Abstract
Reverse Transcription – kvantitativ Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) er en standard teknikk i de fleste laboratorier. Valg av referanse gener som er essensielle for data normalisering og valg av egnede referansegener fortsatt kritisk. Vårt mål var å 1) gjennomgå litteratur siden gjennomføringen av MIQE retningslinjer for å identifisere graden av aksept; 2) sammenligne ulike algoritmer i deres uttrykk stabilitet; 3) identifiserer et sett med egnede og mest pålitelige referanse gener for en rekke humane kreftcellelinjer. En PubMed database anmeldelsen ble utført og publikasjoner siden 2009 ble valgt. Tolv antatte referanse gener ble profilert i normale og ulike kreftcellelinjer (n = 25) ved hjelp av to-trinns RT-qPCR. Undersøkte referanse gener ble rangert etter deres uttrykk stabilitet ved fem algoritmer (geNorm, Normfinder, BestKeeper, komparativ ΔCt, og RefFinder). Vår gjennomgang viste 37 publikasjoner, med to tredjedeler pasientprøver og en tredjedel cellelinjer. qPCR effektivitet ble gitt i 68,4% av alle publikasjoner, men bare 28,9% av alle studier gitt RNA /cDNA-mengde og standardkurver. GeNorm og Normfinder algoritmer som ble brukt i 60,5% i kombinasjon. I vårt utvalg av 25 kreftcellelinjer, identifiserte vi
HSPCB
,
RRN18S
, og
RPS13
som de mest stabile uttrykte referanse gener. I undergruppe av eggstokkreft cellelinjer, referanse genene var
PPIA
,
RPS13 Hotell og
SDHA
, tydelig viser nødvendigheten av å velge gener avhengig av forskningsfokus. Dessuten trenger en kohort av minst tre egnede referansegener kan etableres på forhånd for å forsøkene i henhold til retningslinjene. For å etablere et sett med referansegener for gen normalisering anbefaler vi bruk av ideelt sett tre referanse gener valgt av minst tre stabilitets algoritmer. Den uheldige manglende etterlevelse til MIQE retningslinjer gjenspeiler at disse må videre etableres i forskningsmiljøet
Citation. Jacob F, Guertler R, Naim S, Nixdorf S, Fedier A, Hacker NF, et al . (2013) nøye utvalg av referanse gener er nødvendig for pålitelig ytelse av RT-qPCR i Human Normal og kreft cellelinjer. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10,1371 /journal.pone.0059180
Redaktør: Sui Huang, Institute for Systems Biology, USA
mottatt: 28 november 2012; Godkjent: 12 februar 2013; Publisert: 15 mars 2013
Copyright: © 2013 Jacob et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Foundation (PBZHP3-133289 og -138752 til FJ, 320030-120543 til VHS.); Cancer Institute of New South Wales (09 /CRF /2-02 til VHS); Royal Australian og New Zealand College of Fødselsleger og Gynekologer (til VHS); William Maxwell Trust (til VHS) og Royal Hospital for Women Foundation (til VHS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
revers transkripsjon (RT) – kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) er blitt en allsidig teknikk for å undersøke uttrykk endring av ett eller flere gener som er av interesse i forskjellige patologiske tilstander. På grunn av sin spesifisitet, sensitivitet, enkelhet, kostnader og med høy gjennomstrømning, RT-qPCR tilbyr en lang rekke fordeler sammenlignet med standardmetoder slik som Northern blot og semi-kvantitativ PCR. Derfor har det blitt den mest voksende verktøy for absolutt og relativ kvantifisering av mRNA transkripsjon nivåer [1]. RT-qPCR er et robust assay som bruker veletablert kjemi og dataanalyse, og er derfor overlegen til teknikker som Southern blotting eller DNA-sekvensering [2]. Til tross for den brede aksept, det er uoverensstemmelser i bruken av total RNA ekstraksjon metoder, RNA-mengde per reaksjon [3], RNA integritet vurderinger [4], qPCR Master Mix og i de ulike produsenter av revers transkripsjon kits. I tillegg er bruken av forskjellige qPCR deteksjonsmetoder som for eksempel farve eller sonde-baserte systemer utvider spekteret av potensielle anvendelser. For å overvinne potensielle problemer og for å oppnå konsensus i utførelsen og analyse av kvantitative PCR eksperimenter, ble det MIQE (Minimum Informasjon til offentliggjøring av kvantitativ real-time PCR Eksperimenter) retningslinjer innført i 2009, styrke eksperimentell design [5]. I tillegg vil anvendelsen av disse retningslinjene levere bedre og reproduserbare resultater ved å rapportere parametere som RNA integritet, reaksjonsvolum, cDNA /RNA-konsentrasjon, eller kalibreringskurver [6].
