Abstract
For å bedre forstå prostata funksjon og sykdom, er det viktig å definere og utforske de molekylære bestanddeler som kjennetegner prostatakjertelen. Målet med denne studien var å definere den prostata spesifikt transkriptomet og proteom-, i forhold til 26 andre menneskelige vev. Deep sekvensering av mRNA (RNA-seq) og immunhistokjemi-baserte protein profilering ble kombinert for å identifisere prostata spesifikt genuttrykksmønster og å utforske vev biomarkører for potensiell klinisk bruk i prostata kreftdiagnostikk. Vi identifiserte 203 gener med forhøyet uttrykk i prostata, 22 av disse viste mer enn fem ganger høyere uttrykk nivåer sammenlignet med alle andre typer vev. I tillegg til tidligere kjente proteiner identifiserte vi to dårlig karakteriserte proteiner, TMEM79 og ACOXL, med mulighet for å skille mellom godartede og cancerøse prostatakjertler i vevsbiopsier. Avslutningsvis har vi brukt et genom-wide analyse for å identifisere prostata spesifikt proteomet hjelp transcriptomics og antistoffbasert protein profilering for å identifisere gener med forhøyet uttrykk i prostata. Våre data gir et utgangspunkt for videre funksjonelle studier for å utforske den molekylære repertoar av normal og syk prostata inkludert potensielle prostatakreft markører som TMEM79 og ACOXL
Citation. O’Hurley G, Busch C, Fagerberg L, Hallström BM, Stadler C, tolf A, et al. (2015) Analyse av menneskelige prostata-spesifikt Proteome Definert av transcriptomics og antistoffbaserte Profilering Identifiserer TMEM79 og ACOXL som To Antatte, diagnostiske markører i prostatakreft. PLoS ONE 10 (8): e0133449. doi: 10,1371 /journal.pone.0133449
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 10 april 2015; Godkjent: 25 juni 2015; Publisert: 03.08.2015
Copyright: © 2015 O’Hurley et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Finansieringen ble gitt av Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen og den svenske Cancer Foundation og av Marie Curie Industry-Academia Partnerships and Pathways program, FAST-PATH ( No. 285910). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. OncoMark Ltd gitt støtte i form av lønn for forfatteren GOH, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. OncoMark Ltd gitt støtte i form av lønn for forfatteren GOH. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
prostataspesifikt antigen (PSA) har dukket opp som en nyttig svulst markør i onkologi og PSA-baserte screening blir mye brukt til tross for en relativ mangel på både spesifisitet, noe som fører til diagnostikk og behandling av tidlig stadium prostata cancer, og følsomhet, som fører til prostatakreft ikke oppdages tidlig nok [1-5]. Således er det et behov for bedre markører for tidlig påvisning av prostatakreft.
PSA er en serin protease og en av tre mest rikelige proteiner utskilt fra prostatakjertelen [6]. I ondartet prostata, er vevsarkitektur unormal som letter PSA lekkasje til blodkar i stromal rommet. Ikke-maligne tilstander, inkludert prostata prostatitt og benign prostatahyperplasi (BPH), kan føre til forhøyet serum PSA, noe som begrenser spesifisiteten av PSA høyde for diagnose av kreft [7]. Dermed avgjøre hvilke pasienter krever ytterligere undersøkelser med transrectal ultralyd (TRUS) -Guidede biopsier er fortsatt et betydelig problem.
Flere andre markører har vært innblandet som potensielle biomarkører for prostatakreft, som for eksempel alfa-methylacyl koenzym A racemase ( AMACR) som har vist seg å være signifikant oppregulert i prostatakreft og påvisbar i både serum og kreftvev. Andre slike diagnostiske biomarkører inkluderer prostata carcinom mucin-like antigen (PMA), GOLM1, fettsyre syntase (FASN), TMPRSS2-ERG fusjon prostatakreft antigen 3 (PCA3), KLK3, KLK2, HOXB13, GRHL2 og FOXA1 [8-12] . Men up-to-date, har ingen individuell markør bevist bedre enn PSA.
