Abstract
microRNAs (mirnas) er en klasse av enkelt-trådede, ikke-kodende RNA på omtrent 22 nukleotider i lengde. Økende bevis implicates mirnas kan fungere som onkogener eller tumor dempere. Her viste vi at MIR-107 direkte rettet MCL1 og aktivert ATR /Chk1 vei til å hemme spredning, migrasjon og invasivitet av livmorhalskreftceller. Videre fant vi at MCL1 var ofte oppregulert i livmorhalskreft, og knockdown av MCL1 markert hemmet kreft celle spredning, migrasjon og invasjon, mens ektopisk uttrykk for MCL1 betydelig forbedrer disse egenskapene. Restaureringen av MCL1 uttrykk kan motvirke effekten av MIR-107 på kreftcellene. Sammen er MIR-107 en ny regulator av MCL1, og både MIR-107 og MCL1 spiller viktige roller i patogenesen av livmorhalskreft. Vi har derfor identifisert en mekanisme for ATR /Chk1 sti som innebærer en økning i MIR-107 som fører til en nedgang i MCL1. Tilsvarende våre resultater viste at MIR-107 berørte ATR /Chk1 signalering og genuttrykk, og innblandet MIR-107 som et terapeutisk mål i menneskelig livmorhalskreft. Vi har også vist at taxol dempet migrering og invasjon i cervikale kreftceller ved å aktivere MIR-107, hvori MIR-107 spiller en viktig rolle i regulering av ekspresjonen av MCL1. Opplysning av dette oppdaget MCL1 var direkte regulert av MIR-107 vil kraftig forbedre vår forståelse av mekanismene som er ansvarlig for livmorhalskreft og vil gi en ekstra arm for utviklingen av kreft behandlinger
Citation. Zhou C, Li G Zhou J, Han N, Liu Z, Yin J (2014) MIR-107 Aktiverer ATR /Chk1 Pathway og undertrykke livmorhalskreft invasjon av målretting MCL1. PLoS ONE 9 (11): e111860. doi: 10,1371 /journal.pone.0111860
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 15 juli 2014; Godkjent: 08.10.2014; Publisert: 11.11.2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National High Technology Research and Development Program of China (863 program) (2010AA023002) og National 12. femårs Scientific and Technical Support Program Kina (2012BAI02B02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aberrant microRNAs (mirnas) uttrykk er et definerende trekk ved menneskelig malignitet. Spesifikke mirnas har blitt identifisert som arrangører eller undertrykkere av metastatisk progresjon [1], [2]. Livmorhalskreft har også nylig blitt vist å være assosiert med en unormal miRNA uttrykk profil, noe som tyder på at mirnas kan bidra til utvikling av kreft [3]. Livmorhalskreft påvirker betydelig helse for kvinner over hele verden og i dag rangert som den nest største årsaken til kreft dødelighet hos kvinner etter brystkreft. Omtrent 500.000 tilfeller av livmorhalskreft er diagnostisert per år, med nesten 45% av de som resulterer i død [4], [5]. Livmorhalskreft er en kompleks sykdom som involverer unormal ekspresjon av mange onkogener og tumorsuppressorgener. Selv om fokus på kjente gener har gitt vesentlig ny informasjon, tidligere ukjente kodende RNA, som mirnas, kan også gi innsikt i biologien til livmorhalskreft.
En rekke miRNAs har blitt identifisert til å regulere metastase. Blant dem, MIR-107, som tilhører den MIR-103/107 familie på grunn av deres identiske frø sekvenser, er i stand til å indusere epitelial-til-mesenchymale overgang av melke epitelceller, for derved å fremme invasive og metastatiske adferd kreft [6] – [8]. Myeloid celle leukemi-1 (MCL1) er et anti-apoptotiske medlem av Bcl-2-protein-familien, og dets ekspresjon har blitt funnet å bli indusert i celler på ulike stadier av vekst og differensiering [9]. På grunn av sin anti-apoptotiske egenskaper, er MCL1 en potensiell proto-onkogen. I tillegg er forsterket uttrykking av MCL1 observert i et bredt spekter av tumorer, inkludert leverkreft, brystkreft, etc [10] – [13]. Økende bevis tyder på at MCL1 uttrykk nivåer er assosiert med dårligere kliniske resultater i ulike krefttyper. Selv om MIR-107 anses å spille en viktig rolle i å bestemme tumor egenskaper, regulering av MCL1 uttrykk i livmorhalskreft er fortsatt i stor grad ukjent. Dette fikk oss til å ytterligere analysere relevansen av MCL1 for livmorhalskreft.