målgenet normalisering oppnås vanligvis ved hjelp referanse gener for å kompensere intra- og inter-kinetisk RT-qPCR [7]. Flere matematiske tilnærminger har blitt publisert som leverer egnet referanse gener med lavest variasjon og med høy stabilitet på tvers av biologiske prøver. De fire mest vanlig anvendte metoder er: (1) NormFinder algoritme [8] som er en statistisk modell som beregner den totale variasjon av genekspresjon for hver kandidat referanse gen og gir en stabil verdi. Denne verdien er knyttet til den systematiske feil for hvert kandidat-gen. (2) GeNorm [9] beregner et gen stabilitet mål for hver kandidat genet. Referanse genet med lavest stabilitet (M) blir fjernet fra videre analyse, og M-verdier blir beregnet gjentatte ganger inntil den mest stabil referanse-genet er igjen. (3) BestKeeper, en Microsoft
® Excel-basert verktøy, bruker parvise korrelasjoner [10]; og (4) den sammenlignende delta Ct (basert på den nomenklatur og MIQE retningslinjer: kvantifisering syklus (Cq) foretrekkes til terskelsyklusen (Ct), som begge beskriver fraksjons PCR-syklus brukes for kvantifisering) -metoden rangerer stabiliteten av kandidatgener i henhold til repeterbarhet av genekspresjon forskjeller [11]. Ingen av de innførte algoritmer synes å være optimal og forskeren har alltid å velge hvilke referanse genet til å bruke og hvordan å identifisere. Dette kan også påvirke tolkningen av RT-qPCR resultater.
Mange antatte referanse gener har blitt rapportert for et bredt spekter av menneskelig vev, for humane cellelinjer, og for cellekulturer under ulike eksperimentelle forhold som medikamentell behandling eller miljømessige faktorer. Men ingen referanse gener som er egnet for analyse av menneskelige kreftcellelinjer stammer fra gynekologisk kreft og tykktarm kreft ennå ikke er beskrevet.
Hovedmålet med denne studien var å identifisere de mest stabile referanse gener som passer for studiet av normale og kreftcellelinjer av ovarial eller tykktarm opprinnelse ved profilering et sett av 12 antatte referansegener og for første gang å anvende fem stabilitets algoritmer for å beregne påvirkning av bioinformatical dataanalyse. Vi var også interessert i å se hvordan forskjellige produsenter av reverstranskriptasehemmere kits påvirke variasjonen av referansen genuttrykk. I tillegg ble en gjennomgang av dagens litteratur utført for å vurdere samsvar med MIQE retningslinjene i utførelsen av RT-qPCR rapportert siden introduksjonen.
Materialer og metoder
Litteraturgjennomgang
En PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) database gjennomgang på bruk av antatte referanse gener i RT-qPCR ble utført. Publikasjoner tilgjengelig mellom januar 2009 og april 2012 ble vurdert og identifisert ved hjelp av stikkord: «referanse gener «eller» housekeeping gener «og» RT-qPCR» OR «kvantitativ PCR «. Referanselister fra utvalgte publikasjoner ble også vurdert for inkludering av potensielt relevante artikler. Publikasjoner ikke skrevet på engelsk, og de rapporterer RT-qPCR utført på mindre enn fem referanse gener ble ekskludert. Kun publikasjoner med humane prøver ble tatt. Publikasjoner ble evaluert i henhold til utgivelsesåret, typen og mengden av prøver, antall referanse gener er fremgangsmåtene anvendt for å bestemme RNA integritet, er mengden av totalt RNA først brukt for RT og /eller qPCR, antallet replikater i qPCR, detaljene på serielle fortynninger for kalibreringskurve og effektivitet, den benyttede qPCR kjemi (SYBRgreen eller TaqMan), og de matematiske tilnærminger (databehandling algoritmer) for referanse genuttrykk stabilitet måling.
Cell Culture
I denne studien 2 normal og 23 kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse ble anvendt. Cellelinjene ble avledet fra ATCC (www.atcc.org) eller var en gave fra Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia. Skriftlig informert etisk samtykke ble gitt (HREC 08/09/17 /3,02, til VHS.). En detaljert opplisting av cellelinjer og dyrkningsforholdene er gitt som supplerende data (Tabell S1). Alle cellekulturer ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO
2. Kulturer var fri for mykoplasma, som bestemmes av kvalitativ PCR hjelp VenorGeM
® Mycoplasma Detection Kit (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Australia).