Prostatakreft er diagnostisert basert på histopatologisk undersøkelse av flere trus-guidet prostata kjerne biopsier. Identifiseringen av kreft i prostata er utsatt for subjektivitet og feil på grunn av avhengigheten av menneskelig tolkning og at biopsi bare gi en liten mengde av vev, som ofte inneholder bare noen få ondartede kjertler og histologiske godartede etterligner av kreft. Oppdagelsen av en spesifikk markør for enten prostatakreft eller godartet prostatakjertler som også kan måles i serum ville være fordelaktig for å unngå invasive diagnostiske tester.
Tolkningen av kvantitative transcriptomics data basert på mRNA sekvensering av vevsprøver er en utfordring på grunn av heterogeniteten av celletyper som utgjør forskjellige vevstyper. Her har vi analysert gener uttrykt i normal menneskelig prostata og sammenlignet disse data til trancriptomes av 26 andre menneskelige vevstyper normale basert på nylig publiserte RNA-seq data [13]. Den transcriptomics Analysen ble kombinert med immunhistokjemi-baserte protein profildata som er tilgjengelige fra Humant protein Atlas (www.proteinatlas.org) [14, 15] for å tilveiebringe et kart av genekspresjon på både RNA og proteinnivå i prostata. Uttrykket mønster av to proteiner som er kodet fra tidligere uncharacterized gener, TMEM79 og ACOXL, med forhøyet uttrykk i prostatakjertelen ble ytterligere analysert ved hjelp av microarray (TMA), inkludert normal prostata og prostatakreft, å utforske sin potensielle verdi som diagnostiske biomarkører.
Materialer og metoder
vevsprøver
Dypfryst menneskelig vev som representerer 27 forskjellige normale menneskelige typer vev ble inkludert i RNA-seq analyse som tidligere beskrevet [13], inkludert 4 prøver av prostatavevet. Morfologisk normale, ikke-kreft prostata vev ble samplet fra prostatektomi prøver som stammer fra (alder 62-68 y) 4 mannlige pasienter med lokalisert prostatakreft.
Formalin fast, parafin innebygd (FFPE) menneskelige vevsprøver ble samlet inn fra den kliniske Avdeling for patologi, Uppsala universitetssykehus, Uppsala, Sverige og satt sammen til TMA. TMA ble laget og anvendt for protein profilering som tidligere beskrevet [16]. Screeningen TMA inneholdt 1 mm kjerner av 46 forskjellige normale vev i tre eksemplarer, inkludert tre normale prostata prøver, og 216 kreft vev som representerer de 20 mest vanlige krefttyper, inkludert 12 tilfeller av prostatakreft [17]. De fire validering TMA inneholdt normal og kreft prostata vev; detaljene for hver validering TMA er vist i tabell 1, og er blitt beskrevet tidligere [18, 19]. Prostata intraepitelial neoplasi ble ekskludert fra denne studien.
Alle menneskelige vevsprøver som brukes for RNA-seq og screening av protein uttrykk ble anonymisert og brukt i samsvar med godkjenning og rådgivende rapport fra Uppsala Ethical Review Board (Annonse # 2002 -577, 2005-338 og 2007-159 (protein) og # 2011-473 (RNA)). Validerings TMA kohorter ble godkjent av The Central Ethical Review Board i Sverige (Dnr Ö25-2006, dato 2006-06-29) og Regional Etisk Review Board ved Lunds Universitet, Sverige (godkjenningsnummer DN. 445-07). Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.
