Abstract
HPV DNA integrert inn i vertsgenomet er et karakteristisk, men ikke en eksklusiv trinn i løpet av cervical carcinogenesis. Det er fortsatt et spørsmål om debatten om viral integrasjon bidrar til transformasjonsprosessen utover å sikre konstituerende uttrykk for de virale onkogener. Det er montering bevis for en ikke-tilfeldig fordeling av integrasjon loci og direkte involvering av cellulære kreftrelaterte gener. I denne studien rettes vi dette emnet ved å utvide eksisterende datasettet med ytterligere 47 HPV16 og HPV18 positive livmorhalskreft. Vi gir støttende bevis for tidligere definerte integrering hotspots og har avdekket en annen klynge av integrasjons områder innenfor cytogenetisk bandet 3q28. Videre, i nærheten av disse hotspots tallrike microRNAs (mirnas) er plassert, og kan bli påvirket av den integrerte HPV DNA. Ved å sammenstille våre data og publiserte rapporter 9 gener kan identifiseres som ble rammet av HPV integrering minst to ganger i uavhengige svulster. I noen tumorer de viral-cellefusjons transkripter var selv identisk med hensyn til viral donor og akseptorseter cellulære anvendt. Men de nøyaktige integrasjons områder vil sannsynligvis variere ettersom ingen av integrasjons områder analyseres så langt har vist seg mer enn noen få nukleotider av homologi mellom virus og vert-sekvenser. Derfor kan DNA rekombinasjon involverer store deler av homologi på integrering nettstedet utelukkes. Det er imidlertid interessant at ved sekvenssammenstilling flere deler av HPV16-genomet ble funnet å ha meget homologe strekninger av opp til 50 nukleotider til de nevnte gener og integrerings hotspots. En felles region av homologier med cellulære sekvenser er mellom det virale gen E5 og L2 (nukleotider posisjonene 4100-4240). Vi spekulerer i at denne og andre regioner av homologi er involvert i integrasjonsprosessen. Våre observasjoner tyder på at målrettet avbrudd, muligens også av kritiske cellulære gener, ved HPV integrering er fortsatt et problem å bli løst
Citation. Schmitz M, Driesch C, Jansen L, Runnebaum IB, Durst M (2012) non-Random Integrering av HPV Genome i livmorhalskreft. PLoS ONE 7 (6): e39632. doi: 10,1371 /journal.pone.0039632
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Det medisinske fakultet, Chile
mottatt: 03.04.2012; Godkjent: 24 mai 2012; Publisert: 27 juni 2012
Copyright: © 2012 Schmitz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DR780 /3-1) gitt til CD og MD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En vedvarende infeksjon med høyrisiko menneskelige papillomavirus (HR-HPV) spesielt HPV16 og 18 er anerkjent som den høyeste risikofaktor for utvikling av livmorhalskreft [1]. De fleste HR-HPV-infeksjoner er enten latent eller ettergivende. Latente infeksjoner er dårlig definert, men det er antatt at det virale genom blir opprettholdt som et episom i basal og parabasal celler i epitelet uten å indusere åpen fenotypiske endringer i vertscellen. Virusreplikasjon i form av virusproduksjonen er begrenset til terminalt differensierte celler av de mellomliggende og overfladiske epitel-lag og resultater fra en bryter av en latent til en ettergivende fase eller direkte fra en akutt infeksjon. Normalt HR-HPV-infeksjoner er selvbegrensende og løse i løpet av noen måneder. Men i anslagsvis 10% av tilfellene en transformerende type HPV-infeksjon utvikler seg. Denne transformasjonen fremgangsmåten er kjennetegnet ved deregulering av virale onkogener E6 og E7 i sykkel celler som til slutt resulterer i kromosomal ustabilitet og akkumulering av mutasjoner. De underliggende mekanismene for deregulering er mange. Integrasjon av HPV-genomet er et karakteristisk trinn i cervical karsinogenese og dens utseende korrelerer med progresjon av forstadier til kreft (CIN2 /3) for å invasivt karsinom [2], [3], [4], [5], [6]. Imidlertid er integreringen ikke er obligatorisk i denne prosessen, og ble vist å være HPV-type avhengig. Vinokurova og kolleger observert at HPV16, 18 og 45 var vesentlig mer ofte er til stede i en integrert tilstand sammenlignet med HPV-typene 31 og 33 [7]. Interessant den høyeste kreftfremkallende potensiale tilskrives HPV16 og HPV18 [8].
