i ombygging av den ekstracellulære matriks (ECM), og for sekresjon av vekstfaktorer og cytokiner som regulerer tumorcelle-proliferasjon og invasjon [3- ], [4]. I murine eggstokkreft xenograft modeller, p53 /NF-kB veien i kafeer betydelig økt in vivo tumorvekst [5]. I tykktarmskreft, Zhu Y et al. rapporterer at IL-1β øket colon cancer celleproliferasjon og invasjon av opp-regulering av COX-2-signalisering i kafeer [6].
Matriks-metalloproteinaser (MMP) er syntetisert som proenzymer og vanligvis aktivert ved proteolytisk fjerning av en propeptid [7]. MMP’er er rapportert å påvirke tumorprogresjon ved å lette hendelser dreie for neovaskularisering og etablering av fjernmetastaser, inkludert spredning, overlevelse og migrering av endotelceller, tumor og stromale celler [8], [9]. MMP-2 og MMP-9 er innblandet som forutsetninger for angiogenese og metastase i carcinogenesic prosessen. MMP-2 er uttrykt i de forskjellige cancercellelinjer [10]. I motsetning til dette, har MMP-9 meget begrenset eller ingen ekspresjon i disse kreftceller. I stedet, MMP-9 er velkjent å bli utskilt fra kreft stromale fibroblaster og endotelceller [11], [12]. MMP-9 er et medlem av en familie av sink-inneholdende endoproteinases som er involvert i nedbrytning av ekstracellulær matriks (ECM) og vaskulær remodellering [13].
dokosaheksaensyre (DHA, 22:6n-3) og eikosapentaensyre (EPA, 20:5n-3) er representative mediatorer av omega-3 flerumettede fettsyrer (omega-3 PUFA) og utøve anti-inflammatorisk virkning i akutte og kroniske patologiske inflammatoriske reaksjoner ved å motvirke inflammasjon [14]. Omega-3 PUFA er også rapportert å ha anti-kreft effekt basert på in vitro og vivo studier [15] – [17]. Flere mekanismer har blitt foreslått for å forklare de anti-kreft-effekter av omega-3 PUFA. Omega-3 PUFA forandre veksten av tumorceller ved modulering av cellereplikasjon, ved å interferere med komponenter av cellesyklusen eller ved å øke celledød via nekrose eller apoptose [18], [19]. Omega-3 PUFA er også kjent for å utøve anti-angiogene effekter ved å hemme produksjonen av mange angiogene mediatorer inkludert: vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), og prostaglandin E2 (PGE2) [20] – [24].
kosttilskudd er en tradisjonell tilnærming til å endre vev næringssammensetningen i dyrestudier av ernæring. Foring av dyr dietter som endrer spesifikke ernæringsmessige og ikke-ernæringsmessige komponenter kan bidra til å skille eksperimentgrupper; imidlertid, kan det være meget vanskelig å tilveiebringe dietter som er identisk i alle bortsett fra en enkelt eller en liten, men kontrollert antall komponenter. Kang et al. nylig utviklet en transgen mus som bærer fett 1 genet fra rundorm
Caenorhabditis elegans product: [25]. Dette genet koder for en omega-3-fettsyre-desaturase som katalyserer omdannelsen av omega-6 og omega-3 PUFA, og som er fraværende i de fleste dyr, inkludert pattedyr. Det er en bemerkelsesverdig forskjell i vevet omega-6 /omega-3 PUFA forholdet mellom villtype og fett-1 transgene mus [26]. Fat-1-mus, som typisk har et balansert forhold mellom omega-6 og omega-3 flerumettede fettsyrer i deres vev og organer uavhengig av diett, gjør det mulig å nøye kontrollerte undersøkelser som skal utføres i fravær av potensielle forstyrrende faktorer av diett. Dette gjør dem en nyttig modell for å undersøke de biologiske egenskapene til endogene omega-3 PUFA [25]. Flere rapporter ved hjelp av fett-1 mus har vist anti-kreft-effekter av omega-3 PUFA [27] – [30]. I disse undersøkelsene, omega-3 PUFA som utøves anti-kreft effekt ved undertrykkelse av betennelsesreaksjoner og PGE2-sekresjon fra kreftceller. Til dags dato er det få studier som undersøker involvering av omega-3 PUFA i biologi kafeer.
