Abstract
hyaluronan (HA), en enkel disakkarid enhet, kan polymerisere og er ansett som en primær komponent av den ekstracellulære matriks, som har et bredt spekter av biologiske funksjoner. I de senere år, ble HA finnes på overflaten av tumorceller. I henhold til tidligere rapporter, er forskjellige HA-innhold på celleoverflaten av tumorceller nært knyttet til lymfeknutemetastaser, men mekanismene som formidler denne prosess forble uklart. Denne forskningen ment å studere overflate innhold av HA på tumorceller og analysere celleklebe endringer forårsaket av interaksjonen mellom HA og dens lymfatisk endotel reseptor (LYVE-1). Vi skjermet og observert høy HA innhold på HS-578T bryst celler og lav HA innhold på MCF-7 bryst celler gjennom partikkel eksklusjon, immunfluorescens og flowcytometri eksperimenter. Uttrykket av LYVE-1, lymfe-fartøysspesifikk HA reseptor, var i samsvar med vår forrige rapport og forbedret vedheft av HA
high-HS-578T celler til COS-7
LYVE-1 (+) gjennom HA i celle statisk feste og dynamiske parallelle plate strømningskammerforsøk. MCF-7 bryst celler inneholder lite HA på overflaten; Men resultatene viste liten adhesjon forskjell mellom MCF-7-celler og COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler. Lignende resultater ble observert når det gjelder adhesjon av HS-578T-celler eller MCF-7 celler til SVEC4-10 celler. Videre observerte vi for første gang at celleoverflaten HA-innhold av høy overføringstumorceller var rik, og vi visualisert kryssbinding av HA kabelkonstruksjoner, som kan aktivere LYVE-1 på lymfatisk endotel-celler, fremmer tumor adhesjon. I sammendraget, til høy-lav celleoverflaten HA innhold av kreftceller gjennom interaksjon med LYVE-1 fører vedheft forskjeller
Citation. Du Y, Liu H Han Y, Liu Y, Yang C, Zhou M , et al. (2013) Samspillet mellom LYVE-en med hyaluronan på celleoverflaten kan spille en rolle i et mangfold av Adhesjon til kreftceller. PLoS ONE 8 (5): e63463. doi: 10,1371 /journal.pone.0063463
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 13 januar 2013; Godkjent: 03.04.2013; Publisert: May 22, 2013
Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av shanghai Committee of Science and Technology (No.10411950500), Natural Science Foundation National of China (81071814, 81172027, 81272479) og Program for Shanghai Subject Chief Scientist (11XD1404000). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
invasjon og metastasering er de viktigste biologiske egenskapene til ondartede svulster. Tumor celleadhesjon spiller en viktig rolle i tumorinvasjon og metastase, inkludert forbindelsen mellom tumorcellene selv, og mellom tumorceller med andre celletyper. Overføringen av tumorceller innbefatter adhesjon og separasjon (adhesjon depolymerisering). I det tidlige stadium av tumorinvasjon, er individuelle tumorceller skur fra den primære tumoren på grunn av adhesjon faktor tap, som genererer overføring potensialet i kreftceller. Under den midtre fasen av invasjon, tumor-celler som ble overført inn i sirkulasjonssystemet holde vaskulære endoteliale celler og den ekstracellulære matriks. Denne prosessen involverer mange vedheft faktorer og ulike andre faktorer som fremmer eller separat heft som celleadhesjonsmolekyler (CD44, cadherin). Denne studien primært diskuterer problemer med adhesjonen involverer tumorceller og lymfe endotelceller.