RNA Utvinning og integritet
For å undersøke uttrykket av de 12 antatte referanse gener i hver av disse cellelinjer, 1 × 10
5 celler ble dyrket i 6-brønners plater (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark) til en confluency på 70-90%. Cellene ble deretter vasket to ganger med sterilt saltvann og total-RNA ble ekstrahert ved bruk av NucleoSpin RNAII kit (MACHEREY 35 ble ekskludert fra videre matematiske beregninger. Et «nei mal sample» (RNA fra revers transkripsjon uten revers transkriptase) og en prøve uten RNA eller cDNA var de negative kontroller.
PCR Efficiency (E)
Sammenligning ble sikret ved å undersøke qPCR effektivitet på alle referanse gener på en tilfeldig valgt cellelinje RNA-ekstrakt. Å sammenligne RNA transkripsjonsnivåer for de 12 antatte referanse gener, ble CQ verdier generert direkte på en bestemt terskel. Den Cq er definert som det antall sykluser som er nødvendig for fluorescens-signalet for å nå en bestemt terskel for å bli oppdaget, og er derfor inverst korrelert til inngangs mengden av totalt RNA [17]. For å sammenligne ulike qPCR kjører utført på ulike dager, plater og løper ble justert til terskelen av Cq 0,1. Revers transkribert cDNA ble fortynnet fra 100 ng til 1 pg av inngangs RNA før RT i 10-gangers fortynninger av hver referanse-genet i tre eksemplarer. Erholdt fluorescens-signaler for bestemt RNA-konsentrasjonen ble plottet og lineær regresjon ble utført for å identifisere den beste lineære forholdet som representerer standardkurven. Helningen av det lineære ligning ble benyttet til å beregne virkningsgraden i henhold til ligningen E = (10
[- 1 /skråning] -1). X 100
Data Analysis
Raw data inkludert smelte og forsterkningskurver innhentet av MxPro- Mx3000P v4.10 (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Australia) ble hentet til Microsoft
® Excel-filer (xls), lagret som Microsoft
® redaktør filer (.txt), og deretter lastet for ytterligere dataanalyse i åpen kildekode statistiske programmeringsspråk R (https://CRAN.R-project.org/, versjon 2.13.2). For ytterligere modellering og analyse av RT-qPCR data, ble R pakken «qPCR» brukt (https://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). Pearsons korrelasjon (r) ble beregnet for å bestemme sammenhengen mellom anvendt algoritmer.
For å sammenligne ulike algoritmer for utvelgelse av de mest stabile referanse gener, søkte vi RefFinder (https://www.leonxie.com/referencegene.php), et webbasert omfattende verktøy. Den bruker for tiden tilgjengelig algoritmer geNorm [9], Normfinder [8], BestKeeper [10] og komparative ΔCt metoder [11], og tildeler en passende vekt til en individuell gen og beregner den geometriske middelverdien for generell bestilling av alle referansegener.
Resultater
Compliance av MIQE retningslinjer for fastsettelse av referanse Gener
Siden introduksjonen i 2009 [5], er forskningsmiljøet kontinuerlig akseptere MIQE retningslinjer for publikasjoner og vurdering av vitenskapelige manuskripter ved hjelp av RT-qPCR. For å studere aksept av MIQE i mer detalj, vi foretatt en litteraturgjennomgang av publikasjoner foreslår et sett av mulige referanse gener (n≥5) i humane prøver for RT-qPCR. Vi identifiserte 37 publikasjoner fra januar 2009 til april 2012, antall som økte kontinuerlig hvert år (figur 1A). De fleste av disse studiene undersøkte pasientprøver (63,2%), etterfulgt av primær og udødelige cellelinjer (31,6%). En mindre del (5,3%) undersøkt vevsprøver og cellelinjer sammen. RNA integritet var i de fleste tilfeller (68,4%) undersøkt med to uavhengige metoder som spektrofotometri (90,9%) og RIN integritet nummer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). Mengden av total RNA for revers transkripsjon eller cDNA for qPCR reaksjoner ble rapportert i 78,9% av alle publikasjoner. SYBR
® Grønn (57,9%), et fluorescerende fargestoff dsDNA bindingen, ble mer brukt enn TaqMan (26,3%), et fluorescensmerket target-spesifikke probe. QPCR effektivitet for alle undersøkte referanse gener ble gitt i 68,4% av alle publikasjoner, men bare 28,9% forutsatt detaljer som cDNA beløp og fortynning utvalg av standardkurver. Til slutt undersøkte vi hvilke av de kjente algoritmer (geNorm, Normfinder, BestKeeper, komparativ ΔCt) ble brukt for å identifisere de mest stabilt uttrykte referanse gener. GeNorm og Normfinder algoritmer sammen ble brukt i de fleste studier etterfulgt av geNorm alene og geNorm, Normfinder, og BestKeeper sammen (figur 1B). Tatt i betraktning at bare publikasjoner utfører RT-qPCR for å identifisere stabilt uttrykket referanse gener ble inkludert Disse data viser at nødvendig informasjon, slik som RNA integritet, er mengden av total RNA i reaksjonen, qPCR effektivitet, og cDNA mengde som mangler i en vesentlig fraksjon av disse publikasjonene.