I denne studien har vi en hypotese om at omega-3 PUFA kan endre kreft microenvironments ved å påvirke CAF aktivitet. For å undersøke denne hypotese, ble fibroblaster avledet fra fett-1 og villtype-mus vurdert både in vitro og in vivo under betingelser som tillater interaksjon med TC-1 cancerceller. TC-1-celler ble avledet fra epitelet av C56BL /6 mus og udødeliggjort human papillomavirus (HPV) type 16 E6- og E7-onkoproteiner. De er ofte brukt in vitro og in vivo i murine modeller av HPV-relatert kreft [31]. Her undersøkte vi involvering av omega-3 flerumettede fettsyrer i TC-1 tumordannelse ved å sammenligne fett-1 og villtype-mus. Vårt spesifikke fokus involvert studiet av tumorassosierte fibroblaster. Disse modellene er anvendbare i studiet av kafeer fordi kreftcellene stammer fra villtype murin epitel, mens de kreft stromale komponenter, innbefattende kafeer, kommer fra fett-1 (omega-3 PUFA-rikt) eller villtype (normale PUFA) mus.
Materialer og metoder
Dyr og kosthold
Fat-1 mus ble opprettet på en C57BL /6 bakgrunn som beskrevet [26] og senere backcrossed (minst fire ganger) på en C57BL /6 bakgrunn. Dyrene ble foret med en spesiell diett (AIN-76A + 10% saflorolje, Clea Japan, Inc.) som inneholdt 10,3% totale fett med fettsyresammensetningen C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3n-3 (0,3%), C20:4n-6 (under 0,1%), C20:5n-3 ( 0,1 %), C22: 6n-3 (under 0,1%), høy i n-6 og lav i n-3-fettsyrer, inntil den ønskede alder (6-8 uker) for eksperimenter. For å hindre oksidasjon av lipider i dietten, ble alle matvarer oppbevares i kjøleskap med antioksidanter (Ageless; Mitsubishi Gas Chemical Inc.), og fremstilt nylig annenhver dag. Dyrestudier ble godkjent av University of Tokyo Animal komiteen.
Tumor vekstanalyse i mus
TC-1 celler er hentet fra en epitelcelledifferensiering primære lunge fra C56BL6 /mus og udødeliggjort ved hjelp av HPV 16 E6 /E7 pluss c-Has-ras (gaver fra Dr. TC Wu, Johns-Hopkins University, Baltimore MD USA) [32]. TC-1-celler ble dyrket i DMEM (Gibco, NY, USA) inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, og 0,25 g /ml amfotericin B. Åtte uker gamle hunnmus ble injisert med 5 x 10
6 murine TC-1-celler suspendert i 100 ul DMEM. Tumorvolum, basert på kalibermålinger, ble beregnet ved 7 og 14 dager etter injeksjon i henhold til følgende formel: (tumorvolum) = 1/2 x (den korteste diameter)
2 x (største diameter). Musene ble avlivet 14 dager etter inokulering, tumorene ble spaltet ut og lagret ved -80 ° C for senere analyser.
cDNA microarray
Total RNA fra TC-1-tumorer (ovenfor) ble ekstrahert ved anvendelse av en RNeasy MINIKIT (Qiagen, Hilden, Tyskland). For cDNA microarray analyse, ble 0,5 mikrogram av samlet total RNA forsterkes og merkes med en Amino Allyl MessageAmpTM II mRNA Amplification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve av mRNA merkes med Cy3 og referanse mRNA merkes med Cy5 ble cohybridized til GeneTM mus Oligo-brikken 24 k (Toray Industries Inc., Tokyo, Japan) ved 37 ° C i 16 timer. Etter hybridisering, ble hver DNA-brikke vasket og tørket. Hybridisering signaler avledet fra Cy3 og Cy5 ble skannet med Scan Array Express (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Det skannede bildet ble analysert ved hjelp GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Alle analyserte data ble skalert med global normalisering. GEO sjonsnummer er GSE54079.