Tapet av viral E2-genet er en vanlig konsekvens av HPV integrering. Denne hendelsen kan føre til en forhøyet ekspresjon av onkogener E6 og E7 på grunn av det faktum at E2 er ikke lenger i stand til å undertrykke ekspresjonen av de virale oncogener
i trans product: [9], [10]. Men i notatet er at i en fersk analyse av biopsimateriale ingen sammenheng mellom uttrykk nivåer av virus onkogene utskrifter og den fysiske tilstanden til viral genom ble funnet [11]. Siden transkripsjonelt aktive virusintegrering sider hittil analysert i CIN2 /3 eller cervikale karsinomer utgjør endepunktet av en klonal seleksjon fremgangsmåte den mest pragmatiske tolkning av dataene er at integreringen sikrer en konstitutiv ekspresjon av de virale oncogener på et nivå som kreves for å opprettholde den transformerte tilstanden til cellen. Mer nylig flere etterforskere har også fokusert på virkningen integrasjon kan ha på vertsgenomet. En systematisk analyse av genomet konstruksjon ved integrering locus har avdekket hyppige genomiske strukturelle forandringer på HPV innstikk i livmorhalskreft [12]. Ytterligere to publikasjoner gir bevis for en fullstendig funksjonell tap av tumorsuppressorgener,
ZBTB7C Hotell og
henholdsvis CASZ1
,. I begge tilfeller genekspresjon blir forhindret på grunn av insertional mutagenese i kombinasjon med tap av heterozygositet [13], [14]. Selv om slike konstellasjoner er sannsynlig å være sjeldne hendelser blir det stadig mer tydelig at HPV integrering ikke oppstår helt tilfeldig. I en tidligere studie kan vi vise at flertallet av viral-cellulære fusion transkripsjoner i livmor karsinom co-transkribere cellulære sekvenser av kjente eller antatte gener. Faktisk 17 av 74 (23%) av integrasjons steder ble plassert innenfor cytogenetiske band 4q13.3, 8q24.21, 13q22.1, og 17q21.2, i klynger som spenner fra 86 til 900 kb. Integrerings hotspots 8q24.21 og 13q22.1 er nær tilstøtende skjøre områder. Av interesse er at integrasjon i MYC locus på 8q24.21 er sterkt korrelert med høye nivåer av
MYC
uttrykk [15], [16], [17] noe som tyder på
cis
regulatoriske virkningene blir som utøves av det virale genom.
fenomenet av ikke-tilfeldig integrering av HPV DNA er interessant og kan ikke bare være et spørsmål av kromatin tilgjengelighet i transkripsjonelt aktive områder eller skjøre områder som er utsatt for dobbeltstrengbrudd [18 ], [19], [20]. For en bedre forståelse av rollen og mekanismene virus integrering i livmorhals karsinogenese er det nødvendig å samle mer data for sammenligningsformål. Derfor har vi analysert viral-cellulære fusion transkripsjoner av 34 HPV16 positive og 13 HPV18 positive livmorhals karsinomer. På basis av disse nye dataene tidligere definerte soner for integrering kunne bli bekreftet og utvidet ved. Det er også stadig flere bevis på at mange gener påvirkes mer enn en gang ved integrasjon.