Hyaluronan (HA) er sammensatt av en lineær gjentakelse av disakkaridenhetene bestående av D-glukuronsyre og N-acetylglukosamin og er hovedkomponenten i den ekstracellulære matriks. Under fysiologiske betingelser, er HA hovedsakelig fordelt i bindevevet med mange andre proteiner for å danne et stort og komplisert nettverk som opprettholder mellomrommet mellom celler slik som mucosa lamina propria og den ytre membran omkring blodkarene i huden fordeling [1], [2- ]. Mange studier har vist at HA påvirker tumor-angiogenese, metastase og invasivitet. In vivo studier funnet at før migrering, celler økte deres HA-konsentrasjon ved deres startposisjonen [3], [4]. I tillegg ble HA funnet å øke ved invasjonen kanten av brystcancer-celler [5], [6] og i det ekstracellulære miljø [7], som omorganiserer matrise av invasiv tumorceller. Et stort antall eksperimentelle resultater har vist at aggressive tumorer inneholder høye nivåer av HA, og at økte nivåer av HA i solide svulster er relatert til dårlig differensiering tumor og en reduksjon i pasientens overlevelse. Tidligere studier funnet at økt HA ble produsert av de omkringliggende fibroblaster etter stimulering av brystkreftceller [8]. Imidlertid invasiv tumorceller selv også kunne syntetisere HA på celleoverflaten. Mange studier fokuserer på korrelasjon av mengden av HA på tumorcelleoverflaten til dens metastaser og har funnet at evnen til tumorceller for å overføre var relatert til deres overflate HA-innhold [9], [10]. Itano og kolleger [10] intravenøst injisert bryst celler som produserer HA og mutante bryst celler som ikke kunne produsere HA i nakne mus. De fant at mutante kloner vises betydelig nedgang i metastatisk evne i forhold til foreldre celler etter intravenøs (i.v.) injeksjon i syngene mus. Uttrykke mus hyaluronan syntase 1 (has1) ved transfeksjon inn HAR
– celler defekte i hyaluronan syntaseaktiviteten reddet hyaluronan matrisedannelse samt hyaluronan produksjon. Lungemetastaser etter intravenøs injeksjon av has1 transfektanter ble også hentet seg betydelig. Mange rapporter har bekreftet at HA-innhold på tumorcelleoverflaten var relatert til celle overføringshastighet [9], [10], [11]. Nærmere bestemt, til høye nivåer av overflate HA årsak kreftceller overføre raskt, og lave nivåer HA føre til tumorceller for å overføre langsomt.
eksisterende litteratur støtter forholdet mellom HA-innhold på tumorcelleoverflaten, og tumormetastase lymfatiske. Imidlertid er fremdeles uklart reguleringen av tumor adhesjon, lymfatisk metastase, og overføringshastigheten ved celleoverflaten HA. Undersøkelser angående overføring via blodbanen vist at tumorceller kombinert med vaskulær endotelial celleoverflate-spesifikke sammensetning fremmer tumorcelle og vaskulær endotelial celle adhesjon [12], [13]. Videre tumor overføringshastighet og adhesjon hastighet ble positivt relatert. Studier har også funnet at CD44, et bredt uttrykt endotelial celleoverflate-reseptor HA, påvirket adhesjon av tumorceller og lymfocytter. Lymfatiske metastase feltstudier bekreftet at høye overflate nivåer av HA i mus melanomceller forfremmet rask overføring til lymfeknuter, og lave overflate nivåer av HA i muse melanom celler korrelerte med treg metastaser til lymfeknuter [9]. Lymfatiske endotelceller ha en spesifikk hyaluronsyre-reseptor heter lymfatisk endotel celle hyaluronsyre-reseptor 1 (LYVE-1) [14]. LYVE-1 ble antatt å ha en effekt som er lik CD44 på blod endotelceller, noe som lettes ved å samhandle med tumorcelleoverflaten HA og påvirker tumor-celle adhesjon. Imidlertid er mekanismen ved hvilken tumorcelleoverflate-HA virker på LYVE-en for å påvirke dens adhesjon og overføring i tumormetastase lymfatisk er fortsatt uklar.