I denne studien undersøkte vi den rollen MIR-107, en miRNA assosiert med livmorhalskreft og dets interaksjon med suppressor MCL1. Derfor har vi bestemt av QRT-PCR som MCL1 ble overuttrykt i livmorhalskreft i forhold til tilstøtende normalt vev, og MCL1 ble identifisert som et direkte mål for MIR-107. Knockdown av MCL1 trykt vekst og invasivitet av menneskelig livmorhalskreft HeLa og Siha celler. Våre resultater indikerer at MCL1 kunne fungere som en onkogen og er en formidler av MIR-107 i livmorhalskreft. Til tross for tilgjengeligheten av forskjellige behandlingsmåter, slik som kirurgi, kjemoterapi og radioterapi, forblir 5 års overlevelse dårlig. Derfor er det absolutt nødvendig å undersøke legemidler i stand til å forebygge og behandle kreft i livmorhalsen. Taxol har vist seg å ha antitumoreffekter på human lunge adenokarsinom-cellelinje A549, human leverkreft cellelinje Bel-7402, humant bryst adenocarcinoma-cellelinje MCF-7 og mus Lewis lunge-carcinoma-cellelinjen
el product: [14] – [16]. Derfor, i denne studien, ble taxol gjennomført for å finne ut om taxol hadde noen effekt på spredning, differensiering og apoptose av livmorhalskreftceller, og for å undersøke mulig mekanisme på transkripsjonsnivå.
Eksperimentelle metoder
Etisk erklæringen og fag
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Den eksperimentelle protokollen ble gjennomgått og godkjent av etisk komité Harbin Medical University (HMU-EC-10168) og ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Plasmid Construction
Pri-MIR-107 ble amplifisert ved bruk av primerne, og deretter klonet inn i restriksjonssetene av pcDNA3. Den resulterende konstruksjon pcDNA3 /pri-MIR-107 ble bekreftet ved DNA-sekvensering. En syntetisk ASO-MIR-107 var som en hemmer av MIR-107. 3′-UTR-fragment av den MCL1 gen som inneholder de forutsagte MIR-107 bindingssete ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerne. PCR-produktene ble klonet inn i pcDNA3 /EGFP-plasmidet. Den resulterende vektor ble kåret pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR. Dessuten ble mutant fragment av MCL1 3′-UTR inneholdende et mutert MIR-107 bindingssete amplifisert ved hjelp av PCR seterettet mutagenese og klonet inn i pcDNA3 /EGFP-plasmidet mellom de samme områder. Alle innsettinger ble bekreftet ved sekvensering. Å konstruere SIR-MCL1 vektor, ble en 70-bp dobbel tråd fragment oppnådd via en gløde reaksjon ved hjelp av to enkelttråder. PcDNA3-vektoren ble anvendt til å generere en MCL1 overekspresjon plasmid. Den full-lengde human MCL1 cDNA-sekvensen ble amplifisert ved hjelp av PCR fra en cDNA-klon vektor og deretter klonet inn i restriksjonssetene ved anvendelse av primere.
Cell Culture
HeLa og Siha cellelinjer ble oppnådd fra Cancer Research Center i Harbin Medical University (Harbin, Kina). HeLa-celler ble opprettholdt i RPMI1640 (GIBCO) og Siha celler ble opprettholdt i DMEM-medium, disse cellene ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Logan, UT), 100 IU /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin i en fuktet atmosfære av 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
menneskelige vevsprøver
Tjueseks seks~~POS=HEADCOMP par av kliniske prøver, inkludert 26 menneske livmorhalskreft vevssnitt fra pasienter med livmorhalskreft og tilsvarende tilstøtende normalt vev, ble hentet fra First Affiliated Hospital, Harbin Medical University. Histologiske alle biopsier var plateepitelkarsinom og stadier av kreft var fra III. De diagnoser av disse prøvene ble verifisert av patologer.
