Abstract
Eggstokkreft er en immun reaktiv malignitet med et komplekst immunundertrykkende nettverk som blunts vellykket immun utrydding. Dette undertrykkende mikromiljøet kan være mediert av rekruttering eller induksjon av CD4
+ regulatoriske T-celler (tregs). Vår studie søkt å undersøke sammenhengen tumor-infiltrerende CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs, og andre immunologiske faktorer, med klinisk utfall i serøs kreftpasienter på eggstokkene. Vi utførte immunfluorescens og kvantifisering av intraepitelial tumor-infiltrerende trippel positive Tregs (CD4
+ CD25
+ foxp3
+), samt CD4
+ CD25
+ foxp3
-, CD3
+ og CD8
+ T-celler i vevsprøver fra 52 pasienter med høyt stadium serøs ovarialcancer. Tretti-en av pasientene hadde god overlevelse (dvs. 60 måneder) og 21 hadde dårlig overlevelse av 18 måneder. Totale celletall i tillegg til celleforhold ble sammenlignet blant disse to utfalls gruppene. De totale antallet CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs, CD4
+ CD25
+ foxp3
-, CD3
+ og CD8
+ cellene ikke signifikant forskjellig mellom gruppene. Men høyere forholdstall på CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg, CD8
+ /CD4
+ og CD8 /CD4
+ CD25
+ foxp3
– celler ble sett i det gode resultatet gruppen sammenlignet med pasienter med dårlig resultat. Disse dataene viser for første gang at de prosenter av CD8
+ til både CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs og CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler er assosiert med sykdom utfall i eggstokkreft. Foreningen være åpenbar i prosenter i stedet for absolutte telling av T-celler tyder på at effektor /suppressor-forholdet kan være en viktig indikator på resultatet enn enkeltlegemer. Dermed immunterapi strategier som endrer forholdet mellom CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs eller CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler til CD8
+ effektor celler kan være nyttig i å forbedre resultatene i eggstokkreft
Citation. Preston CC, Maurer MJ, Oberg AL, Visscher DW, Kalli KR, Hartmann LC, et al. (2013) Forholdet mellom CD8
+ T celler til CD4
+ CD25
+ foxp3
+ og foxp3
– T celler korrelerer med dårlige kliniske resultatet i Human Serous eggstokkreft. PLoS ONE 8 (11): e80063. doi: 10,1371 /journal.pone.0080063
Redaktør: Muriel Moser, Université Libre de Bruxelles, Belgia
mottatt: 14. august 2013, Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 14.11.2013
Copyright: © 2013 Preston et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til KLK, ELG, LCH: P50-CA116201, R01-CA122443, og P50-CA136393.The finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft har den høyeste dødeligheten av kreft eksklusivt for kvinner. Til tross for mange terapeutiske arbeidet utnytte nye chemotherapies, har vaksinen ikke bedret seg betydelig i flere tiår [1-3]. Det er velkjent at kliniske resultater i eggstokkreft er ganske heterogene og ikke lett forutsies ved hjelp av standard kliniske og patologiske egenskaper (f.eks, karakter, tumorhistologi) [4-6]. Dette tyder på at det kan være andre svulstens mikromiljø eller vertsegenskaper med en dominerende rolle i overlevelse. I de senere år har det vært interesse for å forstå rollen til pasientens immunrespons mot sin eggstokkreft, som sykdommen er tenkt å være en naturlig immun reaktivt malignitet med et komplekst undertrykkende nettverk som effektivt demper vellykket immun utrydding. I løpet av det siste tiåret, har studier vist betydningen av immunsystemet i å påvirke pasientens utfall. Spesielt, Zhang og kolleger publiserte en studie som viste at flertallet av eggstokkreft pasientene hadde tumor-infiltrerende CD3
+ T celler og at infiltrasjon var positivt assosiert med overlevelse [7]. Tilstedeværelsen av T-celler var spesielt gunstig for de personer som demonstrerte en fullstendig klinisk respons på kirurgi og kjemoterapi der fem-års overlevelse var 74% sammenlignet med 12% for de uten T-celler. Senere studier har raffinert forståelse av intra-tumoral T-celler, slik som arbeidet av Sato et al., Som viste pasienter som hadde høye nivåer av infiltrerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) hadde en midlere overlevelse på 55 måneder sammenlignet med de med få eller ingen CTL som hadde en overlevelse på 26 måneder [8]. En unik egenskap ved de konvensjonelle terapeutiske strategier for eggstokkreft er at T-celle-funksjonen blir raskt utvinnes etter konvensjonell kjemoterapi [9]. Antigenene som pasientene er naturlig å reagere nå blir systematisk undersøkt [10,11]. Sammen er disse funnene viser at anti-tumor immunitet utløses mot eggstokkreft og påvirker kliniske forløpet av sykdommen. Imidlertid er det nå klart at den anti-tumor immunitet oppveies av en immunundertrykkende mikro [7,12-15].