I denne studien ble den biologiske rolle av samspillet mellom LYVE-1 og tumor celleoverflate HA i kreft celleadhesjon ble undersøkt. HS-578T-celler som inneholder høy HA på deres overflate (HA
High-HS-578T) og MCF-7-celler som har liten HA på overflaten (HA
lav-MCF-7) ble valgt. COS-7-celler transfektert med LYVE-1 (COS-7
LYVE-1 (+)) og SVEC4-10-celler (en lymfe endotelial celle-lignende cellelinje) ble brukt som modell for å studere virkningen adhesjonen mellom LYVE -1 og tumorceller som uttrykker høye eller lave nivåer av HA. HS-578T-celler og MCF-7-celler, ettersom de øvre celler, uavhengig holder seg til underlags av COS-7
LYVE-1 (+) celler og COS-7-celler transfektert med kontroll pEGFP-N1-vektor (COS-7-
LYVE-1 (-)) under statiske og dynamiske tilstander. Resultatene viste at HA, til stede på overflaten av tumorcellene, mediert adhesjon av tumorceller til COS-7
LYVE-1 (+) celler og COS-7
LYVE-1 (-) celler. HA
høy-HS-578T brystkreft celler hatt større tilslutning til COS-7
LYVE-1 (+) enn COS-7
LYVE-1 (-) celler via samspillet mellom HA og lymfatiske endothelial cellespesifikk hyaluronsyre reseptor LYVE-1. I tillegg kan MCF-7 bryst-tumorceller som mangler celleoverflate HA i utgangspunktet ikke holder seg gjennom HA og LYVE-1-binding. Lignende resultater ble også observert når det gjelder adhesjon av HS-578T-celler eller MCF-7-celler for å SVEC4-10 celler.
Resultater
Visualisering av pericellulær matrisedannelse av 6 humane brystcancerceller
HA-innholdet i brystkreftceller skiller seg vesentlig; Derfor, ble HA tilstede på overflaten visualisert ved anvendelse av en partikkel-utelukkelse analysen. I denne analysen, ble det observert en klar sone mellom HS-578T og MDA-MB-231-celler og de fikserte erytrocytter (fig. 1A a, c). I tillegg ble 5 min etter Streptomyces hyaluronidase tilsatt til kulturskålen, HA strøk var nedbrutt, slik at de røde blodlegemer til å kontakte HS-578T og MDA-MB-231-celler direkte (fig. 1A b, d). Videre er disse data er i overensstemmelse med tidligere arbeid [15]. Våre resultater viser at MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF-7 og SK-BR-3-celler, som har en lav kapasitet for HA-produksjon, ikke ble utelatt fra fikserte erytrocytter (fig. 1A E, G , I, k), og nesten ingen endring ble observert etter tilsetning av hyaluronidase (fig. 1 A f, h, j, l). For å kvantifisere matrise tykkelse, ble konturene av matriser og cellulære grensene fra 10 individuelle celler spores. Beleggtykkelse ble plottet for hver cellelinje med og uten Streptomyces hyaluronidase behandling (Fig. 1B). Gjennomsnittlig ratio for hver tilstand er angitt med en vannrett linje. I samsvar med resultatene av partikkel utelukkelse eksperiment, immunfluorescens (fig. 1C) og flow-cytometri (fig. 1D) forsøk på samme måte viste at HA-innhold på celleoverflaten av HS-578T og MDA-MB-231-celler var rik, og de andre fire celler hadde lav overflate-HA-innhold.
(A) visualisering og morfometrisk analyse av HA-matriser ble utført ved å bruke en partikkel-utelukkelse analyse før og etter tilsetning av HA-spesifikke Streptomyces hyaluronidase. En klar sone var synlig mellom HS-578T, MDA-MB-231-celler og røde blodlegemer (a, c); ca 5 min etter Streptomyces hyaluronidase ble tilsatt til cellene, ble HA-belegg brytes ned, slik at de røde blodcellene for å kontakte HS-578T og MDA-MB-231 celler (B, D). Ingen forskjell før (e, g, i, k) og etter (f, h, j, l) tilsetning av Streptomyces hyaluronidase til MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF-7 og SK-BR- 3-celler ble observert. (B) Overflate HA retensjonen ble kvantifisert som forholdet mellom matriks-område til celle-området. Individuelle brystkreft celler ble sporet ved bruk av Image Pro Plus 6 ved grensen av den klare sone for å beregne matriseområdet og på celle omkretsen for å beregne celleareal. forholdstall Coat /celle området er plottet som en fordeling, med gjennomsnittsverdien representert ved en vannrett linje. (C) En immunceller fluorescens eksperiment ble brukt til å påvise celleoverflate HA. Den relative lysstyrke representert HA-innhold på celleoverflaten. Sterkt lys ble visualisert i HS-578T og MDA-MB-231 celler; på bakgrunn av de fire andre celletyper var i utgangspunktet umulig å oppdage. (D) HA-innholdet ble også bedømt ved FACS-analyse. Representative histogrammer er vist for celler farget med biotinylert HABP og Alexa 488-merket avidin til HA i ubehandlede celler (røde) eller celler behandlet med Streptomyces hyaluronidase (blå). Kontrollceller ble farget bare med Alexa 488-merket avidin (svart).