transkripsjon profilering (RNA-seq) og dataanalyse
Transcriptomic profilering har blitt beskrevet tidligere [13]. Kort, hematoksylin-eosin (HE) farget frysesnitt (4 mikrometer) ble fremstilt fra hver prøve ved hjelp av en cryostat og CryoJane Tape-Transfer System (Instrumedics, St. Louis, MO, USA) og anmeldt av en patolog for å sikre riktig vev morfologi. Tre 10 um snitt ble kuttet fra hvert frossent vev blokk og homogenisert før ekstraksjon av total RNA ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ved å følge produsentens instruksjoner. De ekstraherte RNA-prøvene ble analysert ved anvendelse av enten et Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, USA) med RNA 6000 Nano Labchip Kit eller en Experion® automatisert elektroforese system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med standard -sensitivity RNA chip. Bare prøver av høy kvalitet RNA (RNA Integrity Number ≥7.5) ble brukt i det følgende mRNA prøvepreparering for sekvensering. Illumina HiSeq2000 og 2500 maskiner (Illumina, San Diego, CA, USA) ble brukt til å utføre mRNA sekvensering ved hjelp av standard Illumina RNA-seq protokoll med en lese lengde på 2×100 baser.
Raw leser hentet fra sekvenseringssystem ble trimmet for lav kvalitet ender med programvaren sigd. En Phred kvalitetsterskel på 20 ble anvendt. Leser kortere enn 54 bp etter trimming ble forkastet. Den behandles leser ble kartlagt til GRCh37 versjon av det menneskelige genom med Tophat v2.0.3 [20]. Potensielle PCR duplikater ble eliminert anvende MarkDuplicates modul av Picard 1.77. For å oppnå kvantifisering score for alle 20,050 humane protein-kodende gener, FPKM (fragmenter pr kilobase av exon modell per million kartlagt leser) verdiene ble beregnet med Cufflinks v2.0.2 [20], som korrigerer for transkripsjon lengde og det totale antall tilordnede leser fra biblioteket for å kompensere for ulike lese dybder for forskjellige prøver. Den gjennomsnittlige andelen vellykket kartlagt leser var 77%. Genet modeller fra Ensembl bygge 69 [21] ble brukt i mansjettknapper. I tillegg til mansjettknapper, ble HTSeq v0.5.1 kjørt for å beregne lese teller for hvert gen, som ble anvendt for analyser av differensielt uttrykte gener som benytter de DESeq pakken [22]. Alle data ble analysert med R Statistiske Environment [23] og en nettverksanalyse ble utført ved hjelp Cytoscape 3.0 [24]. For analyser utført i denne studien hvor en log2-skala av dataene ble brukt, pseudo-tellinger av 1 ble lagt til i datasettet.
spesifisitet klassifisering
Den gjennomsnittlige FPKM verdi i det hele tatt prøver for et bestemt vev ble anvendt for å beregne den totale genekspresjon nivå. En cut-off-verdi på 1 FPKM, omtrent svarende til et gjennomsnitt på 1 mRNA-molekyl per celle, ble definert som påvisningsgrensen [25]. Hver av 20,050 gener ble klassifisert i en av ni kategorier basert på uttrykksmønster i prostata i forhold til alle andre vev (tabell 2)
Antistoff validering. SiRNA transfeksjon, immunfluorescens, bildebehandling og statistisk analyse
Utvidet antistoff validering til det som er fastsatt på HPA database (www.proteinatlas.org) for alle proteiner, ble utført for å ytterligere verifisere spesifisitet av de primære antistoffer mot TMEM79 (HPA055214) og ACOXL (HPA035392 ). Dette ble utført ved hjelp av siRNA-baserte knock-down av genuttrykk. U-2 OS og MCF-7 celler ble anvendt for siRNA knock-down eksperimenter av ACOXL og TMEM79. U-2 OS celler ble dyrket i McCoy media supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og MCF-7-celler i EMEM supplert med 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) og 1% L-glutamin ( alt fra FisherScientific, Stockholm, Sverige).
på dagen for transfeksjon ble 10.000 U-2 OS celler eller 12.000 MCF-7 celler sådd ut i 96-brønners glassbunnplatene (VWR, Stockholm, Sverige) pre -belagt med fibronektin. Etter celle vedlegg, ble medium erstattet med 100 ul Optim-MEM som inneholder 0,5 mikroliter Lipofectamine 2000 (kat. No 11668019, Life Technologies) og 2,5 pmol ACOXL siRNA (Silencer Velg Pre-designet siRNA produkt s30651, Life Technologies) eller TMEM79 siRNA (Silencer Velg Pre-designet siRNA produkt s228349, Life Technologies). En egge siRNA sekvens (Silencer Velg Negativ kontroll nr. 1, kat. 4390843, Life Technologies) ble brukt som negativ kontroll og AllStar (SI04381048, Qiagen) ble brukt som en positiv kontroll for å sikre en vellykket transfeksjon.
