Abstract
EMT (epitel-mesenchymale overgang) er avgjørende for kreftceller til å erverve invasive fenotyper. I A549 lunge adenokarsinomceller, TGF-β fremkalte EMT i Smad-avhengig måte og TNF-α akselerert denne prosess, som bekreftet av cellemorfologi, ekspresjon av EMT markører, kapasitet av gelatin lyse og celle invasjon. TNF-α stimulert fosforylering av Smad2 linkerområde, og denne virkning ble svekket ved inhibering av MEK eller JNK-reaksjonsveien. Omfattende ekspresjon analyse raknet gener differensielt regulert av TGF-β og TNF-α, slik som cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer og ECM (ekstracellulære matriser), noe som antyder den drastiske endringen i autokrin /parakrine signaler i tillegg til celle-til-ECM interaksjoner. Integrert analyse av mikroRNA signatur mulig for oss å identifisere en undergruppe av gener, potensielt regulert av microRNAs. Blant dem, bekreftet vi TGF-β-mediert induksjon av MIR-23a i lunge epiteliale cellelinjer, målgener som ble ytterligere identifisert ved genekspresjon profilering. Kombinert med i silikoaluminofosfater tilnærminger, bestemt vi HMGN2 som et nedstrøms mål av MIR-23a. Disse funnene gir en linje av bevis for at effekten av TGF-β og TNF-α ble delvis mediert av microRNAs, og belyse kompleksiteten av molekylære hendelser utløst av TGF-β og TNF-α.
Citation : Saito A, Suzuki HI, Horie M, M Ohshima, Morishita Y, Abiko Y, et al. (2013) En integrert uttrykk Profilering avslører målgener av TGF-β og TNF-α Muligens mediert av microRNAs i lungekreft celler. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10,1371 /journal.pone.0056587
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 30 august 2012; Godkjent: 11 januar 2013; Publisert: 20 februar 2013
Copyright: © 2013 Saito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI (Grants-i-Aid for Scientific Research) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi og tilskudd fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den hyppigste krefttypen, noe som fører til døden av mer enn én million mennesker hvert år. Forståelse av molekylære hendelser som styrer invasiv /metastatisk spredning av kreftceller er avgjørende for å utvikle nye behandlingsformer for lungekreft. Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er differensiering bryteren regi epitelceller til å erverve mesenchymale fenotyper, som spiller viktige roller under embryonal utvikling samt kreft invasjon /metastasering. Kjennetegnet av EMT er E-cadherin downregulation og påfølgende tap av celle-celle adhesjon, som er kombinert med økt uttrykk av mesenchymale markører inkludert N-cadherin og vimentin. I tillegg EMT er sammen med cellen morfologiske endringer fra «cuboidal» til «spindel-lignende opptredener, som tilsvarer aktin omorganisering og cytoskeltal endringer, som fører til kjøp av fibroblast-lignende trekkfugl fenotype [1], [2].
Transforming growth factor (TGF) -β spiller en sentral rolle i regulering av EMT og viser sine pleiotrope effekter gjennom binding til reseptorer type i (TβR-i) og type II (TβR-II). Ved ligand-induserte heterokompleksdannelse mellom TβR-I og TβR-II, TβR-I er fosforylert av TβR-II og formidler spesifikk intracellulær signalering gjennom fosforylering av reseptor-regulert Smads (R-Smads: Smad2 og Smad3 for TGF-β) . Fosforylert R-Smads samhandle med Smad4 og translocate inn i kjernen, hvor de regulerer transkripsjon av målgener [3], [4]. TGF-β er ofte overuttrykt i tumorvev, og letter kreft progresjon gjennom en mangfoldig repertoar av tumor-celle-autonome og vert-tumor-interaksjoner, inkludert forbedring av celle-motilitet og invasjon, noe som innebærer prosessen med EMT [5].