brystkreft celler HA
high-HS-578T og HA
lav-MCF-7 Følge annerledes Under Statisk Forhold
Som tidligere studier har vist, er den statiske klebe eksperimentet ofte anvendt for å teste adhesjonen forskjellen mellom forskjellige molekyler og celler. For å utforske forskjellen i tumorcelle adhesjon til COS-7 celler ved en interaksjon med overflate HA og LYVE-1, ble en bindingsanalyse utført. Det korrekte uttrykk for LYVE-1 i COS-7-celler ble bekreftet i vårt tidligere studium [16]. HA
høy-HS-578T og HA
lav-MCF-7-celler merket med DAPI ble påført på COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (- ) celler til å observere stasjonær tilslutning. Våre resultater viste at mange HS-578T-celler festet til stasjonære COS-7
LYVE-1 (+) celler på grunn av overflod av HA-molekyler på overflaten, og antallet celler som klebet redusert når de interaksjon med COS- 7
LYVE-1 (-) celler (fig. 2A, a, b, 2B, e). Tidligere studier som anvender Streptomyces hyaluronidase før bindingsanalysen viste at HA deltar i tumor adhesjon [16]. I samsvar med dette funnet, MCF-7-celler, som har lav overflate HA-innhold, viste ingen forskjell i tilslutning til COS-7
LYVE-1 (+) celler og COS-7
LYVE-1 (-) celler (fig. 2A, c, d, 2B, f). SVEC4-10 celler er verifisert som en lymfe endotelial celle-liknende cellelinje [17] og er forskjellig fra COS-7-celler; Derfor har vi også testet adhesjonen av HS-578T-celler og MCF-7 celler til SVEC4-10 celler, som ble verifisert som en lymfe endotelial celle-lignende cellelinje. Våre resultater viste at etter blokkerer interaksjonen mellom LYVE-1 og HA, ble en svak reduksjon observert i adhesjonen mellom HS-578T-celler og SVEC4-10-celler (figur 2C, g-i;. 2D, m). Det ble ikke observert forskjell mellom MCF-7 celler og SVEC4-10 celler (figur 2C, j-l;. 2D, n). Således er disse funnene tyder på at forskjellen er angitt i overføringen inn i lymfekar av tumorceller som uttrykker høye og lave HA kan skyldes karakteristiske adhesjon til LYVE-1 på lymfe endotelceller.
(A) klebet HS- 578T og MCF-7-celler vises som blå kuler (a-d). DAPI-merkede HS-578T-celler var mer vedheftende til den sammenflytende monolag av COS-7
LYVE-1 (+) celler sammenlignet med COS-7
LYVE-en (-). MCF-7-celler klebet på samme måte med både COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler. (B) Kvantitative vurderinger av HS-578T og MCF-7 celle adhesjon på monolag av COS-7-celler er vist, og hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner fra et typisk forsøk, og er uttrykt som et gangers økning i forhold til COS 7-celler transfektert med kontroll vektoren pEGFP-N1. * P 0,05 versus indikerer transfektert pEGFP-N1 vektor kontroll COS-7 celler. (C) klebet HS-578T og MCF-7-celler vist som blå kuler (g-l). DAPI-merket HS-578T celler var tilhenger til konfluent monolag av SVEC4-10 celler før og etter blokkering med LYVE-1 antistoff, isotype antistoff. (D) Kvantitativ evaluering av dataene fra HS-578T og MCF-7 celle adhesjon på monolaget av celler SVEC4-10 er vist, og hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner fra et typisk forsøk, og er uttrykt som en fold reduksjon i forhold til SVEC4-10 celler uten behandling. * P . 0,05 versus SVEC4-10 celler uten behandling
brystkreft celler HS-578T og MCF-7 forskjellig Lim fast Under strømningsforhold
Tumor celle arrest og dannelsen av stabile adhesive interaksjoner mellom tumorceller og endotelceller er avgjørende skritt i den metastatiske prosess. For å få mer informasjon om bindende egenskaper av brystkreft celler til COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler, tilsvarende vedheft eksperimenter til de som er beskrevet ovenfor ble utført ved hjelp av en parallell plate strømningskammer i henhold til skjærspenningsbetingelser. Lysbilder med COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler ble plassert i en parallell plate strømningskammer, og HS-578T eller MCF-7-celler ble perfusert under fysiologiske skjærspenning. Som vist på fig. 3 (A, a, b, b, e), tilsvarende økt adhesjon av HS-578T-celler til COS-7