En av de cellulære faktorer som kan megle dette immunsuppresjon i svulsten mikromiljøet er de regulatoriske T-celler (Treg) befolkningen. Forskning på tregs har avansert raskt, særlig i sammenheng med kreft. Tregs er en heterogen CD4
+ T-celle subpopulasjon hvis primære funksjon er immune regulering ved å blokkere funksjonen av aktiverte T-celler. CD4
+ Tregs kan deles inn i to hoved undergrupper: naturlig forekommende Tregs med et CD4
+ CD25
+ foxp3
+ fenotype og indusert Tregs med en variabel CD25-ekspresjon [12]. Tidligere studier har vist at gaffelhode boksen P3 (foxp3) er en sentral transkripsjonsfaktor som regulerer utvikling og funksjon av CD4
+ Tregs [16,17]. Videre studier har også vist at ekspresjon av CD25, er en komponent av den høyaffinitets-IL-2-reseptoren, er avgjørende for treg overlevelse, noe som er svært avhengig av IL-2 [18,19]. I det siste tiåret har det vært flere studier knytter Tregs med å overleve i mange typer kreft. I eggstokkreft, Curiel og kolleger viste i utgangspunktet en sterk assosiasjon av CD4
+ CD25
+ T celler med dårlig overlevelse [14]. Av notatet, den spesifikke rollen trippel farget CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T celler ble ikke vurdert. Et par år senere, Sato og kolleger klarte ikke å se noen direkte tilknytning til CD25
+ foxp3
+ T celler i eggstokkreft, men gjorde viser at lave totale CD8
+ T-celler og CD8
+ /CD25
+ foxp3
+ T-celle-forholdet var assosiert med dårligere overlevelse, igjen i en befolkning med varierende histologier [8]. I enda en nyere studie Milne og kolleger viste i høy grad serøs eggstokkreft, at telling av intraepitelial celler enkeltvis farget for foxp3
+ ble assosiert med sterkt forbedret overlevelse [20]. Men deres studie ikke spesifikt definere celletype som uttrykker foxp3. Gitt at andre celler i tillegg til T-celler uttrykker foxp3 (for eksempel tumorceller og B-celler), betydningen av dette arbeidet, mens interessant, er uklar [21,22]. Videre, siden både CD8
+ og CD4
+, regulatoriske og
in vitro
aktiverte T-celler er kjent for å uttrykke foxp3, den spesifikke identiteten til celletype som er involvert i å endre overlevelse er ukjent. Men nå nylig, Kryczek og kolleger viste at i primære svulster eller autoimmune lesjoner, foxp3 og CD25 er en svært konkret og pålitelig markør sett for primære humane CD4
+ Tregs [23].
Hoveddelen av vår studie var å undersøke sammenhengen tumor infiltrerer CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs og andre T-celler med klinisk utfall i epiteliale kreftpasienter på eggstokkene, siden denne tilnærmingen av triple flekker har ikke blitt gjort i ovarietumorer til vår beste kunnskap. Nærmere bestemt, studerte vi en unik kohort, begrenset til pasienter med fremskredet stadium serøs eggstokkreft (den vanligste og mest dødelige histologi), som består av to undergrupper av pasienter med vidt forskjellige kliniske resultater, en med meget dårlig overlevelse ( 18 måneder) og den andre av pasienter med mye bedre overlevelse ( 60 måneder).