Samler bevis avslører de molekylære mekanismer som betennelsesreaksjoner fremmer tumorprogresjon [6]. Tumornekrosefaktor (TNF) -α er en av de mest potente pro-inflammatoriske cytokiner produsert i svulsten mikromiljøet. Ved stimulering, aktivert IKK (IKB-kinase) fosforylerer NFkB inhibitor (IkB) og utløser den hurtige nedbrytning gjennom proteosomet proteolyse, noe som resulterer i frigjøringen av NFKB, som deretter translocates til kjernen og induserer en myriade av genekspresjon som er involvert i immunresponsen [7 ]. Bidraget av NFkB aliserte til initiering og progresjon av kreft er klart dokumentert, og flere linjer av bevis viser at TNF-α og /eller NFkB signale spiller en sentral rolle i regulering av EMT [8], [9], [10 ].
kodende microRNAs (mirnas) tiltrekke økende oppmerksomhet som viktige komponenter i cellesignalisering, som regulerer uttrykk nivåer av flere proteiner, primært ved binding til 3 «ikke-translatert område (UTR) av mål. Viktige roller for mirnas har vært vist i tumorprogresjon ved modulering av celledifferensiering, spredning, invasjon og metastasering. MikroRNA-200 (MIR-200) og MIR-205 er kritisk involvert i å opprettholde den epitelcelle fenotype og undertrykkes av TGF-β [11]. Det er også rapportert at MIR-21 og MIR-31 er synergically indusert av TGF-β og TNF-α, som letter kreftcelle invasjon [12].
Nyere studier har vist at TNF-α forbedrer TGF β-mediert EMT i lungekreft /epitelceller [13], [14], [15], som tyder på mulige crosstalks mellom disse signaler. Men lite er kjent om de molekylære hendelser hvordan disse signalene blir orkestrert å modulere EMT. Vi har tidligere vist at TGF-β induserer EMT i A549 lunge adenokarsinomceller [16], som havn en aktiverende K-ras-mutasjon og danner en svulst med godt differensiert adenocarcinom histologi når injisert subkutant inn i immunocompromized mus [17], [18] . I denne studien, utforsket vi de underliggende mekanismene for EMT mediert av TGF-β og TNF-α i A549 celler. På jakt etter målet gener og mirnas, utførte vi omfattende uttrykk analyser i kombinasjon med i silico screening. Disse data avgrenset undergrupper av gener differensielt eller samvirkende regulert av TGF-β og TNF-α, og identifisert MIR-23a som et mål miRNA av TGF-β. Disse analysene antydet videre muligheten for at en undergruppe av TGF-beta målgener kunne være regulert av mirnas, belyse kompleksiteten av molekylære hendelser utløst av TGF-β og TNF-α i lungekreftceller.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
TGF-β1 og TNF-α ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og R 0,05 (t-test)
Neste vi undersøkt effekten av TβR-I kinase hemmer, LY-364947. Blokkering av endogen TGF-β signalisering av LY-364947 ført jevnt cuboidal cellemorfologi, og virkningen av eksogen TGF-β var tydelig opphevet i nærvær av LY-364947. På den annen side ble TNF-α-mediert celle morfologisk endring fremdeles observert, om enn i mindre grad, i cellene forbehandlet med LY-364947, som indikerer effekten av TNF-α alene som utøves i fravær av endogen TGF-β signalering (Figur 1A, lavere paneler).
Disse morfologiske endringer ble kvantifisert ved å måle celle sirkularitet (figur 1B). I cellene costimulated med TGF-β og TNF-α ble celle sirkularitet betydelig redusert, noe som tyder på synergistisk effekt på cellemorfologi. I nærvær av LY-364947, deres effekter var hovedsakelig inhiberes, noe som tyder på det kritiske bidrag av TGF-β til den observerte synergistisk effekt.