Real-time RT-PCR analyse
Kvantitativ RT-PCR ble utført for å oppdage de relative transkripsjonsnivåer av MIR-107. I korthet ble 3 pg av små RNA ekstrahert og isolert fra celler eller vevsprøver ble revers-transkribert til cDNA med stammen sløyfe revers transkriptase primer ved bruk av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI). cDNA ble deretter anvendt for amplifikasjon av MIR-107 og et endogent kontroll, U6 snRNA, via PCR. De MCL1 revers transkripsjon (RT) primer og qPCR primere ble syntetisert ved Sangon Biotech., Inc. (Shanghai, Kina). PCR-sykluser som var som følger: 94 ° C i 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 90 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, og 74 ° C i 30 sek. For å kvantifisere MCL1 uttrykk, 4 ug av RNA ekstrahert fra cellene eller vevsprøver ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase. PCR-sykluser som var som følger: 94 ° C i 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 96 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, og 70 ° C i 30 sek. SYBR grønn RCR ble utført i tre eksemplarer ved hjelp av Bio-Rad Chromo 4 System Real-Time RCR detektor (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De relative genekspresjon nivåer ble beregnet. Alle primere ble kjøpt fra ABI.
Western blotting
Western blotting ble utført for å bestemme MCL1 protein uttrykk. Alle proteiner ble løst i 10% SDS-denaturert polyakrylamidgel og ble deretter overført til en PVDF-membran. Membraner ble inkubert med blokkeringsbuffer i 80 min ved romtemperatur og deretter inkubert med et antistoff mot MCL1 eller glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) med over natten ved 5 ° C. Membranene ble vasket og inkubert med en pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff (AuGCT, Inc. (Beijing, Kina)). Proteinekspresjon ble bestemt ved forsterket kjemiluminescens og eksponering for kjemiluminescens film. Lab Fungerer Image Acquisition og analyse programvare (UVP) ble anvendt for å kvantifisere bandet intensiteter.
Fluorescent reporter analysen
HeLa og Siha celler ble ko-transfektert med pri-MIR-107 eller ASO-MIR -107 i en 48-brønnsplate etterfulgt av pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR reporter vektor eller pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR-mutant. En egen RFP uttrykk vektor, pDsRed2-N1 (Clontech, Mountain View, CA) ble brukt for normalisering. Cellene ble lysert 72 timer senere, og proteinene ble høstet. Følgende vektorer ble kotransfektert inn i cellene: de som inneholder EGFP reporter vektor alene, med pcDNA3 /primiR-107, eller bærer ASO-MIR-107. PcDNA3 /EGFP, pcDNA3 eller ASO-NC ble brukt som kontroll vektorer. De intensiteter av EGFP og RFP fluorescens ble påvist med F-4500 fluorescens spektrofotometer (Hitachi, Tokyo, Japan).
Transfeksjon analysen
HeLa-celler (1 x 10
5 celler per brønn) ble sådd ut i 6-brønners kulturplater og dyrkes over natten. Deretter celler ble transfektert med Mir-107 uttrykk vektor (pri-MIR-20a, 4 mikrogram hver brønn) eller MIR-107 antisense oligonukleotider (ASO-MIR-107). For Siha celler, 1 x 10
6 celler pr brønn ble sådd ut i 6-brønns kulturplater. 5 mikrogram pri-MIR-107 eller 500 mikromol ASO-MIR-107 ble transfektert. Plasmidet pcDNA3 og den ikke-relativ sekvens (ASO-NC) ble benyttet for negativ kontroll. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. Mediet ble erstattet med nytt kulturmedium 5 timer etter transfeksjon. 24 timer etter transfeksjon, celler ble brukt for celle levedyktighet, celle kolonidannelse og in vitro migrasjon og invasjon analyser.