Immunohistochemistry
Parafin seksjoner (4 mikrometer) av TC-1 tumorer ble avvokset i xylen og rehydrert gjennom gradert etanol til vann. Antigener ble hentet ved koking i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 30 min. De avkjølte seksjoner ble inkubert i DAKO REAL Peroxidase-blokkeringsløsning (DAKO, Carpinteria, CA, USA) i 10 minutter for å stanse endogen peroksidase. For å blokkere ikke-spesifikk binding ble snittene inkubert i DAKO Protein blokkeringsløsning (DAKO) i 10 minutter ved romtemperatur. Seksjonene ble deretter inkubert med et kanin polyklonalt antistoff mot mus MMP-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 fortynning) i DAKO REAL antistoffdiluent (DAKO) over natten ved 4 ° C. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer, vasket, inkubert med DAB, motfarget med hematoksylin, dehydrert gjennom etanolserier og xylen, og montert. For å evaluere svulst microvessel formasjonen, ble tumorsnitt farget for CD-31 ved hjelp av en rotte monoklonalt antistoff mot mus CD-31 (ab56299, Abcam, Tokyo, Japan, 1:100 fortynning).
RT-kvantitativ PCR ( RT-qPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra TC-1 tumorer og dyrkede fibroblaster ved hjelp av en RNeasy MINIKIT (Qiagen, Hilden, Tyskland) etterfulgt av revers transkripsjon. cDNA ble forsterket i 40 sykluser i en lys Cycler 480 (Roche, Basel, Sveits) med en Universal Probe Master Mix og følgende primere og Universal Probe Library (UPL) prober (Roche). Primerene og universelle prober som korresponderer med hver primer som ble brukt i amplifikasjonene var som følger: mus β-aktin, 5’ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3 «og 5′-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3′ probe88; mus MMP-9, 5»-ACGACATAGACGGCATCCA-3 «og 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3» probe19. Ekspresjon av MMP-9 ble normalisert ved hjelp av β-aktin mRNA som en intern standard. Expression nivåer ble beregnet ved sammenlignende Ct metode med β-actin som en endogen referanse genet.
Primær fibroblast kultur og co-kultur med TC-1 celler
Lunger ble isolert fra fett-en transgene og villtype-mus og vasket med saltvann for å fjerne blodceller. Isolering og kultur av pulmonale fibroblaster ble utført ved bruk av metodene som er beskrevet tidligere [33]. Lunge vev ble hakket i små biter og inkuberes i DMEM (Gibco, NY, USA) som inneholder type I kollagenase (0,25%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og deoxynuclease I (15 U /ml, Takara, Tokyo, Japan) i 120 minutter ved 37 ° C. De resulterende dispergerte celler ble separert ved filtrering gjennom nylon cellesiler (70 um, BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Fibroblaster i filtratet ble samlet, plassert i 10 cm skåler i DMEM inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin og 0,25 mg /l amfotericin B, og inkubert i 7-10 dager. Fibroblaster ble renset fra andre cellepopulasjon ved differensial adhesjon og seriell passasje.
Sammenflytende fibroblaster og TC-1-celler ble trypsinisert og resuspendert i DMEM inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, og 0,25 g /ml amfotericin B og 1 x 10
5-celler /ml celler av hver celletype ble platet sammen i 12 brønners kulturplater. Ko-kulturer ble inkubert ved 37 ° C 5% CO2 i en fuktig atmosfære i 24 timer. Homotypisk kulturer tjente som kontroller.
Gelatin zymografi
Gelatin zymografi analyser ble utført ved anvendelse av en Gelatin zymografi kit (Cosmobio, Sapporo, Japan) i henhold til produsentens instuctions. Cellekultursupernatanter ble oppsamlet og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter. Den cellefrie supernatant ble blandet med 2 x prøvebuffer og underkastet elektroforese ved å bruke prefabrikerte geler (10% polyakrylamid, 0,1% gelatin) ved 4 ° C i 1 time. Subsequentnzymatic reaksjoner ble utført ved 37 ° C over natten. Gelatinase aktiviteter ble visualisert ved hjelp av spesifikke flekker løsninger og avfarget i eddiksyre-metanol-dH
2o (1:03:06). For semi-kvantitative analyser, ble gelatin Zymografi band analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare (ImageJ).
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistiske analyser ble utført av Student
t
-test, eller Wilcoxon analyse ved hjelp av JMP programvare. En verdi på P 0,05 ble betraktet som signifikant. I figuren legender, stjernene indikerer disse sammenligningene med statistisk signifikans (p 0,05).