Materialer og metoder
pasienter og kliniske kjennetegn
studiet ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board og alle pasientene gav skriftlig informert samtykke for forskningsbruk av prøver. Strøm beregninger ble utført via simulering til å anslå antall prøver for å påvise en meningsfull forskjell overlevelse hos pasienter med kreft i eggstokkene. Femtito pasienter, valgt fra ulike utfallsmål grupper med dårlig resultat ( 18 måneders overlevelse) og godt resultat ( 60 måneders overlevelse), forutsatt 82,5% strøm på en alfa på 0,05 for å påvise en total overlevelse hazard ratio på 1,65 mellom dichotomous CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg grupperinger på tvers av alle eggstokkreft pasienter. Dette betyr minst 80% styrke til å påvise en effektstørrelse (endring i antall eller forholdet av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs) på 0,8 ved evaluering Tregs mellom de to ulike utfalls grupper med dårlig utfallet (
n
= 21) og godt resultat (
n
= 31) med en Kruskall Wallace test, som utføres i denne studien. Alle prøver ble valgt fra pasienter med optimalt debulked høy scene, serøs eggstokkene, eggleder eller primær peritoneal carcinoma.
Farging og immunfluorescens analyse av vevsprøver
Alle frosne prøveblokker, som tidligere innebygd i tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), ble cryosectioned (5 um), fast i aceton i 10 minutter, lufttørket i en time og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk. Før farging ble alle lysbilder blokkert i 10 minutter ved romtemperatur (25 ° C) med serumfritt protein blokken (Dako, Carpinteria, CA) og deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS). Farging ble utført ved inkubasjon av skinnene ved værelsestemperatur (25 ° C) i fuktige mørke kamre i 2 timer med primære antistoffer fortynnet i antistoff-fortynningsmiddel-reagens (Dako, Carpinteria, CA). Kanin polyklonalt anti-human foxp3 (Abcam, Cambridge, MA) ble benyttet ved en fortynning 1:75, muse-monoklonalt anti-humant CD4 (Abcam, Cambridge, MA) ved 1: 100, rotte monoklonale anti-human CD25 (Abd Serotec, Raleigh, North Carolina) ved 1: 100, monoklonalt anti-human CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA) ved 1: 100, og monoklonalt anti-human CD3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) på 01:50. Etter farging med primære antistoffer, ble slides så vasket i 15 minutter med PBS og inkubert i 1 time i en fuktig mørkt kammer med sekundære antistoffer (Alexa fluor 405, 488 og 594 som er konjugert, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) ved en fortynning på 1: 500. Antistoffer for foxp3, CD4 og CD25 ble brukt for trippel farging av tregs mens antistoffer til CD3 og CD8 ble brukt som enkle flekker. Enkeltvis fargede celler ble også motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 100 ng /ml) i 30 minutter. Humane tonsillare vev ble anvendt som en positiv kontroll, og negative kontroller ble utført ved å utelate det primære antistoff, og ved hjelp av isotype kontroller for hvert antistoff.
Konfokalmikroskopi og celle kvantifisering
De fargede objektglass ble evaluert i en LSM 510 konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Oberkochen, Tyskland). Intraepitelial fargede celler ble vurdert på kraftige forstørrelse skannede felt av tilfeldige epitelceller seksjoner unngå stromal områder. De skannede felt ble plassert for å unngå overlapping og bleking og til å dekke hele svulsten delen. Tjue tilfeldige felt (300 mikrometer
2) ble digitalt fotografert for hver pasientprøve. Kvantifisering av positive celler ble utført manuelt ved observatører blindet for all klinisk informasjon. En undergruppe av tilfeldig valgte prøver ble gjennomgått av en sekundær observatør. Totalt tellinger av celler fra hvert felt ble registrert i enten trippel farget (CD4, CD25 og foxp3) eller singel farget (CD8 eller CD3) prøver.