Vurdering av Cell Livskraftig og proliferativ kapasitet
For å bestemme celleviabilitet og proliferativ kapasitet , celler ble undersøkt ved anvendelse av MTT og kolonidannelsesanalyser som tidligere beskrevet [17]. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved enten 1 x 10
5-celler /brønn (HeLa-celler), eller 1,5 x 10
5-celler /brønn (Siha celler) og testet ved anvendelse av MTT-analysen ved forskjellige tidspunkter. For kolonidannelse analysen, ble antallet levedyktige cellekolonier ble bestemt etter 10 dager (HeLa-celler, Siha celler) etter inokulering av 200 celler /brønn i triplikat i 12-brønners plater. Cellene ble farget med krystallfiolett. Kolonidannelse ble kvantifisert ved hjelp av kolonidannelse nummeret.
Cell migrasjon og invasjon Analyser
For Transwell migrasjon analysen, 1 × 10
5 HeLa celler eller 1,3 × 10
5 Siha celler i 200 ul av RPMI 1640 uten FBS ble sådd inn i den øvre del av hver Transwell kammer (porestørrelse 8 pm; Corning) som inneholder et ikke-belagte membran. For invasjonen analysen, 1 x 10
5 HeLa-celler eller 1,3 x 10
5 Siha-celler ble plassert på det øvre kammer av hvert innsatsen belagt med 50 ul 2 mg /ml Matrigel vekstfaktor, og 500 ul RPMI 1640 med 20% FBS ble tilsatt til den nedre del av kammeret. Etter inkubering i flere timer, ble kammerne demontert, og membranene ble farget med 2% krystallfiolett oppløsning i 15 minutter og plassert på et objektglass. Deretter, ble celler som hadde migrert over membranen telles i fem tilfeldige visuelle felt ved hjelp av et lysmikroskop. Alle analyser ble utført i tre uavhengige ganger i tre eksemplarer.
Immunhistokjemi
Immunofluorescens-analyse ble utført i henhold til fremgangsmåtene beskrevet tidligere [18]. Snittene ble forbehandlet med mikrobølgebestråling, blokkert og inkubert ved hjelp av polyklonalt kanin-anti-humant MCL1 (Saier Biotechnology). Fargeintensitet ble vurdert ble målt som beskrevet tidligere [18].
Cell Cycle analysen
Celler ble belagt og transfektert med pcDNA3-MIR-107 eller pcDNA3-NC på dag 0, så reseeded på dag en, og høstet på dag 2. Prøvene ble fiksert, farget, og målt med flowcytometri henhold til innrapporterte protokoller.
Flow Aytometry Analyse
Apoptose ble undersøkt ved å måle membran omfordeling av fosfatidylserin med et annexin V-propidiumjodid apoptose deteksjon kit (Sigma, USA). I tillegg ble propidiumjodid–farget LoVo celler analysert på en EPICS ELITE ESP flowcytometer (Beckman Coulter, USA).
Taxol Regulerer Expression of MCL1 av Up-Regulering MIR-107
celleproliferasjon ble utført som beskrevet tidligere med modifikasjoner. For overføringen analysen ble cellene (2 x 10
5-celler /brønn) ble behandlet med taxol (0, 25, 50 og 100 uM) i 48 timer, deretter trypsinisert og resuspendert i serumfritt medium og 5 x 10
4-celler ble plassert i det øvre kammer av brønnen innsats med 8 um porestørrelse polykarbonat membranfilter (Millipore). DMEM inneholdende 20% føtalt bovint serum ble plassert i det nedre kammer. For invasjonen assay de eksperimentelle prosedyrer er lik migrasjon analyse som beskrevet ovenfor, bortsett fra brønnen innskuddet ble belagt med 10 ul Matrigel (5 mg /ml, BD Biosciences, Bedford, MA). Etter inkubasjon i 24 og 48 timer ved 37 ° C i migrerings eller invasjon assay, respektivt. Real-Time PCR ble det å se beskrevet metoder for mer informasjon. Dette eksperimentet ble utført to ganger uavhengig av hverandre.