Resultater
tumorvekst og angiogenese av TC-1 tumorer undertrykkes i fett-1 mus
for å undersøke effekten av omega-3 PUFA på livmorhalskreft tumorigenesis, injisert vi TC-1 celler subkutant til fett-en og søppel-mate villtype C57 /BL6 mus. TC-1 tumordannelseshastigheten og tumorvekst ble evaluert ved antallet mus som danner tumorer og tre-dimensjonale tumorstørrelser, respektivt. Det var ingen forskjell i tumordannelseshastigheten mellom fett-1 og villtype-mus. TC-1 tumorstørrelsene ble plottet i 14 dager i fett-1 og villtype-kontroller (fig. 1). Tumor vekstrater var gjennomgående lavere i fett-en mus sammenlignet med villtype mus på alle tidspunkter. I fett-1 mus, tumorstørrelsen på 14 dager etter injeksjon, var betydelig mindre enn i villtype-kontroller (fig. 1). Selv om cellevekst av TC-1 celler er avhengig av HPV16 E6 /E7 uttrykk, ble E6 og E7 uttrykk i TC-1 svulster ikke nedregulert i fett-1 mus (Fig. S1).
5 × 10
6 murine TC-1-celler suspendert i 100 ul DMEM ble injisert sc inn i hvert av 10 fett-1 og villtype-mus. Tumorvolum, basert på kalibermålinger, ble beregnet ved 7 og 14 dager etter injeksjon i henhold til følgende formel: (tumorvolum) = 1/2 x (den korteste diameter)
2 x (største diameter). Middelverdier med standardavvik er vist. Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype mus) med statistisk signifikans (p 0,05).
For ytterligere å avgrense mekanismene bak disse forskjellene i tumorvekst i denne modellen, særlig i form av den mulige rollen som verts-avledet kreft-assosiert stromal komponenter, inkludert kafeer, neste undersøkte vi om omega-3 PUFA modifisert angiogenese i TC-en svulst. Vi vurderte semi-kvantitativt tumor microvessel tetthet i TC-1 tumorer avledet fra fett-1 og villtype-mus ved å telle antall CD31-positive mikrokar i immunhistokjemisk analyse (fig. 2A og 2B). CD31 farging av TC-1 tumorer avledet fra fett-1 og villtype-mus (fig. 2A) demonstrerte hypovascularity av fett-1-avledet TC-1 tumorer sammenlignet med villtype tumorer avledet. Antall CD31-positive microvessels pr høyeffekts felt i fett-1 mus var signifikant lavere enn i villtype mus (Fig. 2B). Disse in vivo-data indikerte at TC-1 tumorvekst og angiogenese ble i det minste undertrykket i fett-1-mus sammenlignet med villtype motstykker, selv om det var vanskelig å nøyaktig beregne TC-1 cellevekst i fett-1 mus.
CD31 farging av TC-1 tumor avledet fra villtype (WT) mus (A) og fett-1 (B). Linjene indikerer 200 mikrometer. (C) microvessel tettheter i TC-1 tumorer er uttrykt som representativt antall av merkede fartøy i 4 felt (n = 5). Middelverdier med standardavvik er vist. Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype mus) med statistisk signifikans (p 0,05).
MMP-9 er nedregulert i fett-1 mus-avledet TC-1 svulster
for å undersøke mulige forskjeller i genekspresjonsprofiler fra TC-1-tumorer som vokser i huden av fett-1 og villtype-mus, ble TC-1 tumor vev oppnådd fra fett-1 og villtype-mus analysert ved hjelp av cDNA microarray. Siden omega-3 PUFA er rapportert å påvirke celle-proliferasjon og inflammasjon, Tabell 1 angir relative gen ekspresjonsnivåer for representative gener assosiert med tumorvekst og inflammasjon (tabell 1). Med unntak av EGF, ekspresjonsnivåene av nesten alle inflammatoriske cytokiner /kjemokiner og vekstfaktorer i TC-1 svulster fra fett-1 mus som var høyere enn de som er, i tumorer fra villtype-kontroller. Dette antydet at anti-inflammatorisk og anti-celle vekst effekter av omega-3 PUFA er lite sannsynlig å være sentral for deres anti-tumor aktivitet, i det minste i denne modellen. Vi undersøkte neste ekspresjonen av MMP’er i disse TC-1 tumorer i ytterligere adresse stroma-relaterte angiogenese i tumor microenvironments (tabell 1). cDNA microarray viste at ekspresjon av MMP-2 og -9 ble undertrykt i fett-1-mus-avledet TC-1 tumor, mens de andre MMP’er var tendens til å bli oppregulert i forhold til kontrollene. For å bekrefte disse effektene på RNA-nivå, ble RT-qPCR for MMP-9 utført. MMP-9-RNA-nivåer i fett-1 mus var omtrent 60% lavere enn i villtype-kontroller (fig. 3A). TC-en svulst immunhistokjemi bekreftet disse resultatene på proteinnivå. MMP-9 immunoreaktivitets i villtype mus-avledet TC-1 svulster var klart sterkere enn fett-1 mus-avledet svulster (Fig. 3B). Høy effekt histokjemisk analyse av MMP-9 immnoreactivity i TC-1-celler (fig. 3B, innsettinger) avslørte neglisjerbare uttrykk, mens det av de stromale komponenter, inkludert kafeer og endotelceller som var sterkt positiv bare på villtype-avledede TC-1 tumorer . Disse data indikerte at produksjon av MMP-9 i kafeer og endotelceller ble klart undertrykt i fett-1 mus.