Resultater
I 47 av 87 HPV16 eller HPV18 positive svulster analysert viral-cellulære fusion vitnemål kan bli forsterket. Fusion transkripsjoner ble påvist oftere i HPV18 positive svulster (72%) enn i HPV16 positive tumorer (49%). De resterende svulster inneholdt enten bare episomale virale genomer eller integrert HPV DNA som er transcriptionally taus. De cellulære sekvenser av fusjons transkripsjoner ble karakterisert ved hjelp av NCBI menneskelige megaBlast verktøyet. Å identifisere uttrykt sekvens koder og spådd gener all ekstra cellulære sekvenser ble analysert ved hjelp av UCSC blat database.
kromosom Overdragelse av Fusion transkripsjoner
I alt 23 fusion transkripsjoner inneholdt sekvenser av kjente gener og 23 inneholdt sekvenser av predikerte gener og ESTs. I ett tilfelle den cellulære sekvensen samsvarte ikke med noen database oppføringer. De virale cellulære fusjons transkriptene kan bli tildelt til alle kromosomer, med unntak av kromosom 11, 14, 16, 18 og 20 og er sammenfattet i tabell 1. I en tidligere undersøkelse hadde allerede beskrevet at enkelte områder er oftere påvirket av integrering enn annen deler av genomet [21]. For tre av disse hotspots har vi nå funnet ytterligere integrering hendelser: Regionene 8q24.21 og 13q22.1 ble rammet to ganger og region 4q13.3 ble påvirket gang. Videre ble tre fusion transkripsjoner koblet til en 600 kb region i kromosom cytogenetisk bandet 3q28 og dermed representere en ny hotspot for HPV integrering. Figur 1 inneholder data fra Kraus og kolleger og viser alle fem hotspots, deres størrelse og nærhet til relaterte skjøre områder og mirnas.
Avbildet er integrerings steder innen de cytogenetiske band 3q28 (A), 4q13.3 (B), 8q24.21 (C), 13q22.1 (D) og 17q21.2 (E). Lys blå piler: gener som påvirkes av HPV integrasjon; røde piler: HPV-fusion transkripsjoner som er beskrevet i dette arbeidet; grå piler: HPV fusion transkripsjoner beskrevet av Kraus et al. 2008; grønne pilene: skjør sted; mørk blå piler: microRNAs
Association med Fragile nettsteder og mirnas
Av de 47 integrering loci identifisert, 10 (21%) skjedde innenfor en felles skjøre området (CFS. ) og 6 (13%) i sjeldne skjøre områder. Videre, i 15 (32%) tilfeller integrerings nettstedene ble flankerer skjøre områder i en avstand på 200 kb opp 5 Mb. En annen 16 integrasjonssider var ikke forbundet med skjøre områder. Videre 32 integrasjons steder ble plassert innenfor en avstand på 3 Mb til mirnas (tabell 1).
Orientering av ORF innen Fusion Tanscripts
Tjuetre av 47 fusion transkripsjoner inneholdt sekvenser av kjente gener . I 12 tilfeller verten genet ble orientert i retning av viral promotor, dvs. både virale og humane sekvensene var i sense-orientering. I nesten alle disse tumorer, ble den virale sekvensen skjøtes til en cellulær ekson-sekvens (11 til 12 hendelser). 23 fusion transkripsjoner inneholdt spådd gensekvenser og åtte ble integrert i forstand orientering. I 3 tilfeller orienteringen ikke kunne fastslås på grunn av uoverensstemmelser mellom databasene som brukes (tabell 1).
Identiske Gener er påvirket av integrering i ulike Svulster
Ved å sammenstille dataene fra denne studien og publiserte data fem gener og fire forutsagte gener kan identifiseres som ble påvirket i det minste to ganger i uavhengige tumorer (tabell 2). Fire av disse genene er lokalisert i hotspots 3q28 (
LEPREL1 Hotell og
TP63
), 8q24.1 (
LOC727677
) og 13q22.1 (
BG182794
). De andre gener er lokalisert et annet sted i genomet. Mens genene
Chr2.3.305.a
,
LEPREL1
,
NT_008046.7
, og
LIPC
ble rammet to ganger av integrasjon,
TP63
ble rammet tre ganger,
LRP1B
,
LOC727677 Hotell og
BG182794
fire ganger, og
TMEM49
selv seks ganger.