miRNA Target Prediction and Statistical Analysis
miRNA målwebområder ble spådd å bruke programvaren RNA22 online (https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0/), TargetScan integrert med gNET algoritmer. Alle forsøkene ble utført i det minste i tre eksemplarer. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av Student t-test. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Mir-107 mål Direkte MCL1
Vi først brukte integrerte beregningsalgoritmer av gNET metode med TargetScan (se figur S1.. i File S1) for å identifisere genet-miRNA parene betydelig regulert i livmorhalskreft. Vi brukte denne algoritmen programmer for å forutsi MIR-107 bindende direkte til 3′-UTR av MCL1. Deretter ble effekten av MIR-107 på MCL1 uttrykk validert av MIR-107 gevinst og tap av funksjoner. I begge HeLa og Siha celler, ble QRT-PCR utføres for å validere MIR-107 over-uttrykk konstruere eller MIR-107 ASO, med pcDNA3 eller ASO-NC å være de respektive kontrollene (Fig. 1
A
). HeLa-celler ble ko-transfektert med pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR rapport vektor og pri-MIR-107 eller ASO-MIR-107. Som vist på fig. 1
B
, intensiteten av EGFP fluorescens i den pri-MIR-107-gruppen ble betydelig redusert, mens det i den ASO-MIR-107 gruppe økte signifikant ved 48 timer etter transfeksjon. For å bestemme funksjonen til mir-107 bindingssete, konstruerte vi et ytterligere EGFP reporter vektor inneholdende MCL1 3′-UTR med en mutant MIR-107 bindingssted. Som et resultat, hverken overekspresjon eller blokkering av MIR-107 hadde noen effekt på intensiteten av fluorescens EGFP i celler transfektert med den 3′-UTR mutant vektor (fig. 1
C
). Sammen viser disse resultater viste at MIR-107 binder direkte til 3′-UTR av MCL1 å undertrykke genekspresjon. I tillegg har vi fastslått om MIR-107 også undertrykker endogent MCL1 uttrykk på post-transkripsjonsnivået, analyserte vi effekten av MIR-107 på endogene MCL1 mRNA og proteinnivåer ved hjelp QRT-PCR-analyse og Western blotting, henholdsvis. I HeLa-celler, overekspresjon av MIR-107 resulterte i ca 70% reduksjon i MCL1 mRNA nivåer (Fig. 1
D
) og ca 50% reduksjon i protein uttrykk (Fig. 1
E
). Videre økte MCL1 mRNA og proteinnivåer omtrent 3 to ganger, henholdsvis i HeLa celler transfektert med ASO-MIR-107. Vi observerte lignende resultater i Siha cellelinje (Fig. 1,
D Hotell og
E
). Disse data indikerte at MIR-107 regulerer negativt endogen MCL1 protein uttrykk gjennom mRNA degradering og translasjonell undertrykkelse.
En uttrykket nivået av MIR-107 i HeLa og Siha celler ble betydelig endret etter transfeksjon med enten pri-MIR -107 eller ASO-Mir-107 uttrykk konstruerer som bestemmes av QRT-PCR bruker U6 snRNA for normalisering. B, intensiteten av EGFP fluorescens i HeLa-celler transfektert med pri-MIR-107 ble redusert etter 48 timer og øket etter transfeksjon med ASO-MIR-107. C, pri-MIR-107 og ASO-MIR-107 hadde ingen virkning på intensiteten av fluorescens EGFP i celler transfektert med den 3′-UTR mutant vektor. Den mRNA (D) eller protein (E) nivåer av MCL1 i HeLa-celler og Siha redusert eller økt sammenlignet med kontrollgruppen ved pri-MIR-107 er overuttrykt eller sperret, henholdsvis (*,
p
0,005)
MIR-107 hemmer migrasjon og invasjon
Vi utførte MTT, kolonidannelse, cellemigrasjon, og invasivitet analyser ved hjelp av HeLa og Siha celler transfektert med enten pri-MIR-107 eller ASO-MIR-107 plasmider for å fastslå effekten av Mir-107 uttrykk
in vitro
. MTT og kolonidannelse analyser viste en statistisk signifikant reduksjon i celleviabilitet og proliferasjon av pri-MIR-107-transfekterte celler i forhold til kontrollgruppen, mens ASO-MIR-107 tydeligvis økes disse egenskapene i HeLa-celler (fig. 2
A, B Hotell og fig. S2A i File S1). Transwell analysen uten Matrigel (fig. 2
C
og Selge Fig. S2B i File S1) viste at MIR-107 overekspresjon redusert migrasjon i HeLa celler med 60%, og transfeksjon av ASO-MIR -107 økt migrasjon med omtrent to ganger sammenlignet med kontrollcellene. Videre er overekspresjon av MIR-107 resulterte i en betydelig reduksjon i den invasive potensialet i HeLa-celler sammenlignet med kontrollceller i Transwell-analyse med Matrigel, og celler transfektert med ASO-MIR-107 hadde en betydelig økning i sitt invasive potensial (fig. 2
D Hotell og fig. S2C i File S1). Lignende resultater ble oppnådd med den Siha cellelinje (figur 2,
A
–
D
). Disse data tyder på at Mir-107 hemmer celledeling, migrering og invasivitet i HeLa og Siha celler
in vitro
.