(A). Linjediagram over alle publikasjoner (n = 37) som undersøker de mest stabilt uttrykte referanse gener. (B) Prosent av algoritmer som brukes til å identifisere pålitelige referanse gener blant alle publikasjoner.
Kvalitet og integritet av RNA prøver
Total RNA hentet fra vårt sett av cellelinjer ble evaluert for kvalitet og integritet. En detaljert oversikt over cellelinjer og de respektive informasjon om RNA mengde, kvalitet og integritet (absorbans forholdstall 260/230 nm og 260/280 nm, RNA integritet nummer RIN, og 28 s /18 s ratio) er presentert som supplerende data ( Tabell S2). Vi fant at absorbans prosenter, gjennomsnitt (gjennomsnitt ± standardavvik) over alle 25 cellelinjer, var 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) og 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Vi har videre funnet at den RIN varierte 8,4 til 10, noe som indikerer en tilstrekkelig total RNA kvalitet. Den RIN-algoritmen tildeler et nummer RIN score fra 1 til 10, hvor en verdi på 10 representerer helt intakt RNA, og en verdi på 1 representerer degradert RNA. Videre er kvaliteten av total-RNA ble også bekreftet ved forholdet mellom 28 s /18 s ribosomalt RNA, som varierte 1,7 til 2,7.
mulige tilstedeværelsen av forurensende DNA (figur S1) i hvert forsøk var qPCR undersøkt ved forsterker tomter, smeltekurvene, og 1% agarosegel-elektroforese. Revers transkripsjon negative kontrollreaksjoner bekreftet fraværet av forurensende DNA. Likevel var det PCR presiseringer i de negative kontrollene av
PPIA
,
GUSB
,
RPII Hotell og
TBP
i ett eller to paralleller med CK verdier 35. Disse verdiene var betydelig høyere enn for de prøver som inneholdt templat fra 1 ng cDNA, som indikerer en ubetydelig forsterkning av kontaminerende DNA. Ingen PCR presiseringer i negative kontroller ble funnet for de andre referanse gener. Disse resultatene tyder på at våre totale RNA prøver var av tilstrekkelig kvalitet og stort sett fri for forurensende DNA.
qPCR Effektivitet, Intra- og Inter-Assay Variasjon
RT-qPCR effektiviteten av hver primer sett ble bestemt ved seriefortynninger av cDNA som templat fra det humane ovarie flate epitel cellelinje HOSE17-1 (tabell 2). Vi brukte RNA fra en tilfeldig valgt cellelinje i stedet for plasmider fordi RNA kan føre til potensielle ikke-neglisjerbar variasjon i revers transkripsjon [18], [19]. Basert på de oppnådde gjennomsnitts CQ verdier for alle fortynninger i en logaritmisk fortynning serie av cDNA, ble en standardkurve generert. Helningen, krysnings, qPCR forsterkning effektivitet og korrelasjonskoeffisienter (R
2) av hver primer par ble beregnet ut fra standardkurven (figur S2). Den første fortynning fra 100 ng til en pg av innspill RNA før RT ble tilpasset på grunn av ikke-detekterbare amplikonene på nedre området eller metning av qPCR reaksjoner ved høyere cDNA mengder, både påvirke effektiviteten i
RRN18S
,
RPII Hotell og
B4GALT6 plakater (tabell 2).
GUSB
viste en optimal lineær fortynning varierer fra 10 pg til 10 ng. PCR effektiviteten i studerte referanse gener varierte fra 87,1% til 106,6%, helling fra -3,680 til -3,157, fange opp 11,10 til 27,30 og R
2 0,994 til 0,999.