Videre genene
NT_008046.7
,
LOC727677
,
BG182794 Hotell og
TMEM49
er spesielt merke fordi minst to svulster båtplass identiske virale cellular fusion utskrifter med hensyn til virus donor og akseptor spleiseseter som brukes.
Diskusjoner
HPV integrering i vertsgenomet er sannsynlig å være en svært hyppig hendelse, men kan ikke være lett detektert hvis integrasjon finner sted i en enkelt celle uten etterfølgende klonal seleksjon trykk. I de fleste livmorhalskreft det bare er en transkripsjonelt aktive HPV integreringssete. Det er dokumentert at disse integrasjons nettstedene representerer tidlige klonale hendelser som har gitt en selektiv fordel for utvidelsen av svulst. På grunn av deres bidrag til kreftfremkallende prosessen klarlegging av disse spesielle integrering hendelser er relevant for å forstå HPV-indusert kreftutvikling.
Viral-cellular fusion transkripsjoner er molekylære markører for transcriptionally aktive integrerings nettsteder og kan oppdages ved en 3` RACE-protokollen (den APOT assay) som tillater PCR-amplifikasjon for etterfølgende sekvensanalyse. I denne studien har vi identifisert viral-cellular fusion transkripsjoner på 47 livmorhals karsinomer. Med ett unntak fusjons transkripsjoner omfatter cellulære sekvenser av enten kjente eller antatte gener. Dette er i tråd med resultatene av vår forrige analyse og antyder at integrering skjer for det meste i transcriptionally aktive områder [21]. Videre, i overensstemmelse med litteraturen 66% av integrering hendelser var enten innenfor (34%) eller ved siden av en skjør område (32%) [18], [19], [20], [21]. Også integrering av HPV DNA i nærheten av mirnas er tydelig. mirnas er forbundet med reguleringen av viktige prosesser som utvikling, proliferasjon, differensiering og apoptose [22], og de er ofte deregulert i kreftceller [22], [23]. Av de 75 mirnas i nabolaget integrasjonssider 19 har allerede vært assosiert med kreft (figur 1). Av disse MIR-34a, MIR-191, MIR-28, MIR-944, MIR-31, MIR-7-2, MIR-9-3, MIR-497, MIR-195, MIR-301a, MIR-21, MIR-181c, MIR-27a, MIR-99a og MIR-let7c er uttrykt i livmorhalskreftceller [24], [25], [26], [27], [28], [29]; mens MIR-34a, MIR-21, MIR-191, MIR-9-3, MIR-181d, MIR-23a, MIR-24-2, MIR-99a og MIR-125b2 er rapportert å være involvert i andre tumor enheter [ ,,,0],28], [30], [31], [32].
av notatet er at for et betydelig antall fusion transkripsjoner (11/47) de virale sekvenser skjøtes i forstand orientering til cellulære eksoner av kjent gener. Forstyrrelse av et gen av HPV integrasjon, selv om dette skjer innenfor intronsekvenser, er sannsynlig å ha en innvirkning på genuttrykk og i sjeldne tilfeller ble vist å ha bidratt til et fullstendig tap av gen-funksjon [13], [14].