Cervical kreft celler ble transfektert med enten pri-MIR-107 eller ASO- MIR-107. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 24, 48 og 72 timer etter utsåing i 96-brønners plater ved anvendelse av MTT-analysen.
En
viser histogrammet data på tidspunktet for 48 timer. Alle tre datapunkter viste en signifikant forskjell.
B
livmorhalskreftceller ble transfektert med pri-MIR-107 eller ASO-MIR-107 og deretter sådd i 12-brønners plater. For kolonidannelse analysen ble cellene farget med 2% krystallfiolett-oppløsning, og et representativt bilde er vist.
C Hotell og
D
, migrasjon og invasjon ble utført med HeLa og Siha celler transfektert med enten pri-MIR-107 eller ASO-MIR-107. Representative bilder og tilfeldig utvalgte felt vises. Knockdown av MCL1 undertrykker spredning, migrasjon, og invasivitet av livmorhalskreftceller.
E
, MCL1 proteinnivå ble målt ved Western blotting 48 timer etter transfeksjon av Sir-MCL1 i HeLa og Siha celler. GAPDH ble brukt som lasting /overføring kontroll (
Ctrl
) og for normalisering av verdiene.
F Hotell og
G
, effekter av MCL1 knockdown på celle levedyktighet (
F
) ble bestemt ved hjelp av MTT-analysen, og celleproliferasjon ble bestemt ved hjelp av kolonidannelse analysen (
G
).
H Hotell og
I
, endringer i cellemigrasjon og invasivitet indusert av Sir-MCL1 ble bestemt ved migrasjon og invasjon analyser. (*, P 0,05; **, p 0,005).
knockdown av MCL1 hemmer spredning, migrasjon og invasjon
Funksjonen MCL1 i HeLa og Siha celler var undersøkt ved hjelp av RNA-interferens. HeLa og Siha celler ble transfektert med siRNA rettet mot MCL1. Western blotting ble brukt til å evaluere effekten av siRNA på MCL1 protein inhibering. Som vist på fig. 2
E
, SIR-MCL1 forårsaket en statistisk signifikant reduksjon av MCL1 protein nivåer, opp til ca 60% i HeLa-celler og 50% i Siha celler. Hemming av MCL1 uttrykk redusert levedyktighet (fig. 2
F
) og kolonidannelse (Fig. 2
G
) av livmorhalskreftceller sammenlignet med kontrollceller. Videre knockdown av MCL1 ekspresjon resulterte i en signifikant reduksjon i graden av cellevandring (Fig. 2
H
) og invasjon (fig. 2
I
). Disse funnene viste effekten av MCL1 knockdown på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon, som er i samsvar med effekten av MIR-107 overekspresjon i begge HeLa og Siha celler.
Restaurering av MCL1 motvirker effektene av MIR-107 Expression
for å bekrefte at effekten av MIR-107 på spredning, migrasjon, og invasivitet av HeLa og Siha celler formidles gjennom MCL1, bygget vi en pcDNA3 /MCL1 vektor som inneholder MCL1 ORF uten 3′ UTR for å unngå påvirkning av miRNAs. Transfeksjon av HeLa og Siha celler med dette MCL1 ORF uttrykk konstruere snudd de negative effektene av MIR-107 på MCL1 protein nivåer (Fig. 3
A
). Hemming av cellevekst (Fig. 3
B
), kolonidannelse (Fig. 3
C Hotell og Fig. S3A i File S1), migrasjon (Fig.3
D
og fig. S3b i File S1), og invasivitet (fig. 3
E Hotell og fig. S3C i File S1) forårsaket av pri-MIR-107 ble opphevet i celler ko-transfektert med pcDNA3 /MCL1 vektor. Over-uttrykk for MCL1 motvirket effekten av MIR-107 på celleproliferasjon, migrering og invasivitet av HeLa og Siha celler.