Når tumorprøver ble undersøkt grovt under konfokalmikroskopi, tumor-infiltrerende lymfocytter ble observert både i stroma og epitel. Dermed ble forsiktig oppmerksomhet på å etablere telle feltene utelukkende innenfor epitel områder. Følgende celler ble kvantifisert i trippel farget prøvene og brukes i analysen: CD4
+ CD25
+ foxp3
+, CD4
+ CD25
+ foxp3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
+, CD4
-CD25
+ foxp3
+, CD8
+ DAPI
+ og CD3
+ DAPI
+. Intraepitelial tumor infiltrerer tregs ble definert som CD4
+ CD25
+ foxp3
+ celler, med CD4 (rød signal) og CD25 (grønt signal) flekker oppdaget i cytosoliske og membran områder gir en oransje og /eller gul mønster og foxp3 (blå signal) oppdaget som en intra-kjernekraft og typisk prikkete flekken mønster. Den primære vurderingen av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg kvantifisering var den totale treg telle på tvers av alle 20 bilder fra en tumorprøve. Dette ble gjort i motsetning til tidligere studier som generelt kvantifisert Tregs ved hjelp av bruker identifisert fokusområder infiltrasjon [8,14]. Vi testet gyldigheten av disse tidligere fremgangsmåter ved også å bruke andre målinger for hver tumor, nemlig det høyeste enkelt bilde telle fra en tumorprøve (MAX1) og summen av de tre høyeste tellinger fra en tumorprøve (MAX3).
Tumor-infiltrerende lymfocytter isolert
I videre undersøkelser, tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) ble høstet fra seks ovarietumorer og isolert av usammenhengende Ficoll gradient som tidligere beskrevet [24]. Kort sagt ble lymfocyttene separert fra tumorcellene ved sentrifugering av cellesuspensjonen på en to-lags Ficoll gradient, 100% lag på bunnen og 75% lag på toppen. De isolerte Tīlss ble deretter farget for flowcytometrisk analyse, som beskrevet nedenfor.
Strømningscytometri
Cell overflate og intracellulær markør farging ble utført på isolerte Tīlss (1 x 10
6) som beskrevet tidligere [25]. To sett av eksperimenter ble utført; i det første settet un-stimulerte celler ble farget med følgende konjugerte antistoffer: CD3-PE-Cy7, CD4-Pacific Blue, CD8-Alexa Fluor 700, CD1c-APC, BDCA2-FITC og CD68-PerCP-Cy5.5. I den andre, setter vi farget un-stimulerte og stimulerte celler for CD4-Pacific blue, CD25-PE, foxp3-Alexa Fluor 647 og TGF-β-PE-Cy7. Før farging Tīlss ble stimulert ved inkubasjon med 5 ng /ml concanavalin-A (Con-A, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 0.7μl /ml BD GolgiStop ™ (BD Biovitenskap, San Jose, California) i 8 timer, deretter vasket, tellet og resuspendert i FACS-buffer (PBS med 1 mM /l EDTA og 3% bovint serum-albumin). Foxp3 og cytokin farging ble utført i henhold til produsentens intracellulær farging protokollen (eBioscience, San Diego, California). Passende isotype-antistoffer ble anvendt som kontroller. Alle antistoffer ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Jose, California) med unntak av følgende antistoffer: TGF-β-PE-Cy7 og CD3-PE-Cy7 var fra eBioscience (San Diego, California), BDCA2-FITC fra Miltenyi Biotec (Auburn , CA) og CD68-PerCP-Cy5.5 ble kjøpt fra BioLegend (San Diego, California). Prøvene ble kjørt på en FACS Scan II og analysert ved hjelp av FlowJo 10.0.5.
Dataanalyse
De distribusjoner av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg teller mellom pasienter med god og dårlig utfall ble undersøkt grafisk og sammenlignet ved bruk av Wilcoxon rank-sum tester (Mann-Whitney
U
test). -Forhold ble beregnet som antall CD8
+ celler dividert med antall CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs for en gitt pasient. Celletall er oppsummert som median og interkvartilt område (IQR). For parvise sammenligninger av flowcytometri data, ble en paret Student t test brukt. Den statistiske signifikans ble satt til en p-verdi på ≤ 0,05.