et viktig funn i denne studien er at det gir ytterligere støtte for en gruppering av HPV integrasjons steder i kromosom hotspot regioner. Av de 121 svulster som ble analysert (inkludert dataene etter Kraus et al., 2008) ble 22% av de virale-cellulære fusion transkripsjoner tilordnet en av fem hotspots (figur 1). Hotspots varierer i størrelse fra 150 kb til 995 kb og inneholder opptil 8 integrasjons nettsteder. Videre ved å inkludere ytterligere publiserte data 9 gener ble funnet å være påvirket minst to ganger av HPV integrasjon, fire av disse genene er plassert innenfor hotspots av cytogenetiske band 3q28, 8q24.21 og 13q22.1 (tabell 2). Denne observasjonen er av spesiell interesse fordi det antyder at integrering ikke bare knyttes transcriptionally aktive regioner og nærliggende skjøre områder. Spesielt siden i noen tumorer og med identiske viral-cellefusjons transkripter med hensyn til viral-cellulær spleise ble funnet (tabell 2). Men sekvensering av integrerings steder i tilfelle
TMEM49
hadde vist at de svake punktene i de to respektive svulster er ca 17 kb fra hverandre. Videre har begge integrerings områder viste ingen homologi mellom de virale og cellulære sekvenser [14]. DNA rekombinasjon involverer store deler av homologi på integrering nettstedet kan minst utelukkes for
TMEM49
. Intriguingly sekvenssammenstilling av genene som er oppført i tabell 2 har avdekket flere områder med høy homologi med HPV16-genomet. Den vanligste område med høy homologi er mellom det virale gen E5 og L2 (nukleotider posisjonene 4100-4240). Seks av de 9 gener påvirkes minst to ganger av HPV integrering viser minimum 80% homologi i strekninger på opp til 34 nukleotider (Sequences S1). Videre er hver av de 9 genene viser ytterligere homologier med andre deler av det virale genom. Exemplarily posisjonene til de homologe regioner i de tilgrensende gener
LEPREL1 Hotell og
TP63
med HPV16 genomet er avbildet i figur 2. Vi spekulerer i at disse regionene kan være involvert i integrasjonsprosessen. Det er tenkt at det virale genomet er bundet til kromatin ved Brd4 som spiller en nøkkelrolle i kromosom funksjonelle arrangementer som transkripsjon, DNA replikasjon, reparasjon og rekombinasjon [33], [34]. De homologe strekninger av DNA kan deretter tillate avspenning av delvis dissosierte tråder og derved bidra til rekombinasjon. Sekvenshomologi på integreringssete i seg selv behøver ikke å være en forutsetning. Utover dette svært spekulative scenariet er det også interessant å merke seg at alle de involverte genene er kreft forbundet gener i varierende grad. Hvis funksjonelt svekket, kan de ha spilt en rolle i klonal utvelgelsesprosessen. For den anslåtte genene
chr2.3.305.a product: (N-SCAN),
NT_008046.7
,
LOC727677 product: (alias sweeker) og
BG182794
ingen funksjonelle data er tilgjengelige. Imidlertid
tilhører LRP1B
av lav tetthet lipoprotein reseptor-genfamilien, og spiller en rolle i prosessen med reseptor-mediert endocytose. En homozygot tap av
LRP1B
i flere livmorhals svulster ble funnet ved hjelp av matrise-basert komparativ genomisk hybridisering analyse [35]. Også i andre tumor virksomheter som skjoldbrusk kreft [36], magekreft [37], lungekreft [38], [39], [40], [41] og muntlig kreft [42], [43] stanse eller tap av
LRP1B
ble observert. I funksjonelle termer
LRP1B
er i stand til å hemme cellemigrasjon [44] og dens tap kan dermed være relevant for invasjon og metastasering. Den andre genet,
LEPREL1
, koder for et protein som er involvert i kollagen biosyntese, bretting og montering. Så langt dette genet var ikke assosiert med livmorhalskreft, men det ble observert å bli brakt til taushet brystkreftcellelinjer og i 26% av brystkrefttilfeller analysert [45]. Ytterligere to gener er
TP63 Hotell og
LIPC
.
TP63
, et medlem av p53 protein familien, er et annet gen påvirkes av integrering. Det fungerer som en tumor suppressor protein og avvikende uttrykk var kjent for flere kreft enheter inkludert livmorhalskreft [46], [47].
LIPC
er et cytoplasmisk protein hovedsakelig uttrykt i leveren. Det er involvert i metabolismen lipidprotein og katalyserer hydrolyse av fosfolipider, mono-, di- og triglyserider og acyl-CoA tioestere [48]. En direkte kobling til kreftutvikling er ikke åpenbar, men i en fersk studie ble det observert en fullstendig mangel på uttrykk i 18% av livmorhals karsinomer. I motsetning til all normal cervikal epitel, metaplasi og CIN undersøkt uttrykte LIPC [14]. Den hyppigst rammet genet, blir avbrutt 6 ganger, er
TMEM49 plakater (trans protein 49), også kjent som
VMP1 plakater (vacuole membran protein 1) ligger på kromosom 17q23.1. Det koder for et plasmamembran protein som er en viktig komponent i første celle-celle kontakter og trange junction formasjoner [49]. Redusert uttrykk for
TMEM49
ble funnet for invasiv brystkreft cellelinjer og i nyrekreft metastaser [49].