Fremgangsmåte ifølge EMT er ledsaget av nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N -cadherin, som er betegnet som cadherin bryteren [1], [2]. I de følgende eksperimenter, undersøkte vi ekspresjon av E-cadherin og N-cadherin, som epiteliale og mesenkymale markører, respektivt. E-cadherin uttrykk ble stort sett opphevet av TGF-β behandling mens TNF-α alene viste en marginal effekt på E-cadherin downregulation på proteinnivå (figur 1C). I samsvar med den forandring i E-cadherin ekspresjon, ble N-cadherin oppregulert ved behandling med TGF-β eller TNF-α. Videre er det i samsvar med den dramatiske forandring i cellemorfologi, forsterket TNF-α effekten av TGF-β på epitelial /mesenchymale markører. Effekten av TGF-β på ekspresjon av E-cadherin /N-cadherin ble inhibert av LY-364947, mens TNF-α-mediert oppregulering av N-cadherin ble også observert uavhengig av LY-364947-behandling.
EMT er sammen med forbedring av protease-aktivitet som fremmer nedbrytning av basalmembran og ekstracellulære matriser (ECM) som omgir tumorceller, noe som er kritisk for tumor invasjon /metastase. For å analysere proteolytiske aktivitetene av matriks-metalloproteinaser (MMP) i celler behandlet med TGF-β og /eller TNF-α, utførte vi gelatin zymografi (Fig 1 D). TGF-β forsterket aktiviteten til MMP-2, mens TNF-α forsterkes det av MMP-9. Spesielt, ko-stimulering med TGF-β og TNF-α drastisk fremmet aktiviteter både MMP-2 og MMP-9, noe som tyder på synergisk effekt å forbedre MMP aktiviteter. I nærvær av LY-364947, ble effekten av TGF-β tydelig hemmet, mens effekten av TNF-α å forbedre MMP-9 aktivitet ble fremdeles observert om enn i mindre grad, i fravær av endogen TGF-β signalering.
for å undersøke funksjonelle aspektet av EMT, utførte vi invasjonen assay, som benytter kamre belagt med Matrigel, etterligne basalmembran. TGF-β eller TNF-α behandlingen resulterte i beskjedent økt antall av invaderende celler på den nedre flate av kamrene, mens ko-stimulering med TGF-β og TNF-α førte til forbedret invasiv kapasitet, i overensstemmelse med de ovenfor observerte forandringer (figur 1E). TGF-β behandling klarte å forbedre invasiv kapasitet så robust som endringene i EMT markører, noe som tyder på at endringer i markører ikke er direkte knyttet til celle invasivitet. Prosessen med invasjon omfatter forbedret celle motilitet og proteolytiske aktiviteter. Sammen med resultatene av gelatin zymografi, økt invasiv kapasitet i cellene costimulated med TGF-β og TNF-α viste seg å være relatert til forbedrede MMP aktivitet.
Til sammen ble TGF-β-mediert EMT tydelig forbedret av TNF-α som dømt av celle morfologi, EMT markører, gelatin lyse og celle invasjon. TNF-α alene kan også indusere en del av disse endringene, selv i nærvær av LY-364947, som for eksempel N-cadherin oppregulering og MMP-9 aktivering. Disse observasjonene bedt oss om å utforske mulige crosstalks mellom TGF-β og TNF-α, og molekylære hendelser som regulerer EMT i A549 celler.
TGF-β-mediert EMT er Smad avhengig
Smads er de viktigste transduser av TGF-β signalering; Smad2 og Smad3 fosforyleres av TβR-I, og danner komplekser med Smad4. Disse komplekser akkumuleres i kjernen og regulere transkripsjon av målgener [20]. Foruten Smad-mediert transkripsjon, aktiverer TGF-β andre signalkaskader, inkludert MAPK (mitogen-aktivert protein kinase) trasé [21].