Resultater
Kliniske pasientkarakteristika
Femti to tumorprøver møte studiekriteriene ble valgt fra vevet bank. Pasientkarakteristika er oppsummert i tabell 1. Median alder av pasientene i studien var 65 år (range, 37-86 år). Alle pasientene ble diagnostisert med avansert stadium (71% stadium III, 29% stadium IV) sykdom, ble optimalt debulked, og hadde svulster med serøs morfologi. Median overlevelse i dårlig resultat gruppen var 12,4 måneder (range 3,0 til 16,7) og median overlevelse i det gode resultatet gruppen har ennå ikke nådd med 73,8 måneder median oppfølgingstid (range 60,1 til 116,8).
godt resultat
dårlig resultat product: (
n
= 31) (
n
= 21) P-valueAge på DiagnosisMedian62.069.00.0059Range (37.0-80.0) (50.0-86.0) StageIII23 (74,2%) 14 (66,7%) 0.56IV8 (25,8%) 7 (33,3%) GradeLow3 (9,7%) 0 (0,0%) 0.20High28 (90,3%) 21 (100 %) Vital StatusAlive24 (77,4%) 0 (0,0%) NADead7 (22,6%) 21 (100,0%) første linje ChemotherapyPlatinum2 (6,5%) 1 (4,8%) 0.20Platinum og Taxane27 (87,1%) 15 (71,4%) Andre2 (6,5%) 5 (23,8%) Tabell 1. Pasient Kjennetegn
God utfallet 60 måneders overlevelse, dårlig utfall 18 måneders overlevelse; alle tilfeller var serøs kreft og optimalt cytoreduced. CSV Last ned CSV
telling av intraepitelial tumor-infiltrerende T-celler
intraepitelial infiltrere celler (CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs, CD4
+, CD8
+, CD3
+, CD4
+ CD25
+ foxp3
– og CD4
+ CD25
-FOXP3
+) ble kvantifisert og analysert i alle felt. Representative skannede felt av svulst infiltrere antatt CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs samt CD4
+ CD25
+ foxp3
– er vist i figur 1A. Figur 1B viser representative CD8
+ og CD3
+ T-celle infiltrasjon. Analysen avdekket en beskjeden, men statistisk signifikant lineær sammenheng mellom tellinger av CD3
+ T-celler og CD4
+ eller CD8
+ T-celler (figur 1C).
(A) Bilde av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs i eggstokkene tumorprøver. Øverst til venstre panelet viser CD4 uttrykk (rødt signal), panel øverst til høyre viser CD25 uttrykk (grønt signal), nederst til venstre panelet viser foxp3 uttrykk (blå signal) og panel nederst til høyre viser de samlede signaler med piler som peker til trippel farget CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs. I dette bildet Tregs blir sett i nær kontakt til CD4
+ CD25
+ foxp3
– celler. (B) Bilde av intraepitelial infiltrere CD8
+ cytotoksiske T-celler (venstre panel) og CD3
+ lymfocytter (høyre panel) i eggstokkreft. Denne representanten scan viser CD8 og CD3 uttrykk (rød signal = CD8 eller CD3, blå signal = DAPI) i eggstokkene tumormasse. (C) Korrelasjon tomten sammenligne CD3 teller til enten CD8 (fylte symboler) og CD4-tall (åpne symboler). Symbolene som representerer summen av 20 felt telles for en unik pasient. Alle pasienter er representert. De innfelte linjene er et produkt av lineær regresjonsanalyse. (D) Viser den totale gjennomsnittlige (± SEM,
n
= 52) CD3
+, CD4
+ og CD8
+ T-celler (sum av 20 felt) for alle pasienter. (E) korrelasjon tomten sammenligne den totale treg (dvs. CD4
+ CD25
+ foxp3
+) teller med summen av maksimum 3 (MAX3) felt eller maksimalt feltet count (MAX1). Symbolene som representerer summen av 20 felt telles for en unik pasient. Alle pasienter er representert. De innfelte linjene er minste kvadrater regresjonslinjer.