For å sikre en stabil RNA transkripsjon nivå, ble påvirket av tekniske variabilitet, intra- og inter-assay variasjon undersøkt ved hjelp av tilfeldig valgt
HSPCB
på RNA fra SKOV3 celler. Inter-assay variasjon ble bestemt ved å utføre RT-qPCR med identiske prøver fra fem forskjellige dager, avslører en variasjonskoeffisient (CV) på 1,74%. Den intra-assay variasjon var mindre enn CV 0,3% ved bruk av en mengde på 0,5 ng og 2,0% ved anvendelse av 5 pg av RNA. Disse dataene indikerer at den tekniske variabiliteten er i et akseptabelt område, og derfor anses som ubetydelig.
Bruk av passende revers transkriptase Setup
For å undersøke om opprinnelsen (produsent) av revers transskriptaser påvirker kvaliteten av reaksjonen fire referansegener (
SDHA
,
HSPCB
,
GUSB Hotell og
TBP
) ble valgt tilfeldig og qPCR ble utført etter revers transkripsjon. For å definere den generelle ytelsen til alle fire utvalgte referanse gener, ble variasjoner beregnet for CK og CV verdier (n = 7). Variasjonen for Cq varierte fra et minimum på 1,14 (
TBP
) til et maksimum på 2,83 (
GUSB
) (figur 2A). Den intra-assay variasjonen innen triplicates var høyest i
SDHA plakater (CV = 2,51%) og lavest i
GUSB plakater (CV = 0,04%) (figur 2B). Disse data indikerer at opprinnelsen av revers transkriptase og andre primer oppsett bare har marginal innvirkning på resultatene av disse fire referansegener.
(A) Random 6 mer ble anvendt i 2 og 5, oligo dT primer i 3 og 6, og begge sammen i 1, 4 og 7 (abscisse); Cq på koordinere viser forskjeller mellom de testede reverstranskriptasehemmere forhold. (B) variasjonskoeffisient (CV). RT leverandører angitt med romertall: I) BioRad, II) Takara, og III) Bioline. X-aksen med ulike RT primere: oligo dT (oligo), tilfeldige 6 mers (tilfeldige), og begge (begge)
Expression Stabilitet av Kandidat referanse gener i humane cellelinjer
for å identifisere de mest stabile referanse gener på tvers av de testede normale og kreftcellelinjer ble uttrykket stabiliteten for referanse gener undersøkt ved å utføre de fem algoritmer (RefFinder, geNorm, BestKeeper, Normfinder, og komparativ ΔCt) og rangering av genene fra hver algoritme individuelt. Disse gradene ble summert opp, med den laveste rang sum som representerer den mest stabilt uttrykt referanse genet og den høyeste rang sum som representerer minst stabilt uttrykt referanse genet. På tvers av alle undersøkte cellelinjer (figur 3A) identifiserte vi
HSPCB
,
RRN18S Hotell og
RPS13
som de 3 mest stabilt uttrykt referanse gener.
B4GALT6
var den minst stabil referanse genet. I undergruppe av tykktarmskreft cellelinjer
HSPCB
, YWHAZ, og
RPS13
var de 3 mest stabilt uttrykt referanse gener (Figur 3B). Videre, i den delen av normale og eggstokkreft cellelinjer, de respektive genene var
PPIA
,
RPS13 Hotell og
SDHA plakater (Figur 3C).
(A) Alle undersøkte cellelinjer (n = 25), (B) koloncancercellelinjer (n = 9), og (C) normale og eggstokk-kreft-cellelinjer (n = 11). Tall markere de første tre mest stabile referanse gener i hver eksperimentell satt opp.
Disse resultatene viser at de mest stabilt uttrykte referanse gener varierer mellom de ulike cellelinje sett, med bare
RPS13
å være tilstede i alle tre cellelinjesett i løpet av de første 3 øverste referansegener. Interessant, den mest brukte referansen genet
GAPDH
var blant de minst stabilt uttrykt referanse genet i vår satt opp.
Vi undersøkte sammenhengen videre blant de fem anvendt algoritmer som leverer de mest stabile gener . Korrelasjonen mellom alle fem stabilitetstester var moderat til høy blant de anvendte algoritmer. Den høyeste korrelasjon ble observert mellom Normfinder og sammenligningsdelta Ct metode (r = 0,99) (figur 4), noe som indikerer at alle 12 referanse gener var nesten identisk rangert. Den laveste korrelasjon (r = 0,71) var mellom deltaet Ct metode og RefFinder, noe som indikerer en høy avvik i rangeringen.