(A)
, celler ble ko-transfektert med pcDNA3 /MCL1 vektor, som ikke inneholdt 3′-UTR av MCL1, med eller uten pri-MIR-107 vektoren. (
B Anmeldelser –
D)
, i 48 timer etter transfeksjon ble MCL1 proteinnivået målt ved Western blotting. MTT analysen (
B
), kolonidannelse assay (
C
), Transwell analyser uten Matrigel (
D
), eller Transwell analyser med Matrigel (
E
) ble anvendt for å vurdere cellelevedyktigheten, veksten kapasitet, og potensialet for cellemigrering og invasjon, respektivt. (
F
) ATR og ATM mRNA nivåer ble overvåket av QRT-PC R på de angitte tidspunkter etter MIR-107transfection. GADPH ble benyttet for normalisering. Data representerer middelverdier ± standardfeil (SE) fra tre uavhengige eksperimenter. (
G
) Western blot analyse viste at etter MIR-107 overekspresjon, ble ATR oppregulert, så fosforylering av Chk1 ble økt, men fosforylering av Chk2 var ingen forskjell. (H, I og J) Celle syklus fordeling ble undersøkt i celler transfektert med negativ kontroll, MIR-107 eller MCL1 ved propidiumjodidfarging og flowcytometri 24 timer etter transfeksjon.
N Hotell og
O
, den relative uttrykk for MIR-107 (
K
) og MCL1 (
L
) i de 15 parene, inkludert livmorhals kreft vev og matchet normalt vev, ble bestemt ved bruk QRT-PCR.
M
, uttrykk for MCL1 i livmorhalskreft vev og normalt vev ved immunhistokjemi (
n
= 12).
N
, skjematisk representerer MIR-107-mediert regulering av MCL1 uttrykk under kreft progresjon. Modell av modifisert ATR /Chk1 sti, der MIR-107 og MCL1 er involvert. Data representerer middel ± SE fra tre uavhengige forsøk. Signifikans ble bestemt av t-test. * P 0,05, ** p 0,005
MIR-107 Aktiverer ATR /Chk1 Pathway
For å verifisere at om MIR-107 kunne aktivere DNA skade trasé, overvåket vi mRNA nivået av ATR og ATM (fig. 3
F
). Gevinst av pri-MIR-107 massivt indusert uttrykk for ATR men ikke ATM på mRNA nivå. Lignende resultater ble observert på proteinnivå (figur 3
G
). Sammenlignet med kontrollen, ble ATR protein øker når primiR-107 ble overexpressed. Vi overvåkes også aktivering av Chk1 og Chk2, en nedstrøms gen av ATR og minibank. Som vist på fig. 3
G
, Chk1 ble dramatisk fosforylert etter pri-MIR-107 overekspresjon, men det var ingen signifikant endring i fosforylering av Chk2. Siden aktivering av Chk1 vanligvis resulterer i G1 arrest, vi testet cellesyklusen profil med flowcytometri (Fig. 3
H
,
I
og
J
). Tilsvarende, ble cellene i S-fasen reduseres sammen med MIR-107 overekspresjon mens det var ingen signifikant endring i G2 /M-fasen. Alle disse dataene foreslår at økt MIR-107 induserer G1 arrest ved å aktivere ATR /Chk1 sti.
Uttrykk av MIR-107 og MCL1 i livmorhalskreft og normalt vev
For å påvise uttrykk av MIR -107 i menneskelige livmorhalskreft vev ble QRT-PCR-analyse utført på femten parede prøver av livmorhalskreft og tilstøtende normalt vev. MIR-107 ble uttrykt ved et lavere nivå (fig. 3
K
), mens MCL1 ble uttrykt på et vesentlig høyere nivå i tumorvev sammenlignet med de tilsvarende normale vev (Fig. 3
L
). I denne innstillingen, benyttet vi en immunhistokjemi analyse for å ytterligere oppdage MCL1 uttrykket nivå i menneskelige livmorhalskreft vev og tilstøtende normalt vev. Som vist på fig. 3
M
, uttrykket nivåer av MCL1 var betydelig høyere enn i tilstøtende normalt vev, noe som ytterligere støtter at MIR-107 regulerer MCL1 negativt. Arbeids modell av MIR-107-MCL1 interaksjon i løpet av kreft progresjon ble vist i fig. 3
N
. Denne oppdagelsen gir innsikt i hvordan MCL1 uttrykk er regulert, og foreslår terapeutiske mål for å redde funksjonen til MCL1 protein oftest assosiert med menneskelig livmorhalskreft.