etter 72 timer med inkubasjon ble cellene fiksert ved bruk av 4% paraformaldehyd (PFA) og permeabilisert ved anvendelse av 0,1% Triton X-100 som tidligere beskrevet [26]. Cellene ble farget med antistoffer rettet mot ACOXL eller TMEM79, både i en konsentrasjon på 2 ng /ul. Celler ble også farget med et antistoff rettet mot mikrotubuli (ab7291, Abcam) ved en konsentrasjon på 3 ng /mL, og med den nukleære sonden 4 «, 6-diamidini-2-fenylindol (DAPI) ved en konsentrasjon på 300 nM for å aktiver automatisert bildebehandling og kvantifisering av den reduserte fargeintensitet.
bildebehandling og analyse lese ut av siRNA forsøk ble gjort som beskrevet tidligere [27]. Knock-down ble målt som relativ fluorescens intensitet (RFI) sammenlignet med den negative kontroll. Dataene ble presentert grafisk i bokser-plott og en Mann-Whitney-test ble anvendt for å vurdere betydningen av median RFI av taushet cellepopulasjon sammenlignet med RFI av den tilsvarende negativ kontroll.
antistoff-baserte vev profilerings
TMA ble kuttet i 4 mikrometer tykke seksjoner og benyttes for immunhistokjemisk farging, som tidligere beskrevet [16]. De immunohistochemically fargede og monterte lysbilder ble skannet med en Aperio ScanScope XT Slide skanner (Aperio Technologies, Vista, CA) for generering av høyoppløselige digitale hele lysbildene, etterfulgt av annotering av sertifiserte patologer. I korte trekk, ble den manuelle stillingen av IHC-baserte proteinekspresjon for alle proteiner vist bestemt som den fraksjon av positive celler er definert i forskjellige vev: 0 = 0-1%, 1 = 2-25%, 2 = 26-75%, 3 75% og intensitet av immunreaktivitet: 0 = negativ 1 = svak 2 = moderat, og 3 = sterk farging. Alle merknader og immunhistokjemiske data for screening TMA sammen med validering av data for alle primære antistoffer er offentlig tilgjengelig i Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) [28]. Primære antistoffer som brukes for farging av validerings TMA inkludert HPA055214 (fortynning 1: 250) for påvisning av transmembranprotein 79 Tmem 79) og HPA035392 for påvisning av acyl-CoA oksidase-lignende protein (ACOXL) (fortynning 1:. 1000)
Skåring eller TMEM79 og ACOXL proteinekspresjon
immunreaktiviteten av TMEM79 ble vurdert i membranen og cytoplasma, og av ACOXL i cytoplasma av epitelceller i prostata. Antistoffer som tilsvarer begge proteiner var immunohistochemically farget og utfallet ble analysert på alle validering TMA. Anledninger ble utført ved to uavhengige observatører (GOH, CB)
For formålet med statistisk analyse, ble immunhistokjemisk fargingsmønsteret av begge antistoffene gradert i henhold til følgende skala:. 0, fraværet av reaktivitet, 1, svak men klart påviselig reaktivitet i 30% av epitelceller, 2, moderat reaktivitet i 30% av epitelceller og 3, sterk reaktivitet i 30% av epitelceller
Statistical Analysis
For statistisk analyse av TMEM79 og ACOXL uttrykk versus histopatologiske funksjoner, ble fargeintensitet av epitelcellene delt inn i to grupper:. Lavt uttrykk (immunhistokjemiske poengsum fra 0 eller 1) inkludert tilfeller med negativ eller svak farging, og høy ekspresjon (immunohistokjemisk score på 2 eller 3), inkludert tilfeller med moderat eller sterk farging. Pearson Chi kvadrat tester og Spearman og Pearson korrelasjonstester ble utført for å teste sammenhengen mellom protein uttrykk og histopatologiske funksjoner på to-veis krysstabeller. Diagnostiske ytelseskriterier ble testet ved å generere ROC kurver. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og multivariat Cox regresjonsanalyse ble også utført på en undergruppe av pasienter, hvor biokjemisk tilbakefall (BCR) data var tilgjengelig (N = 148), for å analysere sammenhengen mellom BCR og protein uttrykk, serum PSA verdi før prostatektomi og Gleason score. Alle beregninger ble utført med IBM SPSS 20 for Windows (SPSS, New York, NY, USA).
