Abstract
Biomarkører som predikerer respons på målrettet terapi i onkologi er en viktig del av personlig medisin. I prekliniske behandling responsstudier som kjennetegnet modeller av villtype
KRAS
eller mutant
BRAF
colorectal cancer behandlet med enten cetuximab eller vemurafenib henholdsvis illustrerer vi at [
18F] -FLT PET, en non-invasiv molekylær avbildning avlesning av tymidin berging, reflekterer tett pro-overlevelse svar på målrettet terapi som er formidlet av PI3K-mTOR-aktivitet. Aktivering av pro-overlevelse mekanismer ligger til grunn for tallrike former for motstand. Derfor kan vi konkludere med at [
18F] -FLT PET kan tjene en roman og potensielt avgjørende rolle for å forutsi svulster som viser molekylære funksjoner som har en tendens til å reflektere recalcitrance til MAPK-målrettede terapi. Selv om disse studiene fokuserte på tykktarmskreft, ser vi at resultatene kan være aktuelt for andre solide tumorer samt
Citation. McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Washington MK, Manning HC (2014) 3 « deoksy-3 «- [
18F] -Fluorothymidine PET Imaging Reflekterer PI3K-mTOR-mediert Pro-Survival Response til målrettet ved kolorektalkreft. PLoS ONE ni (9): e108193. doi: 10,1371 /journal.pone.0108193
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 24 februar 2014; Godkjent: 24 august 2014; Publisert: 23.09.2014
Copyright: © 2014 McKinley et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningsmidlene : R25 CA136440, K25 CA127349, P50 CA128323, P50 CA095103, R25 CA092043, R01 CA140628, RC1 CA145138, R01 CA046413, P30 DK058404, The Kleberg Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med økt evne til å raskt og rimelig karakterisere genetiske grunnlag av en individuell pasients svulst, er tilpasset behandling raskt blitt utbredt i onkologi. Landmark eksempler på suksess for personlig medisin i onkologi omfatter bruk av vemurafenib å behandle
V600EBRAF
melanom [1] og trastuzumab å behandle
HER2
overekspresjon brystkreft [2]. Med en økende avhengighet av molekylært målrettet terapi, det er fortsatt en like viktig utfordring å utvikle og validere spesifikke biomarkører som gjenspeiler målet hemming, sti inaktivering, og forutsi generell klinisk respons. De fleste biomarkører benyttes i onkologi studier krever vevsprøver som er svært utsatt for prøvetaking feil og skjevheter på grunn av heterogenitet. Serumbasert biomarkører mangler evnen til direkte å visualisere tumoren, og viser at den målte effekt er direkte resultat av tumorrespons. Non-invasiv bilde omgår disse begrensningene, og gir store fordeler i forhold til tradisjonelle biomarkører. Av den bildediagnostikk tilgjengelige klinisk, sensitiviteten og evnen til lett å fremstille biologisk aktive molekyler som bærer positron-emitterende isotoper som gjør positronemisjonstomografi (PET) en av de mest attraktive modaliteter for å detektere tumorer og profilering biologiske reaksjoner på behandlingen.
Vårt laboratorium har studert det biologiske grunnlaget for 3′-deoksy-3 «[18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) akkumulering i tumorer [3] – [6] og andre sykt vev [7]. En tymidin analog, [
18F] -FLT ble opprinnelig utviklet for å fungere som en non-invasiv måling av celleproliferasjon, med åpenbare nytte i onkologi [8], [9] av rapportering på tymidin berging veien som gir DNA-forløpere å dele celler. Ved cellulær internalisering, [
18F] -FLT blir fosforylert i en reaksjon katalysert av cytosoliske enzymet tymidinkinase 1 (TK1) og fanget i cellen. TK1 aktivitet er nært korrelert med DNA-syntese og har en tendens til å bli redusert i hvilende celler. [
18F] -FLT har vært mye studert som en markør for behandlingsrespons i et spekter av tumortyper og behandlinger både i pre-kliniske og kliniske miljøer [10]. Det er imidlertid viktig å merke seg at i motsetning til mer generell nytte spredning markører, for eksempel Ki67, [
18F] -FLT PET gjenspeiler proliferative indeksene til variable og potensielt upålitelig grad [6], [11]. [
18F] -FLT-PET kan ikke diskriminere moderat proliferativ, tymidin berging drevet svulster fra de av svært proliferative svulster som er avhengige primært på
de novo
tymidin syntese. Til tross for mangel på sammenheng med spredning i noen tilfeller, vi så for seg at TK1 nivåer, og dermed [
18F] -FLT PET, kunne reflektere andre potensielt viktige molekylære hendelser assosiert med respons på behandling.