Gitt at tidligere studier undersøkt og nummerert ikke-tilfeldig T celle beriket felt, undersøkte vi gyldigheten av denne tilnærmingen ved å vurdere sammenhengen mellom den totale CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg telling på tvers av alle 20 felt og MAX1 og MAX3 teller. Som vist i figur 1D, var det meget sterke statistisk signifikante korrelasjoner, noe som tyder på at tidligere fremgangsmåter for å opplisting infiltrerende T-celler i stor grad er gyldig.
T-celler har ikke direkte korrelerer med klinisk resultat i human serøs eggstokkreft
Første analyser fokusert på korrelasjon av celletall med utfallet grupper. I motsetning til tidligere arbeid, intraepitelial CD3
+ T-celler ble ikke observert ved signifikant forskjellige nivåer hos pasienter med godt resultat (median 154 celler (sum av 20 felt), IQR 89-297) sammenlignet med pasienter med dårlig utfall (median 179, IQR 73-333, tabell 2). Tilsvarende mengder av infiltrerende CD4
+ (370, IQR 249-461 i god gruppe vs 377, IQR 264-524 i den fattige gruppen) og CD8
+ T-celler (115, IQR 53-180 i god gruppe vs 48, IQR 17-180 i den fattige gruppen) var ikke signifikant forskjellig mellom de gode og dårlige utfallet grupper.
godt resultat (n = 31)
dårlig resultat (n = 21)
Median
IQR
Median
IQR
P- verdi
Cell Counts
1CD3
+15489-29717973-3330.881CD4
+370249-461377264-5240.514CD8
+11553-1804817-1800.271CD4
+CD25
+FOXP3
+10155-16110992-1460.444CD4
+CD25
+FOXP3
-14890-187147105-2310.251Ratios
2CD8
+/CD3
+0.580.34-0.910.430.20-0.700.198CD4
+/CD3
+2.061.33-3.431.731.32-3.670.985CD8
+/CD4
+0.270.20-0.440.130.07-0.370.050CD3
+/CD4
+ CD25
+ foxp3
+ 1.720.95-2.681.380.79-2.490.695CD3
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
-1.310.71- 2.061.240.72-1.640.490CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ 0.980.49-1.790.320.25-1.020.027CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
-0.650.43-1.190.460.13-0.770.048CD4
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ 2.912.59-4.313.042.39-3.460.332CD4
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
-2.501.94-3.192.161.80-2.640.351Table 2. Sammenligninger av T-celle nivåer eller prosenter.
1Sum av cellen tellinger av alle 20 felt,
2Ratio av summen av alle 20 felt; IQR, interkvartilt område; statistisk signifikante endringer vises i fet skrift. CSV Last ned CSV
Bruk CD25 og foxp3 markører, kunne CD4
+ T-celler deles inn i fire grupper. De to største gruppene var CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs (~ 33,2% blant alle pasienter) og CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler (~ 43.1 %). De to andre mindre grupper var CD4
+ CD25
-FOXP3
+ T-celler (~ 14,4%) og CD4
+ CD25
-FOXP3
– T-celler (~ 9,3 %). Vi så ingen forskjell i nivåene av CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler mellom pasient utfallet grupper. De mediane nivåene var 148 celler (IQR 90-187) i godt resultat gruppen og 147 (IQR 105-231) i dårlig resultat gruppe (tabell 2). Tilsvarende mediane CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs blant pasienter med godt resultat var ikke annerledes i forhold til pasienter med dårlig resultat. Alle tumorprøver viste CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg infiltrasjon med en kombinert rekke 14-350 celler. Prosentandelen av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs mellom total intraepitelial CD4
+ infiltrere celler var 31 ± 10% i det gode resultatet gruppen sammenlignet med 34 ± 11% i dårlig resultat pasientgruppen (p = 0,319).