For å undersøke om Smad-mediert signalisering er involvert i reguleringen av EMT i A549 celler, vi slått ned endogen Smad4, som vanligvis kreves for Smad-mediert transcriptional regulering. Transfeksjon av siRNA effektivt dempet Smad4 uttrykket (figur 2A, til venstre), og ytterligere undertrykket ekspresjon av Smad-regulerte målgener av TGF-β, slik som Smad7 og PAI-1 (plasminogen aktivator inhibitor-1, også kjent som
SERPINE1
) (figur 2B). I denne innstillingen, TGF-β mislyktes i å nedregulere E-cadherin som bedømt ved kvantitativ RT-PCR (figur 2A, til høyre), noe som tyder på at TGF-β-mediert EMT er i hovedsak regulert av Smad pathway. Disse effektene ble ytterligere bekreftet ved immunblotting. TGF-β mislyktes i å nedregulere E-cadherin eller oppregulere N-cadherin effektivt som kontroll siRNA transfekterte cellene når endogent Smad4 ble stille (figur 2C).
(A-B) A549-celler ble transfektert med sirnas for Smad4 ( si Smad4), eller negative kontroll sirnas (Si NTC) og dyrket i 48 timer. Cellene ble ytterligere dyrket med 5 ng /ml TGF-β1 og /eller 10 ng /ml TNF-α i 2 timer, (B) eller 24 timer (A), og RNA ble oppsamlet. Kvantitativ PCR ble utført for Smad4, E-cadherin, Smad7 og PAI-1 på den angitte tiden. Expression ble normalisert til at av GAPDH. Feilfelt: SD. (C) Cellelysater ble samlet 48 timer etter TGF-β1 og /eller TNF-α behandling. Immunoblotting ble utført for E-cadherin, N-cadherin og Smad4. α-tubulin ble brukt som lasting kontroll.
TNF-α phosphorylates Smad2 Linker omegn
R-Smad og Smad4 inneholder konservert N-terminale MH1 og C-terminal MH2 domener, flankerer linkersegmentet. Ligand-induserte vekselvirkningen mellom R-Smads med aktiverte TβR-I resulterer i direkte fosforylering av C-terminale SSXS motiv [20], som er den sentrale begivenhet av Smad aktivering. Videre andre kinase trasé videre regulere Smad signaliserer via fosforylering av linker-regionen i R-Smads [21], [22]. Dess NFkB signalering, blir TNF-α kjent for å fremkalle MAPK veier, som besto av tre underfamilier, dvs. ekstracellulære signalregulerte kinase (Erk) 1 og 2, p38 MAPK og c-Jun N-terminal kinase (JNK).
for å undersøke mulighetene modulering av Smad signale av TNF-α, undersøkte vi fosforylering av C-terminal eller linker regioner av R-Smads. TGF-β sterkt fremkalte fosforylering av Smad2 og Smad3 C-terminale regioner, mens TNF-α ikke viser noen virkning. På den annen side, TNF-α stimulering førte til fosforylering av linkerområde av Smad2, uavhengig av TGF-β stimulering (figur 3A).
(A) A549-celler ble stimulert med TGF-β1 og /eller TNF-α i 60 min og immunoblotting ble utført for total Smad2, fosforylert Smad2 (linker region: Ser 245/250/255), fosforylert Smad2 (C-terminal region: Ser 465/467), total Smad3, fosforylert Smad3 (C- terminal region: Ser 423/425). (B) A549-celler ble forbehandlet med DMSO eller kjemiske inhibitorer (LY-364947, U0126, SP600125 og SB203580) i 60 minutter, etterfulgt av TNF-α stimulering. Cellelysatene ble samlet på angitte tidspunkter, og immunoblotting ble utført for Smad2, fosforylert Smad2 (linker region: Ser 245/250/255), Erk, fosforylert Erk, p38, fosforylert p38 og fosforylert c-juni α-tubulin ble brukt som lasting kontroll.