Total RNA ble ekstrahert fra TC-1 tumorer, etterfulgt av revers transkripsjon. MMP-9-mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR. Uttrykket nivåer av MMP-9 ble normalisert til p-aktin som en indre standard (n = 4 i hver gruppe). Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). MMP-9 farging av TC-1 svulster som stammer fra villtype (WT) og fett-1 mus. Linjene indikerer 200 mikrometer i laveffekts felt, 50 mikrometer i høy effekt felt.
MMP-9 uttrykk og gelatinase aktivitet ble undertrykt i dyrkede primære fibroblaster avledet fra fett-1 mus
For å etterligne kreft stromal mikromiljøet in vitro, co-dyrkede vi fibroblaster isolert fra fett-en og villtype mus med TC-1 celler. Vi brukte lungevev fra fett-1 og villtype-mus som kildene for fibroblaster, og differensial adhesjon metodikk for deres isolering. Alle fibroblaster ble passert 3-4 ganger før bruk i eksperimenter. Baseline MMP-9 uttrykk nivåer i grunnskolen fibroblaster fra fett-1 mus var ca 60% lavere enn de fra villtype-avledet fibroblaster (fig. 4A). Kultursupernatanter fra hver primær fibroblast-subtype, ble oppsamlet og underkastet polyakrylamidgel-elektroforese for å undersøke forskjeller i MMP-gelatinase aktivitet (Fig. 4B). Ved hjelp av denne metoden, ble MMP-2 registreres, men MMP-9 var ikke i både fett-en og villtype fibroblast
(A) Primære fibroblaster isolert fra murine lungene ble dyrket. Total RNA fra fibroblaster ble reverstranskribert og MMP-9-mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR. Uttrykket nivåer av MMP-9 ble normalisert til p-aktin som en intern standard. Dataene er representant for tre uavhengige eksperimenter. Dataene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test. Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). (B) Gelatin zymografi: Supernatant fra primære fibroblastkulturer ble samlet og separert ved elektroforese. Gelatinase aktiviteter ble visualisert ved hjelp av standard fargeteknikker.
Deretter disse primære fibroblaster samtidig var dyrket med TC-1 celler til å undersøke fibroblaster aktivering ved in vitro eksponering for kreftceller
11. Fibroblaster og TC-1-celler ble ko-dyrket i 24 timer og MMP-9-transkripsjon ble målt ved hjelp av RT-qPCR. Fibroblaster fra fett-1 og fra villtype mus økte demonstrert MMP-9-ekspresjon ved eksponering til TC-1-celler (Fig. 5A). I fibroblaster avledet fra fett-1 mus, graden av MMP-9 induksjon var lavere enn den i fibroblaster fra villtype-mus (Fig.5A). MMP-9 ble ikke uttrykt i homotypisk TC-1 celler, i samsvar med immunhistokjemiske data fra vår in vivo modell. Videre bekreftet vi at MMP-9 ble ikke uttrykt i TC-1-celler ved hjelp av en transwell ko-kulturmodell (fig. S2). Derfor, MMP-9 i ko-kulturen tilstand ble avledet ikke fra TC-1-celler, men fra fibroblaster. MMP-2 gelatinase-aktivitet ble påvist i alle cellekulturbetingelser, inkludert homotypisk TC-1-cellekulturer, og ble ikke endret ved ko-kulturbetingelser (fig 5B, 5D). MMP-9 gelatinase aktiviteter var imidlertid påvises i fibroblast-TC-1-celler ko-kulturer, selv om MMP-9 gelatinase aktivitet som involverer fett-1-fibroblaster ble klart undertrykt når sammenlignet med vill-type-fibroblaster (figur 5B, 5C), igjen støtter konseptet som MMP-9 uttrykk og gelatinase aktivitet er undertrykt av endogene omega-3 PUFA i kafeer avledet fra fett en mus.