En viktig observasjon fra disse sammenligningene er at CD4
+ T-celletall var høyere enn CD3
+ teller når ekvivalens var forventet. (2A). En mulig grunn for mangelen på korrelasjon kan være at CD4 og CD8-antistoffer er fargingen en blanding av både lymfoide og myeloide celler, siden det har tidligere blitt rapportert at begge markørene kan uttrykkes på forskjellige leukocytt-undersett, inkludert lymfoid og myeloid. Alternativt CD3 kan bli nedregulert i T-celler på grunn av kronisk stimulering i tumoren mikromiljøet [26,27]. Vurderer disse problemene, renset vi tumor infiltrerer mononukleære celler fra tre pasienter med eggstokkreft, farget dem med ulike lymfoide og myeloide markører og utført flowcytometrisk analyse. Farging viste at 26 ± 3% (n = 3, SEM) og 34 ± 4% av CD4
+ og CD8
+ -celler, respektivt er CD3-negative (figurene 2B-C). Analysen av CD11c
+, BDCA2
+ og CD68
+ celler tyder på at myeloid DC, plasmacytoid DC og makrofager sammen utgjør mindre enn en total på 5% av hver av CD4
+ og CD8
+ celler i ovarietumorer (Tall 2D-G).
(AB) søylediagram som viser den gjennomsnittlige (± SEM,
n
= 3) nivåer av CD3-CD4
+ eller CD8
+, henholdsvis som en prosentandel av den totale CD4
+ eller CD8
+ T-celler, respektivt. (C) vist er 4 representative tofarget prikkplotter flekker enten CD4 eller CD8-gated celler. De antistoffspesifisiteter blir merket med aksen. (D) Vist er gjennomsnitt (± SEM,
n
= 3) nivåer av CD11c
+, BDCA2
+ og CD68
+ celler som en total CD4
+ eller CD8
+ celler (X-aksen).
T-celle forholdstall korrelerer med klinisk utfall i menneskelig serøs eggstokkreft
Å se noen sammenheng mellom de absolutte tellinger av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs og klinisk utfall, vi fokusert på forhold som hadde vært tidligere beskrevet [8,28]. Median CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg ratio ble funnet signifikant høyere hos pasienter med godt resultat sammenlignet med pasienter med dårlig resultat (0,98 vs 0,32, p = 0,027 , Tabell 2, figur 3A). I kontrast, median CD3
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg og CD4
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg forholdstall var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene. Ved nærmere undersøkelse, uventet vi også oppdaget at det gode resultatet pasientene hadde en median CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
– forholdet som var betydelig høyere i god gruppe (0,65) som sammenlignet med den dårlige gruppen (0,46, p = 0,048) (tabell 2, figur 3B). Når CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg og CD4
+ CD25
+ foxp3
– forhold ble vurdert sammen (dvs. alle CD4
+ CD25
+), og som vist i figur 3C, forholdene mellom de to gruppene, forble signifikant forskjellig. Som alder ble funnet å være litt forskjellig mellom de to gruppene, bekreftet vi at foreningen mellom celletall og gruppestatus vært konsekvent etter justering for alder i en logistisk regresjonsmodell (data ikke vist).
(A) Kakediagram som viser fordeling av CD4
+ T-celler med hensyn til CD25 og foxp3 farging hos alle pasienter. (BD) Spre prikkplotter av prosenter av CD8
+ T-celler til Tregs (CD4
+ CD25
+ foxp3
+) (B), CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler (C), eller kombinert CD4
+ CD25
+ foxp3
+ og CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler (D) for både godt resultat og dårlig resultat grupper.
Når man sammenligner forholdene beregnet fra de tre store flekker (CD3, CD4, og CD8), bare median CD8
+ /CD4
+ T-celle-forhold, som var henholdsvis 0,27 og 0,13 for de gode og dårlige effektgrupper var statistisk signifikant forskjellig (p = 0,050), noe som er konsistent med de vesentlige prosenter av CD8
+ T-celler til enten CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs eller CD4
+ CD25
+ foxp3
– beskrevet ovenfor. Ingen andre forhold (f.eks CD8
+ /CD3
+ T-celle og CD4
+ /CD3
celle forholdstall + T) signifikant forskjellig mellom de gode og dårlige utfall grupper (tabell 2).