Neste vi videre søkt å belyse hvilke kinase er involvert i TNF-α-mediert fosforylering av Smad2 linker regionen, som bruker kjemiske hemmere som LY-364947, U0126 , SP600125 og SB203580 (figur 3B). TNF-α stimulering førte til fosforylering av Erk, p38 og c-Jun, et substrat av JNK. TNF-α stimulering også fremkalte fosforylering av linkeren av Smad2 i 30-120 minutter, og nådde en topp ved 60 min. LY-364947 mislyktes i å avskaffe denne virkning, som viser effekten av TNF-α uavhengig av TβR-I-kinaseaktivitet. Av inhibitorene som ble testet, ble TNF-α-mediert fosforylering Smad2 linkeren opphevet ved U0126, en MEK-inhibitor som også kunne avskaffe fosforyleringen av Erk, en nedstrøms substrat for MEK. Den JNK inhibitor, SP600125 avskaffet fosforylering av c-Jun, en nedstrøms substrat av JNK, og delvis hemmet Smad2 linker fosforylering. P38 MAPK-inhibitor, SB203580 mislyktes i å påvirke Smad2 linker fosforylering ved den konsentrasjon som er vist å være effektiv i tidligere rapporter.
Disse resultatene antydet at TNF-α utløser fosforylering av Smad2 linkerområde, som kan modulere Smad-regulert gen transkripsjon [22]. Denne effekten syntes å være i stor grad formidlet av MEK-Erk sti og sannsynligvis JNK kan også spille en rolle, om enn i mindre grad (figur 3B).
Microarray analyse Viser Differential Gene Regulering av TGF-β og TNF α
For å oppnå omfattende innsikt i transkripsjons endringene som skjer på TGF-β og /eller TNF-α behandling, genekspresjon profilering ble utført. Totale RNA-prøver ble fremstilt fra A549-celler behandlet med TGF-β og /eller TNF-α i 2 timer eller 24 timer, og ble ytterligere analysert ved mikromatriseanalyse (figur 4A). Transkripsjonene indusert 1,5 ganger eller undertrykt. 0,67 ganger, inkludert de som ikke kommentert, ble oppført i File S1 og File S2 (dataene på 2 timer og 24 timer, henholdsvis)
(A ) Punktdiagram som representasjon av transkripter i prøvene som ble behandlet med TGF-β1 og /eller TNF-α i 2 timer eller 24 timer (Y-akse), sammenlignet med de ikke-stimulert kontroll (X-aksen). Transkripsjonene er plottet ved hjelp av log2 normaliserte data. Terskelen for transkripsjonsnivåer ble satt som indusert 2,0 ganger eller undertrykt 0,5 ganger, og er angitt i hver scattergram. (B) Venn diagram som viser overlappingen mellom gener oppregulert (opp) eller nedregulert (ned) av TGF-β1 og /eller TNF-α behandling i 2 timer eller 24 timer. Terskelen for transkripsjonsnivåer ble satt som indusert 2,0 ganger eller undertrykt 0,5-fold. Tallene angir antall kommenterte gener. (C) Punktdiagram som representasjon av modne mirnas i prøvene som ble behandlet med TGF-β1 og /eller TNF-α i 24 timer (X-akse), sammenlignet med de ikke-stimulert kontroll (Y-aksen). Terskelen av miRNA nivåer ble satt som indusert 2,0 ganger eller undertrykt 0,5 ganger, og er angitt i hver scattergram. (D) Kvantitativ RT-PCR for modne MIR-23a. A549, H441 og BEAS2B celler ble behandlet med TGF-β1 i 24 timer. Ekspresjon ble normalisert til den av U6. . Feilfelt: SD
For den videre analysen, setter vi terskelen til transkripsjonsnivåer som induseres 2,0 ganger eller undertrykt 0,5 ganger, og ekskludert Umerket transkripsjoner. Dermed har vi identifiserte gener med endret ekspresjon sammenlignet med ikke-stimulert kontroll, i 3 sammenlignende sett, dvs. TGF-β-stimulert, TNF-α-stimulerte og TGF-β /TNF-a-stimulerte grupper (figur 4B).