Ved hjelp av preklinisk modeller av tykktarmskreft vi demonstrere to tilfeller der [
18F] -FLT PET ikke korrelerer med spredning, men heller reflekterer PI3K-mTOR mediert pro-overlevelse svar på målrettet terapi. I disse innstillingene, [
18F] -FLT PET var uharmoniske 2-deoksy-2 – [
18F] fluor-D-glukose ([
18F] -FDG) PET, den mest anvendte tracer i klinisk onkologi, som ikke var følsom for mTOR- eller PI3K-pathway aktivitet. Cetuximab mediert hemming av MAPK aktivitet i et villtype
KRAS
cellelinje modell og vemurafenib-mediert hemming av BRAF i en
V600EBRAF
mutant cellelinje modellen hadde ingen effekt på [
18F] -FLT PET mindre PI3K-mTOR ble senere svekket farmakologisk eller
via
genetisk lyddemping. Samlet er disse studiene viser en ny rolle for [
18F] -FLT PET som et middel til å forutsi svulster som motstår MAPK hemming gjennom PI3K-mTOR aktivering i tykk- og endetarmskreft og potensielt andre solide tumorer.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og musemodeller
alle studier ble godkjent av Vanderbilt University Institutional Animal Care og bruk komité og alle anstrengelser ble gjort for å minimalisere dyrs lidelse. Difi menneskelige celler var en gave fra Dr. Bruce Boman [12] og COLO 205 celler ble oppnådd fra ATCC (CCL-222). Difi human kolorektal kreft celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og COLO 205-celler ble dyrket i RPMI (Cellgro) med 10% føtalt bovint serum, (Atlanta Biologicals), 1% penicillin og streptomycin (GIBCO) ved 37 ° C og 5% CO
2. C225 ble oppnådd fra Vanderbilt Pharmacy, ble PLX4032 og PLX4720 syntetisert som beskrevet [13], PP242 ble oppnådd fra Sigma Aldrich, og BEZ235 fra Selleck Chem. Stamløsninger av hvert medikament ble utarbeidet og porsjonert å oppnå sluttkonsentrasjon av legemidlet for
in vitro
studier.
For
in vivo
studier, cellelinje xenografter ble generert i atymiske nakne mus (Harlan) som beskrevet [3] og behandling begynte da volumet nådd ca 150 mm
3. For behandling av DIFI xenotransplantater, saltvannsbærer, 20 mg /kg eller 40 mg /kg cetuximab ble administrert i.p. hver tredje dag. PET avbildning av Difi xenograft bærende mus ble utført 7 dager etter behandlingsstart, 24 timer etter den tredje behandling. For COLO 205 xenotransplantater ble mus behandlet med DMSO kjøretøy, 60 mg /kg PLX4720, eller 40 mg /kg BEZ235 daglig ved oral tvangsforing (100 pl totalt volum). PET-avbildning av COLO 205 xenograft bærende mus ble utført 4 dager etter behandlingsstart, omtrent 24 timer etter den tredje behandling. Mus ble ofret umiddelbart etter ferdigstillelse av PET billeddiagnostikk.
siRNA metoder
Raptor (L-004107-00) og tilfeldig rekkefølge (D-001810-01) siRNA reagenser ble hentet fra Thermo Scientific. siRNA ble transfektert inn i Difi celler ved hjelp av DharmaFect transfeksjon kit (Thermo Scientific) i henhold til produsentens anvisninger. Kort sagt, ble 500.000 Difi cellene sådd ut i hver brønn av en 6-brønns plate. Etter 24 timer ble siRNA tilsatt til de passende brønner. Etter 48 timer, saltvannsbærer, 0,5 ug /ml eller 5,0 ug /ml C225 ble tilsatt til de passende brønner. Etter ytterligere 24 timer ble cellene høstet for Western blotting og QRT-PCR som beskrevet nedenfor.
radiofarmasøytiske syntese
[
18F] -FLT ble utarbeidet i en to-trinns, en-kolbereaksjon som beskrevet [4], [14]. [
18F] -FLT ble oppnådd med gjennomsnittlig radiokjemisk renhet på 98,3% og spesifikk aktivitet ≥345.5 TBq /mmol. [
18F] -FDG ble syntetisert i Vanderbilt University Medical Center radiofarmasi og distribuert av PETNET. Den gjennomsnittlige radiokjemiske renheten av produktet var 98,5% og spesifikk aktivitet var mer enn 37 TBq /mmol.