Resultater
Den transcriptomic analyse av prostatavevet
transcriptomes av fire prostata prøvene ble kvantifisert ved RNA-seq og normaliserte mRNA-nivåer, beregnet som FPKM verdier [13], ble bestemt for hver prøve. Totalt 14,040 gener ble påvist i prostata, med en cutoff av middel uttrykk verdi 1 FPKM. Således ble omtrent 70% av alle antatte protein-kodende gener (n = 20 050) detektert i prostata. Fordelingen av FPKM verdier (mRNA expression nivåer) varierte fra 0 FPKM opp til 8238, noe som gir et dynamisk område på 10
4
mellom høyeste og laveste uttrykte gener. De 30 gener med de høyeste nivåene av uttrykk i prostata er oppført i S1 tabell. Et flertall av disse genene koder for proteiner med «vaktmester» funksjoner uttrykt i alle analyserte vev.
Den biologiske variasjon mellom de fire individuelle prostata prøvene ble analysert ved å sammenligne uttrykket nivåer av alle proteinkodende gener i parvise scatterplots. Korrelasjonen generelle var høy med Spearman koeffisienter som strekker seg fra 0,98 (Fig 1 A) til 0,91, med en gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient på 0,96 for alle de fire prøvene prostata. Disse resultatene viser lav inter-individuell variasjon over genom-wide uttrykk mønster og demonstrere høy teknisk reproduserbarhet mellom prostata prøvene. Som forventet, ble det observert en høyere grad av variasjon når tilsvarende sammenligninger ble utført mellom prostata og andre typer vev. Den beste korrelasjon ble observert mellom prostata og testikkel med en Spearman koeffisient på 0,72 (figur 1B), mens vevet med den høyeste likhet med prostata ble endometrium med en Spearman koeffisient på 0,92 (figur 1C).
Genekspresjon scatterplots viser alle FPKM verdier og de parvise Spearman og Pearson korrelasjonskoeffisienter mellom: (A) de to prostata prøvene med høyest korrelasjonskoeffisient, (B) den laveste sammenheng til en annen vevstype (prostata vs. testis prøver), og (C) den høyeste korrelasjon til en hvilken som helst annen type vev (prostata vs. endometrium). (D) piechart som viser fordelingen av den fraksjon av alle humane protein-kodende gener i hver av kategoriene, basert på karakter uttrykk nivåer i prostata, sammenlignet med alle andre vev.
Klassifisering av genene uttrykkes i prostata
transcriptomics data innhentet fra de 27 vev aktivert oss å klassifisere alle de 20,050 proteinkodende gener inn i fire hovedkategorier, først basert på deres uttrykk nivåer i prostata (fig 1D). Disse hovedkategorier inngår i) gener som ikke ble oppdaget i prostata (30%), ii) gener som viste en blandet uttrykksmønster, er uttrykt i flere, men ikke i alle vevstyper (23%), iii) gener som ble uttrykt i alle vev og dermed karakteriseres som «vaktmester» gener (46%) og iv) gener med et forhøyet nivå av uttrykk i prostata i forhold til andre typer vev (1%). Deretter de 203 genene innenfor kategorien iv, som viste en forhøyet uttrykk mønster i prostata, ble videre delt inn i fire andre underkategorier avhengig av graden av vev spesifisitet.