LYVE-1 (+) enn COS-7
LYVE-1 (-) celler ble observert under lave strømningsforhold (0.1dyn /cm
2); imidlertid, MCF-7-celler fremdeles på samme måte festet til både COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler (figur 3A, c, d,. 3B, f) . Våre resultater viste også at etter blokkerer interaksjonen mellom LYVE-1 og HA, adhesjonen mellom HS-578T-celler og celler SVEC4-10 litt redusert under lave strømningsbetingelser (0,1 dyn /cm
2), som vist på fig. 3 (C, g-i, D, m). Ingen åpenbare forskjeller mellom MCF-7 celler og SVEC4-10 celler (før og etter blokkering) ble påvist (figur 3C, j-l;. 3D, n).
(A) Antallet HS-578T og MCF-7-celler festet til COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler under 0,1 dyn /cm
2 lav skjærspenning ble bedømt ved telling 5 tilfeldige visninger av fluorescens mikroskop bilder. Levd HS-578T og MCF-7 celler vises som blå kuler (a-d). (B) Kvantitative vurderinger av de data som representerer HS-578T og MCF-7 celle adhesjon på monolag av COS-7-celler er vist, og hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner fra et typisk forsøk, og er uttrykt som et gangers økning i forhold til kontroll pEGFP-N1 vektor transfekterte COS-7-celler. * P 0,05 versus de angitte transfekterte pEGFP-N1 vektor kontroll COS-7 celler. (C) Antall HS-578T og MCF-7-celler klebet til SVEC4-10-celler før og etter blokkering med LYVE-1-antistoff, isotype antistoff i henhold til 0.1 dyn /cm
2 lav skjærspenning ble bedømt ved telling 5 tilfeldig visninger av fluorescens mikroskop bilder (g-l). (D) Kvantitativ evaluering av dataene fra HS-578T og MCF-7 celle adhesjon på monolag av SVEC4-10 celler er vist. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner fra et typisk forsøk, og er uttrykt som en fold reduksjon i forhold til SVEC4-10 celler uten behandling. * P. 0,05 versus SVEC4-10 celler uten behandling
vedheft av HS-578T og MCF-7 celler til COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler separat ble utsatt for forskjellige intensiteter av skjærspenning, og endringer i antall selvklebende celler ble målt. HS-578T-celler ble tillatt å binde seg til LYVE-1-transfekterte og kontrollcellene på 0,1 dyn /cm
2 i 2 minutter og ble utsatt for økende skjærspenning på opp til 13,54 dyn /cm
2 (fig. 4A, B, a). HS-578T celler med høy HA innhold forble bundet til COS-7
LYVE-1 (+) celle monolag på veggen skjærstressnivå på opp til 5,4 dyn /cm
2 og begynte å bli utgitt på 13,54 dyn /cm
2. Mengden av HS-578T celleadhesjon til COS-7
LYVE-1 (+) celler sammenlignet med COS-7
LYVE-1 (-) celler som var enda høyere og ikke åpenbart endret til skjærspenningen nådde 13,54 dyn /cm
2. Ingen signifikante forskjeller i rullende oppførselen til MCF-7-celler til COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-), ble det observert celler (figur 4A, b., B) . Imidlertid er adhesjonen av HS-578T-celler til SVEC4-10 celler (både før og etter blokkering) var forskjellig fra den adhesjonen til COS-7-celler. En bemerkelsesverdig reduksjon i adhesjon skjedde mellom HS-578T-celler og SVEC4-10-celler, som var ubehandlet eller behandlet med IgG
2A isotypekontrollantistoff når skjærspenningen nådde 2,7 dyn /cm
2 (figur 4C;. D , c). Dessuten var ingen signifikante forskjeller i den rullende atferd MCF-7 celler til SVEC4-10 celler oppdages (fig 4C,. D, d).