Small-dyr bildebehandling
Small-dyr PET billeddiagnostikk ble utført ved hjelp av en dedikert microPET scanner ( Concorde Micro Focus 220). Mus ble holdt under 2% isofluorane anestesi i oksygen ved 2 l /min, og holdt varm ved hjelp av en sirkulerende vannvarmepute for varigheten av PET scan. For [
18F] -FLT PET avbildning dyr ble administrert 7.4-9.3 MBq (200-250 pCi) intravenøst. Dyrene fikk fri tilgang til mat og vann i løpet av en 40 minutters opptak periode, etterfulgt av bedøvelsen og en 20 minutters image oppkjøpet. For [
18F] -FDG PET billeddiagnostikk, mus ble fastet i ca 6 timer før bildebehandling og varme i en oppvarmet (31 ° C) kammer i 1 time før [
18F] -FDG injeksjon og i løpet av opptak periode for å minimere brunt fett opptak av [
18F] -FDG. Mus ble administrert 7.4-9.3 MBq av [
18F] -FDG intravenøst og fri adgang til vann i løpet av en 50 minutters opptak periode etterfulgt av en 10 min PET oppkjøp.
PET data ble rekonstruert ved hjelp OSEM3D /KART. De resulterende tre-dimensjonale rekonstruksjoner hadde et x-y-voxel størrelse på 0,474 mm og innbyrdes avstand stykke av 0.796 mm. ASIPro programvare (Siemens) ble anvendt til å tegne tredimensjonale regioner av interesse manuelt i tumorvolum. Tumorprøver ble umiddelbart samlet etter [
18F] -FLT-PET og flash frosset i flytende nitrogen. [
18F] -FLT opptaket ble kvantifisert som prosentandelen av den injiserte dose per gram vev (% ID /g) ved å dividere ROI aktiviteten av den injiserte dosen og multiplisere med 100.
in vitro
-studier, ble cellene lysert med CelLytic M (Sigma Aldrich), sentrifugert ved 16000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble fjernet før måling av proteinkonsentrasjonen av bicinchoninic syre (BCA) analyse (Thermo Scientific). For
in vivo
studier, friskt frosset vev ble homogenisert i CelLytic MT (Sigma Aldrich) lysebuffer, sentrifugert ved 16 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble fjernet før måling av proteinkonsentrasjonen ved BCA analyse. Før vedtak elektroforese, ble 20-40 mikrogram av protein fra hver prøve lastet inn 7,5 til 12% SDS PAGE geler og overført til PVDF membraner (PerkinElmer). Membranene ble blokkert over natten ved 4 ° C i tris-bufret saltvann 0,1% Tween-20 (TBST) inneholdende 5% vekt /volum fettfri tørrmelkpulver. Deretter membraner ble avhørt med antistoffer hentet fra Cell Signaling Technology hvis ingenting til p-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), TK1 (Abcam, # 57757), p27 (# 3686 ), p-AKT Ser473 (# 4060), p-AKT Thr308 (# 4056), AKT (# 4685), p-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), p-4EBP1 Thr37 /46 ( # 2855), p-MEK Ser217 /221 (# 9154), MEK (# 9126), DUSP6 (# 3058), β-aktin (# 4970), β-tubulin (Novus Biologicals, # NB600-936). Membraner ble probet i 1 time ved romtemperatur i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA). Membraner ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch) fortynnet i TBST 1:5000 inneholdende 3% BSA. Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) ble brukt for kjemiluminescens deteksjon på en Xenogen IVIS 200.