TMEM49
også ser ut til å være spesielt fremtredende i form av deregulering av nærliggende miRNAs. miR21 ligger bare 676 bp nedstrøms for dette genet, og kan som en konsekvens av integrering HPV være enten opp eller ned-regulert. Foreningen av miRNA har blitt rapportert for caspase kaskade [50] og det kan målrette BTG2, et gen med antiproliferative egenskaper [51]. Hittil miR21 ble vist å være oppregulert i flere kreftformer så som bryst, lunge, tarm, bukspyttkjertel, prostata, mage, ovarier og uterus [28], [31], [32].
Tre homologe strekninger opp til 50 nukleotider er vist. Antallet eksakte nukleotid fyrstikker er gitt i parenteser (se også sekvenser S1). DNA sløyfe mellom de to homologies ligger på
LEPREL1
omfatter 102.689 nukleotider; den andre sløyfen 269.968 nukleotider. Grå prikker viser til den omtrentlige plasseringen av de tilsvarende viral-cellulære fusion transkripsjoner påvist i svulster D3829, T2107 og T4335 (fra venstre til høyre).
Ved å karakterisere et økende antall transcriptionally aktiv HPV integrasjonssider det har blitt klart at integrering er ikke en helt tilfeldig hendelse, men også involverer foretrukne kromosom nettsteder. I enkelte tilfeller kan dette svekke gen-funksjon og fremme ondartet progresjon. I dag kan vi bare spekulere på hvilke mekanismer som bidrar til dette fenomenet.
Materialer og Metoder
kliniske prøver
I denne studien, 69 HPV16 og 18 HPV18 positive biopsier fra cervix karsinom pasienter ble screenet for HPV integrering av APOT analysen. For HPV genotyping en Taqman basert multiplex real-time PCR-analyse ble brukt [52]. Alle biopsier ble tatt fra pasienter behandlet ved Institutt for gynekologi av Friedrich-Schiller-Universität, Jena, Tyskland mellom 1995 og 2008. Alle tumorer ble histopathologically klassifisert som plateepitelkarsinom.
nukleinsyreisolering
Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av RNA NucleoSpin II Kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland) i henhold til protokollen for RNA-isolering fra vev. Prøvene ble homogenisert ved bruk av injeksjonsnåler med en diameter på 0,55 mm. DNA ble fjernet i alle prøver etter DNase-behandling i 15 minutter (RT). DNase ble levert med NucleoSpin RNA II Kit. Totalt RNA ble eluert i 60 ul RNase-fritt vann og lagret ved -80 ° C for videre analyse.
Reverse Transcription
Total RNA (300-500 ng) ble reverstranskribert ved anvendelse av 200 enheter av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) og en oligo (dT) primer koplet til en linkersekvens (5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CT
(30) VN-3 « ), referert til som CDS-Primer (Clontech, Heidelberg, Tyskland). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 70 min ved 42 ° C i et endelig volum på 20 ul i henhold til protokollen for Superscript II Kit. 40 enheter RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) ble tilsatt for å hemme RNase aktivitet.