HS-578T og MCF-7 celler ble perfused over COS- 7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler ved veggskjærspenninger på 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 eller 13,54 dyn /cm
2 i 2 min. (A) Et antall adherente celler i det samme feltet er vist som blå kuler. (B) Resultatene er vist som de relative celleantall av HS-578T-celler (a) og MCF-7-celler (b) fanget opp av COS-7
LYVE-1 (+) (rød linje) til COS-7- (blå linje) celler –
LYVE-1 (). HS-578T og MCF-7 celler ble perfuseres over et konfluent monolag av SVEC4-10-celler før og etter blokkering med LYVE-1-antistoff, isotype antistoff ved veggskjærspenninger på 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 eller 13,54 dyn /cm
2 i 2 min. (C) Antall adherente celler i det samme feltet er vist som blå kuler. (D) Resultatene er vist som de relative celleantall av HS-578T-celler (c) og MCF-7-celler (d) er tatt med SVEC4-10 celler blokkering med LYVE-1 (blå linje), SVEC4-10 celler med blokkering isotypekontrollantistoff (rød linje) til SVEC4-10 celler uten behandling (svart linje). Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD av antall celler bundet. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
Høy HA-uttrykke kreftceller Form hyaluronan Kabel Structures
HA kabler kan ha samme kapasitet for å aktivere LYVE-1 som deres evne til å aktivere CD44 in vivo [18], og våre resultater, så vel som resultatene fra tidligere rapporter viste at noen tumor overflater inneholder høye nivåer av HA. Det var imidlertid uklart om HA på overflaten av tumorcellene utvikle seg til kabelkonstruksjoner og spille en rolle i aktivering LYVE-1. Derfor prøvde vi å bruke immunfluorescens å detektere HA kabler på overflaten av tumorceller. Frem til tumorcellene nådd 100% konfluens, ble biotinylert HABP lagt inn i cellene for å detektere HA fordeling. Resultatene viste at brystcancerceller HS-578T og BT-549, lungekreft 95-D-celler, cervical carcinom HeLa-celler, tykktarmskreft RKO celler og lunge-adenocarcinoma A549 celler som alle inneholder høye nivåer av HA og utvikle kabelkonstruksjoner (Fig . 5), som ble tidligere rapportert å forekomme i HK2 celler. Etter bruk av Streptomyces hyaluronidase for å nedbryte HA på tumoroverflaten, ble HA-kablene av hK2 celler forsvant (fig. 5). Tilsvarende HA ledningene til de andre celler ble også opphevet ved Streptomyces hyaluronidase fordøyelse (data ikke vist). HA kabler ble heller ikke påvist i MCF-7-celler, som har lave nivåer av overflate HA.
Sammenflytende monolag celler ble dyrket i nærvær av 10% (v /v) FCS før fiksering med metanol og påvisning av HA ved tilsetning av bHABP. Seksjonene ble fotografert av invertert fluorescens mikroskopi (× 20 mål). HA-kabler er markert med hvite piler. Original forstørrelse × 20. Streptomyces hyaluronidase ble tilsatt til cellene før fiksering. Ha kabler ble degradert uten gjenkjenning.
Diskusjoner
Denne studien har vist at HA-mediert mekanisme som regulerer adhesjon av kreftceller til lymfe endotelceller. En signifikant forskjell ble observert i tilslutning av brystkreftcellelinjen HS-578T, som uttrykker høye nivåer av HA, med COS-7
LYVE-1 (+) celler; I motsetning til dette, COS-7
LYVE-1 (-) celler transfektert med kontroll vektor pEGFP-N1 viste ikke denne endringen i henhold til både statisk og strømningsforhold. MCF-7 celler som mangler HA på sin overflate klebet på samme måte som i COS-7
LYVE-1 (+) celler som COS-7
LYVE-1 (-) celler. En liten endring ble også påvist i adhesjonen av HS-578T-celler til SVEC4-10-celler før og etter tilsetning av blokkerende antistoff. Disse funnene tyder på at HA på tumoroverflaten kan delta i bryst metastase ved å påvirke binding med LYVE-1 på lymfe fartøy endotelceller.