Seks gener ble definert som høyanriket i prostata (tabell 3 ), karakterisert som det høyeste nivået av vev-spesifisitet med minst 50-ganger høyere FPKM nivået i prostata sammenlignet med alle andre vev type. Seksten gener ble definert som moderat anriket i prostata (tabell 3), med minst 5 ganger høyere FPKM nivået i prostata sammenlignet med alle andre vev; 85 gener ble definert som gruppe anriket (S2 tabell), med 5-ganger høyere gjennomsnittlig FPKM nivå i en gruppe med 2-7 vev, inkludert prostata sammenlignet med alle andre vev; og 96 gener ble prostata forbedret (S3 tabell), definert som å ha en 5 ganger høyere FPKM nivået i prostata, sammenlignet med den gjennomsnittlige FPKM verdien av alle 27 vev. To godt studert gener i prostata, SLC45A3 og MSMB, ble identifisert i denne kategorien.
Et nettverk plott av gruppe beriket gener i prostata er presentert i figur 2, som viser antall gener deles mellom en bestemt gruppe av vev (opp til fire forskjellige vev) samt antall svært og moderat vev anrikede gener i prostata. Ut av de 27 vevstyper analysert, 22 vevstyper hadde felles gruppe beriket gener med prostata. Vevstype med de fleste gruppe anriket gener i likhet med prostata er spiserøret (n = 15), etterfulgt av testiklene (n = 6), hjerne og hjerte (n = 5). De delte gener mellom esophagus og prostata domineres av gener som blir uttrykt i forskjellige muskel-celler, som er inkludert i veggen av spiserøret og som er integrert i prostata.
Grupper av uttrykte gener er representert som blå sirkel noder og knyttet til de respektive beriket vev representert som grå sirkler. Størrelsene på nodene er knyttet til antall beriket gener. Den lyseblå sirkelen viser totalt antall høyt og moderat vev beriket gener. Nettverket representerer en oversikt over de grupperte beriket gener med maksimalt 4 vev kombinert.
Antistoff basert profilering av prostata spesifikke gener
Genene med forhøyet uttrykk i prostata (n = 203) ble evaluert ved hjelp av den elektroniske Humant protein Atlas database (HPA, www.proteinatlas.org) for å sammenligne de kvantitative RNA-seq data med romlige uttrykk data av tilsvarende proteinnivåer. For ytterligere å utforske protein uttrykk mønstre i prostata av dette settet av proteiner, som inkluderer både tidligere godt studert, så vel som uncharacterized proteiner, ble immunhistokjemisk farging visuelt bedømt med hensyn til benign prostata spesifisitet og cellulær fordeling. Eksempler på ekspresjonsmønstre i normal prostata av proteiner med forhøyet ekspresjon i prostata er vist i figur 3.
Eksempler på ekspresjon i godartede kjertelceller er vist for et subsett av proteiner som svarer til gener med forhøyet ekspresjon i prostata. Scale, 100 mikrometer.
Forskjellig uttrykte proteiner i godartet og ondartet prostatavevet
transmembranprotein 79 (TMEM79).
Differensial protein uttrykk i godartet prostatavevet versus prostata kreftvev ble deretter evaluert for uncharacterized gener som validerte antistoffer som er rettet mot de tilsvarende proteiner var tilgjengelig.
TMEM79
, med bevis for eksistensen bare på karakterutskriften nivå i henhold til Uniprot [29], ble identifisert som en «gruppe beriket» gen med en FPKM verdi av 39 i prostata. TMEM79 genekspresjon ble også observert i spiserøret (54 FPKM) og huden (65 FPKM) på et høyere nivå enn i prostata (se S2 tabell). Men på proteinnivået TMEM79 viste en mer distinkt immunoreaktiviteten hos normale prostatakjertler, sammenlignet med den uttrykksmønster i skjellepitel i hud, spiserør, oral mukosa, vagina og cervix. Membranøs sterk farging ble observert i 3/3 godartet prostatavevet tilfeller, mens det ikke var noen tydelig membranfarging i tumorceller fra 12/12 tilfeller av prostatakreft (bilder av immunfargete normale og kreft prostata vev er tilgjengelig på www.proteinatlas.org og i figur 4).