Taxol undertrykker Migrasjon og invasjon av livmorhalskreft
i denne studien undersøkte vi cytotoksisiteten til taxol ved behandling av cervikale kreftceller med forskjellige konsentrasjoner av taxol i 24 eller 48 timer. Resultater fra MTT-analysen viste at taxol var ikke signifikant giftig for HeLa og Siha (Fig. 4
A
) celler ved konsentrasjoner opp til 100 mikrometer for 24 til 48 timer. Denne serien av konsentrasjoner ble derfor brukt i alle senere forsøk. Tumorceller løsner fra nabocellene ved å slippe sine intercellulære overganger i løpet av metastasering, og den ekstracellulære matriks-er proteolytisk nedbrutt for å tillate migrering og invasjon av kreftceller. For å undersøke effekten av taxol på malignitet av livmorhalskreftceller, migrering og invasjon evner HeLa og Siha celler ble bestemt. I det cellemigrering analysen, HeLa-celler behandlet med 50 og 100 uM taxol viste en signifikant reduksjon i motilitet, henholdsvis, og lignende resultat ble også observert i Siha celler med inhibering (fig. 4
B
). I celle invasjon analysen ble taxol vist seg å redusere celle invasjon i en konsentrasjonsavhengig måte. Ved 50 uM, ble invasjon redusert med 46,12% og 61,24%, og ved 100 uM, ble invasjon redusert med 50,04% og 80,11% i HeLa-celler og Siha, henholdsvis (fig. 4
C
). Disse resultatene viste at taxol inhiberte signifikant migrering og invasjon av livmorhalskreft cellene under ikke-toksiske konsentrasjoner.
(
A
) Den kjemiske strukturen til taxol. (
B
) HeLa-celler og Siha celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av taxol i 24 og 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Plottet viser relativ cellelevedyktighet sammenlignet med ubehandlede (0 uM) celler. HeLa og Siha-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av taxol i 48 timer. Deretter ble det vandrende (
C
) og invasiv (
D
) evnen til cellene etter hver behandling ble bestemt, som beskrevet i materiale og metoder. De nedre plott var det relative celleantall sammenligner med den i ubehandlede (0 uM) celler. Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av taxol i 48 timer. (
E
) det kondisjonerte mediet fra hver behandling ble oppsamlet, og MCL1 aktivitet ble bestemt ved kasein zymografi. (
F
) Cell lysat ble brukt for å bestemme proteinnivåer MCL1 ved Western blotting. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (
G
) apoptose analysen viste at taxol trykt celle apoptose og G1 arrest. (
H
) den relative uttrykk for MIR-107, (
I
) arbeidsmodell av taxol regulerer uttrykket av MCL1 ved å nedregulere MIR-107. Barer viser verdien som gjennomsnitt ± bred singlett. fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P . 0.005, sammenlignet med ubehandlede celler
Taxol Hemmer Expression of MCL1
For å undersøke mulige underliggende anti-metastatisk effekt av taxol, uttrykk for MCL1 i livmorhalskreft celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av taxol ble undersøkt. Som vist i kaseinolytisk aktivitetsanalysen, redusert MCL1 aktivitet på en doseavhengig måte etter behandling med taxol. Kvantifisering analyse indikerte at MCL1 aktivitet redusert med 20,2%, 60,1% og 85,4% i HeLa-celler, og med 40,5%, 70,8% og 84,2% i Siha celler når cellene ble behandlet med 25, 50 og 100 uM av taxol, henholdsvis (fig. 4
D
). Western blot-analyse ble utført for å undersøke protein ekspresjon av MCL1 i cervikale kreftceller. Som vist på fig. Fig. Fig. Fig.