Tidlig metastaser til lymfeknuter er en hyppig komplikasjon i menneskelig brystkreft. I henhold til tidligere rapporter, vist vi HA på 6 typer av brystcancer-celler, de svært metastatisk cellelinjer HS-578T [19], [20] og MDA-MB-231 [21], [22], [23], i moderat metastatisk cellelinjer MDA-MB-435s [21], [23] og MDA-MB-468 [24], [25], og de har lav eller ingen metastatisk cellelinjer MCF-7 [23], [25], [ ,,,0],26] og SK-BR-3 [19], [27] via en klassisk partikkel utelukkelse assay, en immunfluorescens eksperiment, og flowcytometrisk analyse. I samsvar med tidligere rapporter [28], fant vi at HS-578T og MDA-MB-231 celler inneholder høye nivåer av HA på overflaten, mens HA nivåer på overflaten av MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF -7, og SK-BR-3-celler ble knapt påvises. HA på tumoroverflaten har vist seg å være forbundet med tumormetastase lymfe; Derfor, vurderte vi hvorvidt og hvor HA til stede på tumoroverflaten deltar i denne prosessen. For ytterligere å undersøke den biologiske funksjon av HA i tumor lymfatisk metastase, valgte vi høy HA-uttrykkende celler HS-578T og lav HA-uttrykkende MCF-7-celler for å undersøke om HA i fl uences egenskap av tumorceller til å følge COS-7
LYVE-1 (+) celler og SVEC4-10 celler.
LYVE-1, en celleoverflaten reseptor for HA i lymfesystemet endotelet, har vist seg å være korrelert med en høy frekvens av regionale lymfeknutemetastaser [29], [30]. Forskere fra andre laboratorier har vist at peritumoral lymfeårer i enkelte typer kreft inneholde kreft emboli dekorert med hyaluronan i lumen, og de foreslo at kreftceller innenfor drenering lymfekar kan binde HA, forårsaker en interaksjon med karveggen via CD44 /HA /LYVE-en interaksjon [31]. For direkte å undersøke hvorvidt den LYVE-1-HA interaksjonen påvirker tumor lymfeknutemetastase, undersøkte vi klebe evne til tumorceller (forskjellige HA-innhold) til LYVE-1-positive celler. Vår statisk adhesjon analysen avslørte at LYVE-1 forbedrer adhesjonen av HS-578T-celler til COS-7 celler via hyaluronan, som tidligere var rapportert [16]. Men om lav HA-innhold i tumorceller produserer en interaksjon med LYVE-en gjennom andre faktorer å påvirke svulst celle adhesjon er fortsatt uklart. Vi utførte også en statisk adhesjon eksperiment med MCF-7 celler og COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler. Denne studien viste at LYVE-en ikke forbedre adhesjonen av MCF-7 celler som mangler HA på deres overflate til COS-7 celler. Videre, for å beste modellen adhesjon av tumorceller til endotelceller lymfe, brukte vi SVEC4-10 celler for å gjenta adhesjon. Bare et svakt nedgangen ble observert etter bruk av blokkerende antistoff, noe som kan være forårsaket av et begrenset interaksjoner med HA og LYVE-1 på SVEC4-10 celler. Samlet utgjør disse funnene tyder på at ulike nivåer av HA på tumorceller påvirke deres metastaser i lymfesystemet. De høye HA nivåer på HS-578T celler fremmer binding til LYVE-1 og heft, og cellene kan også bli trukket inn i lymfesystemet.