Til slutt, etter å ha sett at både foxp3
+ og foxp3
– CD4
+ T-celler var assosiert med utfall når undersøkt som et forhold med CD8
+ T-celler, vi spekulerte at disse cellene var Tregs stand til å produsere immunregulerings cytokin, TGF-β. For å teste dette, renset vi tumor-infiltrerende leukocytter (TIL) og stimulert deretter direkte
ex vivo
med ConA, etterfulgt av intracellulær cytokin farging. Som vist i figur 4A, Tīlss avledet CD4
+ CD25
+ T-celler var en blanding av foxp3
+ og foxp3
– T-celler. I fravær av stimulering, en fraksjon (12 ± 4%, n = 3, ± SEM) av de rensede T-celler opprettholdt ekspresjon av foxp3. Ved stimulering, prosentandelen av CD4
+ CD25
+ -T-celler som uttrykker foxp3 økt til 42 ± 9% av det totale CD4
+ CD25
+ T-celler. I fravær av stimulering, 5 ± 3% av CD4
+ CD25
+ T-celler produsert TGF-β og etter stimulering, økes denne til 34 ± 9% (p = 0,04, figur 4B).
(A) Vist er to prikker plott av rensede tumor-infiltrerende CD4
+ T-celler stimulert med ConA eller media alene. Cellene er inngjerdet på CD4 og CD25. (B) Stolpediagrammer viser gjennomsnittlig (± SEM,
n
= 3 unike pasientprøver) prosentandel av foxp3
+ og TGF-β T-celler blant den totale CD4
+ CD25
+ T-celler stimulert med enten ConA eller media alene. P-verdi oppnås ved en paret Students T-test.
Diskusjoner
Forstå patologisk rolle Tregs som har evnen til å undertrykke aktiverte T-celler i eggstokkreft mikromiljøet er viktig for å utvikle nye immun-basert terapi og bestemme pasientens prognose. I denne studien fant vi for første gang at CD4
+ CD25
+ foxp3
+ tregs er assosiert med utfall spesifikt i serøs eggstokkreft, men bare i sammenheng med CD8
+ T-celler . Det faktum at påvirkningen fra Tregs er bare påvises når de evalueres som et forhold med cytotoksisk CD8
+ T-celler er i samsvar med modellen som potensielt destruktive tumor-spesifikke immunresponser motvekts i svulsten mikromiljøet av sterk immunsuppresjon [29] . Dette vil antyde at strategier for uttømming av Tregs og samtidig vaksine stimulering av effektor-T-celler vil være effektiv i å fjerne eggstokk-kreft og forbedring av overlevelse [30]. Mange stoffer som er kjent for å være nyttige som treg-nedbrytende midler slik som cyklofosfamid, anti-CD25-antistoff, eller denileukin diftitox er tilgjengelige for kombinasjonsterapi med ny vaksine eller adoptive T-celle-terapi tilnærminger [31,32]. Alternativt Quezada og kolleger viser at sjekkpunkt anti-CTLA-4 blokade i kombinasjon med vaksine terapi kan også være effektiv på å endre balansen uten å eliminere Tregs, noe som tyder på en mulig bruk for den nylig godkjente anti-human CTLA-4 antistoff i eggstokkreft [ ,,,0],33,34].
ex vivo
forsøkene viste at en lav prosentandel av ikke-stimulerte CD4
+ CD25
+ T-celler opprettholdt foxp3 uttrykk, som senere økes ved aktivering. Denne lavere hyppighet av foxp3
+ T-celler, i forhold til de immunfluorescens fargingsresultater, kan reflektere nedregulering av foxp3, i samsvar med observasjonene at menneskelig foxp3 ekspresjon blir regulert av T-celleaktivering og ikke utviklingsmessig programmert som sådan i de murine Tregs [ ,,,0],35]. Derfor har uttrykket av foxp3 i T-celler etter aktivering førte til noen uenighet om hvorvidt foxp3 er en treg-spesifikk markør hos mennesker. Faktisk har noen studier vist at foxp3 uttrykk utløses i aktiverte T-celler uten regulatoriske aktiviteter, noe som kan få en til å spekulere i at noen av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ T celler i eggstokkreft kan ikke være forskrifts. I motsetning til dette har andre studier vist at aktiverte T-celler som opp-regulerer foxp3 gjør faktisk formidle undertrykkende aktivitet i en celle-kontakt eller cytokin avhengig måte (dvs. IL-10 og TGF-β) [36,37].