Immunohistochemistry (IHC)
Dyrene ble avlivet og tumorprøver ble innsamlet umiddelbart etter PET billeddiagnostikk, deretter senere fiksert i 10% formalin i 24 timer. Vevene ble så overført til 70% etanol før parafin innebygging. Vev ble seksjonert (5 mikrometer tykkelse) og farget for p-rpS6 (Cell Signaling, # 4858, 1:100 primære fortynning), p-AKT Ser473 (Cell Signaling, # 4060, 1:100 primære fortynning), Ki67 (Dako, # M7240, 1:100 primære fortynning), p27 (Dako, # M7203, 1:100 primære fortynning). I korthet, vevsprøver ble de-paraffinized, rehydrert, og antigen gjenfinning ble utført ved bruk av citrat-buffer (pH 6,0) løsning i 15 minutter ved 105 ° C etterfulgt av en 10 minutter lags avkjølt. Prøvene ble deretter behandlet med 3% hydrogenperoksyd for å fjerne endogen peroksidaseaktivitet. Seksjonene ble deretter blokkert med et serumfritt proteinblokkerende reagens i 20 minutter. Primært antistoff-påvisning ble utført ved anvendelse av følgende system: vevssnittene ble inkubert ved romtemperatur i 60 minutter ved de angitte fortynninger etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon anvendelse av Envision + System-HRP-merkede Polymer deteksjonsmetode (Dako, Carpinteria, CA). Farging ble gjennomført etter inkubering med en 3,3′-Diaminobenzidin substrat-kromogen oppløsning. Tissue glass ble fotografert ved 40x forstørrelse og manuelt scoret for å bestemme prosentandelen av positive celler pr høy effekt felt.
QRT-PCR
RNA ble samlet opp ved hjelp av RNeasy som foreslått av leverandøren (QIAGEN) . Både cDNA og realtime PCR Forsøkene ble utført ved hjelp iScript cDNA syntese kit og iQ SYBR Grønn Supermix (BIO-RAD) av leverandør instruksjon. Amplifikasjoner ble utført i en BIO-RAD CFX96 Real-Time System for 40 sykluser. Data ble kjøpt opp av Bio-Rad CFX Manager og brett endringer ble analysert som beskrevet av Schefe et al [15]. Humant TK1 (5′-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 «forover, 5′-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3 «omvendt), human P27 (5′-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3′ forover, 5»-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3″ omvendt) ble oppnådd fra integrerte DNA-teknologi.
Statistical Analysis
Statistisk signifikans av data ble evaluert ved bruk av ikke-parametrisk Wilcoxon Rank Sum (Mann-Whitney U) tester bruker GraphPad Prism 4 programvarepakken. Forskjeller ble ansett statistisk signifikant hvis p. 0,05
Resultater
Regulering av TK1 følgende EGFR blokade i villtype
KRAS
kolorektal kreft celler
Tidligere viste vi at bildeavlesninger av EGFR belegg og apoptose, men ikke [
18F] -FLT PET, spådde respons på cetuximab i Difi cellelinje xenografter som uttrykker villtype KRAS og utviser EGFR forsterkning [3], [12] . Derfor, i denne studien, må vi først søkt å belyse forholdet mellom EGFR blokade med cetuximab og TK1 regulering. I utgangspunktet brukte vi dyrkede Difi celler til å vurdere tidsmessige forholdet mellom cetuximab eksponering og p-ERK, TK1, og p27 protein nivåer i løpet (1A Fig.) 24 timer. Som forventet ble p-ERK nivåer nesten umiddelbart svekket, viser en dramatisk reduksjon i den første timen av cetuximab eksponering (5,0 mikrogram /ml), og resterende godt under utgangsnivået for opptil 24 timer. Paradoksalt TK1 nivåene økte ved cetuximab eksponering, som toppet seg på 12 timer, og deretter raskt falt til under baseline nivå. Protein nivåer av cellesyklus-inhibitor p27 økte dramatisk og flatet ut ved 12 timer. Den omvendte forholdet mellom TK1 og p27 protein nivå innblandet p27 som en viktig faktor for TK1 regulering i Difi celler.