Den rullende samhandling er en forutsetning for generering av høyfast inter obligasjoner og fast adhesjon [32]. For å bestemme stabiliteten av adhesive interaksjoner, er hydrodynamisk in vitro strømningskammer eksperimenter ofte benyttet [33], [34]. I denne studien, for å undersøke effekten av flyten på klebrighet HA
high-HS-578T celler og HA
lav-MCF-7 celler til COS-7
LYVE-1 (+) og COS-7
LYVE-1 (-) celler, ble cellene eksponert for progressivt økende fluidskjærspenning. Resultatene viste at HA-interaksjoner med LYVE-1 var moderat sterk adhesjon i mediering under betingelser med fysiologiske skjærspenninger på 2,7 dyn /cm
2. Fast adhesjon ble definert som evnen til cellene til å motstå løsgjøring ved en vegg skjærspenning på 10 dyn /cm
2, som tidligere rapportert [33]; Derfor, antallet adherert HS-578T-celler reduseres etter hvert som belastningen økes til 13,54 dyn /cm
2, men de holdt seg delvis bundet til COS-7
LYVE-1 (+) celler sammenlignet med COS-7-
LYVE-1 (-) celler. Videre viste resultatene at HA-interaksjoner med LYVE-1 på SVEC4-10 celler var svake sammenlignet med interaksjonen med COS-7-celler, fordi antallet klebet HS-578T-celler tydeligvis reduseres under fysiologiske skjærspenning på 2,7 dyn /cm
2. Disse resultatene antyder at HA fremmer en forholdsvis svakt og forbigående adhesjon av tumorceller til lymfe endotelceller ved å samhandle med LYVE-1, som også foreslår at deres roller i tumorceller rulle langs endotelet i henhold lymfe flyt. Som en kontroll, HA
lav-MCF-7-celler ble også utsatt for COS-7-celler og SVEC4-10 celler, men ingen vesentlige endringer i adhesjon oppførselen til MCF-7-celler i begge celler ble observert ved en gitt skjær kraft.
Forskning utført av Jackson DG [35] har vist at LYVE-1 ble funksjonelt «dempet» i en celle-spesifikk måte, og at hA-proteinkomplekser slik som hA kabler kan ha den samme kapasitet til å aktivere LYVE -1 som evnen til å aktivere CD44 in vivo [36], [37], [38]. For første gang, gir denne studien bevis for distribusjon og morfologien til HA på tumorcelleoverflater. Vår studie viser at HA-kabler finnes på enkelte tumorcelleoverflater, og at HA er krysset som kabler på celleoverflaten av tumorer kan aktivere LYVE-1. Imidlertid, basert på resultatene publisert av Jung San Huang, stimulerer HA sammentrekning av ER-nettverket i lymfatiske endotelceller i et LYVE-1-avhengig måte [39], og det antas at HA bindes til LYVE-1 i lymfe endothelial celler, noe som var i samsvar med våre resultater. Disse motsetningene kan tilskrives de ulike deteksjonsmetoder som brukes i studiene. Likevel kan HA på overflaten av kreftceller påvirke svulst vedheft gjennom samhandling med LYVE-1 funnet på lymfatiske endotelceller.
I konklusjonen, resultatene tillate oss å bedre forstå mekanismen bak reguleringen av HA på tumorcelleoverflater og adhesjon av tumorceller. HA på kreftcellene formidler deres adhesjon gjennom lymfesystemet endotelceller HA reseptor LYVE-1. Adhesjonsstyrke avhenger av mengden av HA til stede på tumorcellene; imidlertid denne mekanisme bare spiller en rolle ved begynnelsen av prosessen, og mange spørsmål uklare. For eksempel, er det ukjent om tumorcelleoverflaten HA er relatert til HA syntetisk enzym, HA degradering enzym eller andre molekyler. Dessuten er det uklart om HA kabler aktivere LYVE-1 på lymfeårer. Videre arbeid på dette området pågår i vårt laboratorium.
Materialer og metoder
Reagenser og utstyr Business
Biotinylated HABP (hyaluronan bindende protein, HABP) ble kjøpt fra Merck (Darmstadt , Tyskland). TRITC-merket avidin ble hentet fra BOOSTER (Wuhan, Kina). Alexa Fluor® 488-konjugert streptavidin ble kjøpt fra Life Technologies (Carlsbad, USA). Mouse LYVE-1 antistoff og Rat IgG
2A isotypekontrollantistoff ble kjøpt fra R & D Systems (Minneapolis, USA). DMEM, RPMI-1640, L-15 og F-12K ble kjøpt fra Gibco (Stockholm, Sverige). Føtalt bovint serum (FBS) ble oppnådd fra Hyclone (Lanzhou, Kina).