(A) Isolerte fibroblaster samtidig var dyrket med TC-1 celler i 24 timer og uttrykket nivåer av MMP-9 i fibroblaster ble målt ved hjelp av RT-qPCR. Uttrykket nivåer av MMP-9 ble normalisert til p-aktin som en intern standard. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Dataene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test. Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). «N.d.» indikerer «ikke påvist». (B) Gelatin zymografi: Supernatanter fra fibroblast homotypisk kulturer og fibroblast /TC-1 ko-kulturer ble samlet og separert ved elektroforese. Gelatinase aktivitet ble visualisert ved hjelp av standard fargeteknikker. (C, D) For semi-kvantitative analyser, ble gelatin Zymografi band analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Dataene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test. Stjernene viser disse sammenligningene (fett-1 vs villtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi involvering definerte kostholdsfaktorer (omega-3 og omega-6 PUFA) i tumorigenesis bruker HPV-positive TC-1 celler og foreslått en ny anti-tumor mekanisme for omega-3 flerumettede fettsyrer som er avhengig av aktivitetene til kafeer. Omega-3 PUFA er blitt vist å undertrykke kreftforekomst og vekst i ulike typer av kreft [18], [19], [27]. Mange studier har vist at omega-3 PUFA har disse effekter gjennom anti-inflammatorisk respons direkte og /eller indirekte [25] – [27], så vel som gjennom å indusere tumorcelle apoptose og /eller undertrykke tumorcelleformering [18], [19 ]. Imidlertid har det vært få rapporter om virkningene av omega-3 PUFA på kafeer. Kafeer har vært innblandet i å tilrettelegge veksten av flere svulster ved direkte stimulering av tumor celleproliferasjon og ved å styrke angiogenese [34], [35]. Målrette gener og signalveier medierende samspill av kafeer og tumor-mikromiljøet anses å være avgjørende for utvikling av nye og effektive kreft terapi [36], [37]. I denne studien bruker fett-1 mus og TC-en kreftceller, var vi i stand til å avklare effekten av omega-3 PUFA-rik kafeer på tumorigenesis.
Mange molekyler, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, og MMP, spille stimulerende og hemmende roller i å fremme angiogenese [21]. Vi undersøkte genekspresjon av angiogenese-relaterte cytokiner, vekstfaktorer og MMP’er i TC-1 svulster i fett-1 og villtype-mus av cDNA microarray. Uttrykket nivåer av nesten alle inflammatoriske cytokiner /kjemokiner og vekstfaktorer i TC-1 tumorer fra fett-1 mus som var høyere enn de i svulster fra villtype-kontroller. I motsetning til dette, EGF og MMP-2 og -9 uttrykk nivåer i fett-1 mus som var lavere enn i villtype-mus. Siden nedregulering av EGF i TC-1 tumorer fra fett-1 mus ble anslått å fremme TC-1-celle-proliferasjon, men tumorstørrelse i fett-1 mus var signifikant mindre enn i villtype-kontroller, hypoteser om vi at forskjellene i MMP produksjons mellom fett-1 og villtype-mus kan være ansvarlig for undertrykkelse av TC-1 tumorvekst. Våre in vitro data bekreftet at MMP-9 avledet fra kafeer aktiveres av TC-en celle eksponering ble nedregulert i fett-1 mus. MMP’er er rapportert å påvirke tumorprogresjon ved å lette drei arrangementer for neovaskularisering og for etablering av fjernmetastaser, inkludert spredning, overlevelse og migrering av endotelceller, tumor og stromale celler [8], [9]. MMP-inhibitorer redusere angiogenese, tumor-nummer, og tumorvekst, som gjør genetisk ablasjon av MMP-9 [38]. I motsetning til MMP-2, som blir konstitutivt uttrykt, MMP-9 nivåer er vanligvis lav, og enzym ekspresjon induseres av cytokiner som stimulerer NF-kB [8], [39]. Videre er forhøyet i serum og vev nivåer av MMP-9 rapportert å være assosiert med kreft invasjon og metastase [40]. I brystkreft, har MMP-9 aktivitet blitt lokalisert rundt kafeer og kafeer co-dyrket med kreftceller som skiller ut TGF-β, TNF-α og andre cytokiner, øke produksjonen av MMP-9 [11], i tråd med vår in vitro data. I våre data, undertrykkelse av MMP-9 vil bidra til å følge med hypo-angiogenese i tumoren stromal komponent i fett en tumor.