(A) TMEM79 membran uttrykk i en godartet kjertel med mangel på TMEM79 uttrykk i rundt svulsten. (B) To IHC-farging av TMEM79 (rød) og TP63 (blå basalcelle farging) i en godartet kjertel. (C) Mangel på TMEM79 protein uttrykk i prostatakreft (Gleason grad 3). (D) Mangel på TMEM79 protein uttrykk i prostata metastatisk tumor (Bone metastase). Scale, 100 um.
For å validere de innledende protein screening resultater observert for TMEM79 i prostata, IHC ble utført på fire uavhengige prostatakreft kohorter. Vev fra 333 tilfeller var tilgjengelige for analyse (156 godartet tilfeller, 162 primærprostatakrefttilfeller og 15 metastatisk prostatakreft tilfeller). Omtrent 81% (127/156) av godartede prostata vevsprøver viste en positiv membran uttrykk for TMEM79 og ca 84% (148/156) av prostata kreft vevsprøver uttrykte ikke TMEM79 (tabell 4). Således viste TMEM79 en høy følsomhet (81%) og spesifisitet (84%) for å skjelne benigne prostatakjertler fra prostata kreft. For å vurdere statistisk hypotesen om at positive TMEM79 uttrykk er omvendt assosiert til prostatakreft, ble en to-veis beredskaps bord satt opp (tabell 4), som er klassifisert testvariablene i kategorier; godartet vev versus tumor (Gleason grad 2-5 og metastase). Til statistisk vurdere diagnostiske ytelseskriterier for TMEM79 en ROC kurve ble generert (S1 Fig) som produserte en AUC verdi av 0,825 og en betydelig
P-verdi
av 0.000 indikerer at TMEM79 er en god diagnostisk test for å skille mellom godartede kjertler og svulst i prostata. Ingen sammenheng mellom BCR, serum PSA verdi før prostatektomi, Gleason score og TMEM79 uttrykk ble observert ved enten Kaplan-Meier overlevelsesanalyse eller multivariat Cox regresjonsanalyse på undergruppe av 148 pasienter som ble analysert.
Acyl- CoA oxidase-lignende protein (ACOXL).
i likhet med TMEM79 ble ACOXL identifisert som en roman vev markør av benign prostata etter screening av protein uttrykk i human protein Atlas. I motsetning til den membran ekspresjon av TMEM79, ACOXL viste en sterk granulært, cytoplasmatisk ekspresjon mønster i benign prostatakjertler.
ACOXL
ble identifisert som en «gruppe beriket» genet også med en FPKM verdi av 3 i prostata vev. Andre vev som ble klassifisert som «gruppe beriket» for ACOXL genet var lunge (15 FPKM), urinblæren (13 FPKM) og testis (4 FPKM). Farging av ACOXL protein viste en sterk granulært, cytoplasmatisk farge også i bronkiene og egglederen, så vel som en svakere og diffus fargemønster i lunge, hud, galleblæren, spyttkjertel, skjoldbruskkjertelen, binyrene, vagina og hjerne.
3/3 godartet prostatavevet tilfeller viste en positiv farging for ACOXL uttrykk og ingen farging ble observert i 8/12 prostatakreft (se figur 5 og www.proteinatlas.org for bilder av immunostained normal og kreft prostata).
(A) Granular, cytoplasmatisk ekspresjon av ACOXL i en benign prostatahyperplasi. (B) Mangel på ACOXL protein uttrykk i prostatakreft (Gleason grad 3). (C) En mangel på ACOXL protein ekspresjon i prostata metastatisk tumor (lymfeknutemetastase). (D) Granular, cytoplamic ekspresjon av ACOXL i en godartet kjertel med mangel på ekspresjon TMEM79 i området tumor. Scale, 100 um.