(A) Western blot av Difi cellelysater følgende cetuximab eksponering (5 mikrogram /ml) resulterte i rask demping nedstrøms MAPK mål inkludert p-ERK, som forble godt under utgangsnivået til 24 timer. Paradoksalt TK1 protein nivåer økt fra 1-12 timer til p27 protein nivåer rose, da TK1 falt under baseline. (B) Difi celler behandlet med enten 0,5 ug /ml eller 5,0 ug /ml cetuximab resulterte i en 50% reduksjon og full dempning av p-ERK proteinnivåer, henholdsvis ved 24 timer. På 0,5 mikrogram /ml TK1 nivåene var upåvirket tross for en beskjeden økning i p27 protein nivåer. Imidlertid, 5,0 ug /mL cetuximab resulterte i sterkt redusert TK1 med en stor økning i p27 protein nivåer. PI3K-mTOR-aktivitet, som målt ved p-AKT Ser473, p-rpS6, og p-4E-BP1, ble enten opprettholdt eller forhøyet ved 0,5 ug /ml cetuximab, men ble svekket ved 5,0 ug /ml cetuximab. (C) QRT-PCR analyse viste
TK1
mRNA ble betydelig redusert på 0,5 mikrogram /ml (p = 0,0279) og 5,0 mg /ml (p = 0,0186), mens ingen endring i
p27
mRNA-nivåer ble observert ved hver dose. (D) Dempe mTORC1 tilrettelagt oppregulering av p27 og svekket TK1 proteinnivåer på 0,5 mikrogram /ml cetuximab uten å påvirke de anti-MAPK aktivitet effekten av cetuximab. Nivåer av p-AKT Ser473, p-rpS6, og p-4E-BP1 ble redusert ved 0,5 ug /ml cetuximab eksponering med Raptor knockdown men ikke i kryptert siRNA kontroll. (E) Som bevis på funksjonaliteten til p27,
TK1
mRNA nivåer ble tilsvarende redusert til 0,5 mikrogram /ml og 5,0 mg /ml med Raptor knockdown.
For å ytterligere evaluere relasjoner mellom MAPK-reaksjonsveien inhibering, TK1 regulering, og p27, ble Difi cellene utsatt for to konsentrasjoner (0,5 mikrogram /ml og 5,0 ug /ml) av cetuximab i 24 timer (fig. 1B). Ved 0,5 ug /ml, TK1 proteinnivåer ble ikke påvirket til tross for moderat forhøyede p27 og en tilnærmet 50% reduksjon av p-ERK og p-AKT Ser473. Derimot er 5,0 ug /mL grad av eksponering resulterte i drastisk svekkete TK1 nivåer. I likhet med den tidsforløpsstudium, redusert TK1 korrelert med en sterk økning i p27. I tillegg ble fullstendig dempning av p-ERK og p-ATK Ser473 observert ved 5,0 pg /ml. I motsetning til protein,
TK1 mRNA
hadde en tendens til å følge p-ERK nivåer mer direkte (fig. 1C), som ikke er overraskende gitt
TK1
avhengighet av E2F transkripsjon [16], en nedstrøms produkt av MAPK aktivitet. Interessant,
p27
mRNA var upåvirket av cetuximab eksponering, noe som tyder på at økte P27 protein nivåer stammet fra hemming av nedstrøms mål som påvirker post-transcriptional modifisering av p27, med AKT typisk være en av disse [17]. For å avgjøre om TK1 protein nivåer observert ved 0,5 mg /ml eksponeringsnivåer ble opprettholdt gjennom økt translasjonsforskning effektivitet, målte vi p-rpS6 og p-4E-BP1 nivåer, både produkter av pro-translasjonell PI3K-mTOR-aktivitet (Fig. 1B) . Vi har funnet p-rpS6 nivåer for å bli dempet bare ved den høyeste konsentrasjon av cetuximab. Videre ble p-4E-BP1 nivåer forhøyet ved lavere konsentrasjon av cetuximab, noe som tyder på økt risiko for oversettelse på ribosomale cap [18]. Tatt sammen med
TK1
mRNA nivåer, kan disse resultatene tyder på at translasjonsforskning effektiviteten TK1 på lavere nivå av cetuximab eksponering som sannsynligvis fortsette gjennom aktivering av mTOR.