Forsterkning av papillomavirus Oncogene Avskrift (APOT) Analyse
HPV-stammer fusjons transkripsjoner ble forsterket ved hjelp av APOT analyse [6]. Den er basert på en 3′-hurtig amplifikasjon av cDNA-ender (RACE) utføres i et nestet PCR-format. HPV E7 primere brukes som forward primere (HPV16: første primer: CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT, andre primer: CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG, HPV18: første primer: TAG AAA GCT CAG CAG ACG ACC, andre primer .: ACG ACC TTC GAG CAT TCC AGC AG) og en adapter primer komplementær til linkersekvensen i CDS primer som første revers primer og CDS primer som andre nestet primer
APOT analysen ble utført som tidligere beskrevet [6] med små modifikasjoner med hensyn til den primeren som brukes. Den revers primer for den første PCR omfatter sekvensen 5′-AAG CAG TGG TAA CAA CGC A-3 «, den nestede PCR-primeren sekvensen 5′-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT-3». Reaksjonsblandingen, inneholdende 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 200 uM dNTP, 250 nM primer hver og 0,75 enheter rekombinant Taq-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), ble underkastet en innledende denatureringstrinn i 5 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sek, primersammensmeltning i 30 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 2 min. For HPV16, annealing temperaturer på 61 ° C og 66 ° C for den første og andre PCR, respektivt, ble anvendt; for HPV18, 61 ° C og 68 ° C. Reaksjonen ble avsluttet ved en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 6 min. To mikroliter av den første PCR ble brukt som templat for den nestede PCR-trinnet. Begge reaksjoner ble utført i et volum på 25 mikroliter. Amplifiseringsproduktene ble visualisert ved 1% agarosegel-elektroforese. Produkter som varierer i størrelse fra de store viral transkripsjon (E6 * 1-E7-E1
VE4-E5) er veiledende for viral-cellulære fusion transkripsjoner. Den APOT analysen har flere begrensninger. En svulst der den integrerte HPV genomet er transcriptionally stille vil ikke avsløre den karakteristiske viral-cellulær fusjon transkripsjon og vil derfor bli avsluttet som negativt for integreringen. Videre kan analysen ikke påvise viral-cellefusjons transkripter, i nærvær av et overskudd av transkripter avledet fra episomale HPV genomer. Til slutt, en svulst hvor den integrerte HPV-genomet vedvarer i form av en concatemer de virale transkriptene kan ikke omfatte cellulære sekvenser og kan derfor ikke skilles fra episom-avledet transkripter. Samlet analysen undervurderer antall svulster med integrert HPV DNA.
Sekvensanalyser
Viral-cellulære fusion transkripsjoner ble fjernet fra gelen og ekstrahert ved hjelp av Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (AnalytikJena, Jena , Tyskland). De isolerte produkter ble sekvensert (Seqlab, Göttingen, Tyskland) og integrering locus ble bestemt av database justeringer ved hjelp av Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI) menneskelige megaBlast verktøy og University of California, Santa Cruz (USCS) genom nettleser.
PCR
for utvalgte prøver (n = 13) eksistensen av viral-cellulære fusion transkripsjoner ble bekreftet ved PCR ved hjelp av viral og cellulære integrasjons spesifikke primere. PCR-amplifikasjon ble utført i et sluttvolum på 25 mikroliter inneholdende 20 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl
2, 50 mM KCl, 200 uM dNTP, 400 nM primer hver og 1.5U platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). PCR-reaksjoner ble utført med en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 15 sekunder, annealing ved 58-60 ° C (avhengig av primerpar anvendt) i 20 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek.
i Silico Analyser
for kromosom kartlegging av viral-cellulære fusion transkripsjoner og å forholde HPV integrasjon til sårbare områder og mirnas, University of California, Santa Cruz (UCSC) genom nettleser (hg19) og Viewer kart (Build 37,3) av Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI) ble brukt. Alle kjente miRNA sekvenser er oppført i miRNA register «miRBase» (https://www.mirbase.org/) med 1527 poster (løslate 18) for homo sapiens.
Undersøkelse Integrerings- Loci Frequency
for å bestemme hyppigheten av HPV integrering i bestemte gener og hotspots, data publisert av Dall 2008, Ferber 2003 Kraus 2008, Matovina 2009, Peter 2006, Thorland 2003 Wentzensen 2002 og 2004 og Ziegert 2003 [3], [15 ], [17], [19], [20], [21], [53], [54], [55] ble inkludert.
Hjelpemiddel Informasjon
Sequences S1.
sekvenssammenstillinger av homologe regioner.
doi: 10,1371 /journal.pone.0039632.s001 plakater (DOC)