Absolutt verdi av Pearson korrelasjon og
p
-verdi merket med en stjerne (0 *** 0,01 **). Bunnen av spredningsplott visualiserer bivariate sammenhengen mellom undersøkt stabilitetstester, inkludert en montert linje.
Diskusjoner
1) utført en litteraturgjennomgang på overholdelse av MIQE retningslinjer i utførelsen av RT-qPCR eksperimenter identifisere sett med referanse gener, 2) vurderte resultatene av algoritmer for rangeringen av referanse gener ved deres uttrykk stabilitet; og 3) identifisert et sett med egnede og mest pålitelige referanse gener for vårt utvalg av humane kreftcellelinjer av ulik opprinnelse.
Vår litteraturgjennomgang viste at overholdelse av MIQE retningslinjene var bare delvis. Viktig informasjon [5], for eksempel RNA-integritet, er mengden av total RNA i reaksjonen, cDNA beløp, fortynning området for standardkurver, og effektiviteten av qPCR ofte mangler i publikasjoner, som ikke er i samsvar med de MIQE retningslinjer . Nærmest mulig samsvar med retningslinjene for utførelsen av RT-qPCR samt rapportering denne informasjonen i publikasjoner bidrar til forbedring av den eksperimentelle studiedesign og sikrer reproduserbarhet og pålitelighet av studieresultater. Ellers kan minimale forskjeller oppdages i målrettede genuttrykk være en potensiell resultat av variasjoner i referanse genuttrykk.
Vi har vist at reversere transskriptaser tilbys av forskjellige produsentene føre til variasjoner i kvantifisering sykluser (Cq opp til 3). Derfor kan det være nyttig å vurdere ulike RTS og å teste ulike primersett, oligo dT eller tilfeldige 6 mers eller begge i kombinasjon før gjennomføre eksperimenter. Våre funn er også i samsvar med tidligere studier hvor transkripsjon gir varierte opp til 100 ganger mellom ulike revers transskriptaser i en gen- avhengig måte [20], [21]. Vi har funnet i litteraturen, og bekreftet i vår studie at forskjellige RT grunnings strategier er avgjørende for kvantitativ måling av genekspresjon [21]. Videre har vi observert i våre egne forsøk at ingen RT er overlegen i forhold til andre RTS og derfor ingen konklusjon kan gjøres ved valg av RT priming; som er, kan ikke treffes vedtak om hvilke primer er bedre enn den andre.
Bruk av statistiske algoritmer for stabilitetsmålinger ble kritisk undersøkt fordi alle disse algoritmene er basert på antagelsen om at ingen av de studerte referanse gener viser systematisk variasjon i uttrykket profilen på tvers av prøvene [22]. I tillegg vår litteraturgjennomgang viste at i de fleste studier bare én eller to algoritmer har blitt påført. Vår studie viste stor variasjon i korrelasjonen mellom de anvendte algoritmer. Videre, til tross for relativt høy korrelasjon (r = 0,9) mellom geNorm og Normfinder algoritmer, anvendelsen av disse to algoritmene levert identisk rangering i bare fem av de undersøkte 12 referanse gener. Dette gir en brist som kan føre til falsk utvalg av referanse gener som kan ha en negativ innvirkning på kvaliteten og påliteligheten av data. Vi anbefaler derfor at mer enn to algoritmer skal brukes for valg av referansegener.
Vi har benyttet tidligere vist og publisert primerpar for påvisning av transkripsjonsnivåer av antatte referanse gener i en pool av normal og kreft cellelinjer. Generelt er nesten alle referansegener utføres på en egnet måte, og kan bli brukt for fremtidige studier ved hjelp av cellelinjer. I tillegg, basert på resultatene på intra- og inter-assay variabilitet alle undersøkte referansegener kan benyttes for videre undersøkelser. Likevel, blant alle cellelinjene testet vi fant ut at
HSPCB
,
RRN18S
, og
RPS13
er de mest stabilt uttrykte gener som tyder på at de er egnet som referanse gener for fremtidige studier innenfor denne eksperimentelle satt opp. Undersøkelser på tykktarm og normal samt eggstokkreft cellelinjer avslørte forventede avvik blant utvalgte referanse gener og bør derfor vurderes i fremtidige studier. Det viser at referanse gener må velges nøye for hver eksperimentell satt opp.