IHC ble videre utført på de fire uavhengige prostatakreft kohorter. Omtrent 86% (132/154) godartet prostata vevsprøver hadde positive cytoplasma ACOXL uttrykk og prostatakreft vevsprøver ca. 72% (129/179) uttrykte ikke ACOXL, noe som tyder på en høy spesifisitet og sensitivitet også for ACOXL å identifisere godartet prostata kjertler.
En lignende beredskap bord og statistiske analyser som ble gjort for TMEM79 ble utført på ACOXL data (tabell 5). Både Pearson og Spearman korrelasjoner viste også at det er en moderat invers sammenheng mellom membran ekspresjon av TMEM79 og prostatakreft. Skille svulsten kategorien til Gleason karakterer og metastatiske svulster viste en trend for redusert ACOXL uttrykk i mer avanserte og aggressive svulster. Ingen sammenheng mellom BCR og ACOXL uttrykk i prostata kreft vev ble observert. Til statistisk vurdere diagnostiske ytelseskriterier for ACOXL en ROC kurve ble generert (S1 Fig) som produserte en AUC verdi av 0,788 og en betydelig
P-verdi
av 0.000 indikerer at ACOXL er en god diagnostisk test for å skille mellom godartede kjertler og svulst i prostata. Ingen sammenheng mellom BCR, serum PSA verdi før prostatektomi, Gleason score og ACOXL uttrykk ble observert ved enten Kaplan-Meier overlevelsesanalyse eller multivariat Cox regresjonsanalyse på undergruppe av 148 pasienter som ble analysert.
Antistoff validering for Rabbit Polyklonale anti-TMEM79 (HPA 055 214) og kanin polyklonale anti-ACOXL (HPA035392)
for å vurdere spesifisitet av de primære antistoffer rettet mot ACOXL (HPA035392) og TMEM79 (HPA055214), målet proteinene ble slått ned ved hjelp av siRNA i U-2 OS og MCF-7-celler, og analysert ved hjelp av immunfluorescens (S2 fig). Den immunfluorescens farging av ACOXL viste en i hovedsak cytoplasmatisk fargemønster som ble signifikant redusert etter stanse av den tilsvarende transkript i begge U-2 OS og MCF-7-celler, noe som indikerer en spesifikk binding av ACOXL antistoffet til det tilsiktede mål-proteinet med en RFI av 58 og henholdsvis 70% (S2 figur).
for TMEM79, ble en signifikant reduksjon i fargeintensitet observert i begge cellelinjer (RFI på 74 og 70% for U-2 OS og MCF-7), også noe som indikerer en spesifikk binding av antistoff til protein TMEM79 (S2 fig). I tillegg til farging i cellemembranen, som vist med IHC, ble immunofluorescens flekker som finnes i nucleoli. Ytterligere billedanalyse av kjernefargeintensitet, viste en svak nedgang i dempede cellene sammenlignet med kontrollene (data ikke vist). Men denne nedgangen var ikke signifikant.
Diskusjon
Strøm kliniske biomarkører for prostatakreft mangler spesifisitet og sensitivitet å pålitelig skille aggressive versus ikke-aggressiv prostatakreft [2-5]. Dermed avgjøre hvilke pasienter trenger behandling og stratifisering av pasienter som har nytte av aggressive behandlingsstrategier fortsatt en diagnostisk og klinisk dilemma.
Mens store fremskritt i proteomikk og metabolomic forskning har blitt sett i det siste tiåret produsere potensielle biomarkører for kreft de fleste har ikke klart å erstatte eksisterende markører grunn av mangel på merverdi [30]. Et konkret tilnærming til å oppdage og identifisere spesifikke biomarkører er å søke etter proteiner som er spesielt uttrykt i vevet av interesse før søker etter slike diskriminerende proteiner i blodet eller urinen [31].
I motsetning til andre tidligere utgitt vev spesifikke uttrykk studier, kombinert vi en state of the art RNA-seq datasett som beskriver prostata spesifikt transkriptomet med tilsvarende
in situ
protein uttrykk i benign prostata. Vår RNA-seq analyse identifisert 6 høyanriket gener i prostata, 16 moderat beriket gener, 85 gruppe beriket gener og 96 prostata forbedret gener.