Flere transkripsjonsfaktorer, inkludert aktivator protein-1 (AP-1), SP- 1, og NF-kB, er rapportert å være involvert i endringer i MMP-9-ekspresjon etter eksponering for forskjellige cytokiner [41] – [43]. Omvendt har flere rapporter vist at omega-3 PUFA har en hemmende effekt på NF-kB veien når den aktiveres ved hjelp av forskjellige stimuli [43] – [47]. Våre egne data antyder at aktivering av NF-kB veien ved ko-kultur med TC-1-celler kan undertrykkes ved forhøyet nivå av omega-3 flerumettede fettsyrer i fibroblaster oppnådd fra fett-1 mus.
I våre forsøk vi konsekvent brukt primære fibroblaster som hadde blitt dyrket 3-4 ganger bare. Ikke desto mindre lipid mediator analyse av fibroblaster viste at de som er avledet fra fett-1 mus som produseres større mengder av omega-3 flerumettede fettsyrer, inkludert EPA-avledede metabolitter sammenlignet med de som er avledet fra villtype-kontroller (Fig.S3), noe som bekrefter at de dyrkede fibroblaster beholdt den karakteristiske å lage omega-3 PUFA rikt miljø.
TC-1 svulst microarray data viste at flere inflammatoriske cytokiner /chemokiner og vekstfaktorer ble oppregulert i fett-1 mus. Men dataene indikerte genekspresjon nivåene i både TC-1-celler og stromale komponenter, inkludert fibroblaster, endotelceller og immunceller. Derfor uttrykk nivåer av hver cytokin /chemokin var avhengig av sine viktigste kildene til produksjon. MMP-9 ble produsert av fibroblaster avledet fra fett-1 mus, men ikke fra TC-1-celler. Derfor kan undertrykkelse av NF-kB veien ved forhøyede nivåer av omega-3 flerumettede fettsyrer i fett-1-avledede stromale komponenter har en bestemt og potent effekt på MMP-9-ekspresjonsnivåer i forhold til de andre inflammatoriske cytokiner /kjemokiner. På den annen side, viser en tidligere studie at omega-3 PUFA aktivere NK-celler og øke andelen av aktiverte CD8 + celler; Dette er etterfulgt av forbedrede anti-tumoreffekter [48]. Derfor kan omega-3 PUFA utøve både anti-inflammatorisk og pro-inflammatoriske effekter på immunceller.
I denne studien, har vi vist at en omega-3 PUFA-rike mikromiljøet kan undertrykke MMP-9-sekresjon fra kafeer og at dette er forbundet med påfølgende tumor hypo-angiogenese. Denne studien foreslår en ny anti-tumor effekt av omega-3 flerumettede fettsyrer ved å modulere svulstens mikromiljø spesielt på kafeer.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression nivåer av E6 og E7 mRNA i TC-en svulst. Total RNA ble ekstrahert fra TC-1 tumorer, etterfulgt av revers transkripsjon. E6 og E7 mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR. Ekspresjonsnivåene av E6 og E7 mRNA ble normalisert til p-aktin som en intern standard. De E6 primere var fremover, 5’TGCACAGAGCTGCAAACAAC -3 «, og omvendt, 5’AGCATATGGATTCCCATCTC -3». De E7 primere var fremover, 5’TTTGCAACCAGAGACAACTGA -3 «, og omvendt, 5’GCCCATTAACAGGTCTTCCA -3»
doi:. 10,1371 /journal.pone.0089605.s001 plakater (TIF)
Figur S2 .
MMP-9 mRNA ble ikke indusert fra TC-1 celler ved co-kultur med fibroblaster.