Som en generell tendens, TGF-β-regulert og TNF-a-regulerte gener var stort sett eksklusiv, viser differensial regulering av gentranskripsjon. I tillegg ble oppregulert gener identifisert mye mer enn de nedregulert. Genene som induseres av TNF-α var mer fremtredende enn TGF-β på 2 timer, mens antall gener oppregulert ved TGF-β var mye høyere ved 24 timer sammenlignet med de på 2 timer, eller de av TNF-α. På 24 timer, det var en brøkdel av gener som var opp- eller nedregulert av TGF-β og TNF-α ko-stimulering, men ikke en av dem.
Neste vi brukt de publiserte datasett av microarray, som var utført i A549-celler stimulert med TGF-β [23], [24]. Vurderer induksjon . 2,0 ganger så viktig, vi hentet potensielle TGF-β målgener vanligvis indusert i tre uavhengige studier, dvs. 17 gener på 2t og 129 gener på 24 timer, som er vist i File S3
Delsett av gener Forskjellig eller å samarbeide regulert av TGF-β og TNF-α
Flere transkripsjonsfaktorer har vært innblandet i transkripsjonen undertrykkelse av E-cadherin, inkludert
SNAI1 plakater (Snail),
SNAI2 plakater (Slug),
ZEB1
,
ZEB2 Hotell og
TWIST1 product: [25], [26]. Av disse
SNAI1
ble raskt indusert av TGF-β 2 h mens TNF-α heller undertrykte den, noe som tyder på differensial mekanismer for å regulere EMT. Ved 24 timer, ble E-cadherin (
CDH1
) tydelig nedregulert av TGF-β (0,27-ganger), mens den undertrykkende virkning av TNF-α var moderat (0,78 ganger). I overensstemmelse, TGF-β og TNF-α oppregulert ekspresjonen av N-cadherin (
CDH2
) opp til 1,47 ganger i henholdsvis 2,32 ganger og. Den synergiske effekten av TGF-β og TNF-α ble også observert med hensyn til transkripsjonsregulering av
CDH1
og
CDH2
, i overensstemmelse med resultatene i figur 1.
Videre kan genene som oppreguleres mer enn 3,0 ganger fra 2 timer eller 24 timer, ble underklassifiseres og er oppført i tabell 1 og 2, i henhold til de kjente funksjoner. Som en akutt respons ved 2 h, TNF-α potent induserte en rekke cytokiner /chemokiner slik som
CCL2 plakater (MCP-1),
CCL5 plakater (RANTES),
CCL20
,
CXCL1
,
CXCL8 plakater (IL8),
IL1A
,
IL1B Hotell og
IL6
. Signale komponenter av TNF-α-NFkB sti ble også oppregulert inkludert
TNF
,
TRAF1
,
NFKB1
,
NFKBIA Hotell og
NFKBIE
. Videre celleadhesjonsmolekyler som
VCAM1 Hotell og
ICAM1
ble indusert. På to timer etter stimulering, TGF-β indusert begrenset antall gener, inkludert de kjente direkte mål som
SMAD7 Hotell og
HEY1
. Etter 24 timer, TGF-β stimulering resulterte i økt ekspresjon av forskjellige gener kategorisert som (i) regulator av små GTPase, (ii) celleadhesjonsmolekyl, og (iii) ECM, mens TNF-α stimulering viste bare liten effekt på dem.
regulatorer liten GTPase inkludert guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) som
RASGRP1
,
RASGRP3
,
RASGRF2
,
DOCK2 Hotell og
DOCK4
, som aktiverer Ras, Rac og Rap1, samt medlemmer av Rho familien GTPases som
RND1 Hotell og
RHOU
. Cellemotilitet og morfologiske endringer er regulert av små GTPases som Ras, Rac, Cdc42 og Rho familier, som kan moduleres på nedstrømssiden av TGF-β signalering [27].