Ryggekamera mTOR-PI3K aktivitet forenkler cetuximab-mediert demping av TK1 nivåer i Difi celler
for å undersøke hvilken rolle mTOR på TK1 regulering i denne sammenheng, forstummet vi mTOR bruker siRNA til Raptor, et viktig medlem av funksjonelle mTOR Complex 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. I fravær av mTORC1 aktivitet, ble TK1 proteinnivåer svekkes ved begge 0,5 ug /ml og 5,0 ug /ml konsentrasjoner av cetuximab, uten en tydelig effekt på MAPK-reaksjonsveien aktivitet (Fig. 1D). Som forventet, Raptor stanse resultert i større cetuximab-mediert demping av p-AKT Ser473 og p-rpS6 så vel som blokkerer fosforylering av 4E-BP1. I tillegg til å dempes TK1 protein nivåer, mTORC1 inaktivering førte til økte p27 protein nivåer som syntes å være minst delvis ansvarlig for
TK1
transkripsjonen regulering på det laveste nivået av cetuximab eksponering (Fig. 1E). Interessant, som observert tidligere, økningen i P27 protein nivåer var i seg selv ikke et produkt av økt
p27
transkripsjon (fig. S1). Disse resultatene tyder på at mTOR aktivering formidler dens effekt på TK1 gjennom nedstrøms effektorer som AKT og ERK gjennom post-translasjonell modifikasjon og nedbrytning av cellesyklus inhibitorer, inkludert p27 [17]. Som bevis på dette, mTORC1 hemming i forbindelse med EGFR blokaden ført til en sterk reduksjon av TK1 protein nivåer ikke observer med cetuximab eksponering alene på lavere konsentrasjon.
[
18F] -FLT PET reflekterer hemming av PI3K-mTOR-aktivitet i cetuximab behandlet Difi cellelinje xenografter
in vivo
Vi deretter avbildes Difi xenograft-bærende mus med [
18F] -FLT PET følgende cetuximab behandling (20 mg /kg eller 40 mg /kg) eller saltvann kjøretøy. Etter avtale med våre tidligere studier [3], lik [
18F] -FLT akkumulering i xenotransplantater behandlet med bil eller 20 mg /kg cetuximab. Økt dosering av cetuximab til 40 mg /kg medførte redusert [
18F] -FLT akkumulering (Fig. 2A). Redusert TK1 protein nivåer ble observert ved 40 mg /kg dose i forhold til kjøretøy- og 20 mg /kg cetuximab behandlet svulster (Fig. 2B). I likhet med
in vitro
studier, redusert TK1 protein nivåer korrelerte med forhøyet p27 protein, men ikke
p27
mRNA nivåer (fig. S2). I tillegg ble p-AKT Ser473 tumor proteinnivåer økes ved /dose 20 mg kg sammenlignet med både kjøretøyet og 40 mg /kg cetuximab. TK1 proteinnivåer ble ikke påvirket av den lavere dosering av cetuximab, til tross for betydelig redusert
TK1
mRNA (fig. 2C), som ble redusert i forhold til bærer-behandlede kontroller ved begge nivåer av cetuximab eksponering. IHC av bildebehandlings-matchet xenograft vev illustrert som PI3K-mTOR-aktivitet, som målt ved p-rpS6 og p-AKT Ser473 nivåer, ble hemmet ved det høyeste cetuximab eksponering (fig. 2D, fig. S3). Interessant, Ki67 ble redusert på begge nivåer av cetuximab eksponering (figur 2D, Fig. S4), noe som tyder på at [
18F] -FLT PET ble frikoplet fra standard mål på spredning ved lavere dosering. Mens [
18F] -FLT PET syntes å være følsomme for PI3K-mTOR aktivitet, [
18F] -FDG PET avbildning var ikke følsom for dette fenomenet. Vi observerte redusert [
18F] -FDG opptak i forhold til kjøretøykontroller på begge nivåer av cetuximab eksponering (Fig. S5). Samlet er disse resultatene tyder på at [
18F] -FLT PET gir unik informasjon om mTOR signal som ikke fanges opp av [
18F] -FDG PET eller standard tiltak for spredning, for eksempel Ki67 IHC.
Difi tumorxenotransplantater ble fotografert på dag 7 av 20 mg /kg eller 40 mg /kg cetuximab behandlingsregimer. (A) [
18F] -FLT PET ble bare redusert i Difi xenografter behandlet ved 40 mg /kg nivå (p = 0,0012). (B) Western blot-analyse av vev høstet umiddelbart etter avbildning bekreftet at TK1 proteinnivåer ble bare redusert ved 40 mg /kg dosenivå. Økte P27 protein nivåer ble observert på 40 mg /kg dosenivåer. Økte p-AKT Ser473 proteinnivåer ble observert ved 20 mg /kg dosenivå. (C) På samme måte som
in vitro
observasjoner,
TK1
mRNA ble signifikant redusert ved både 20 mg /kg (p = 0,0009) og 40 mg /kg (p = 0,0001) dose nivåer. (D) IHC analyse av p-rpS6 og p-AKT Ser473 viste noe forhøyet fargingsnivå på 20 mg /kg. Men begge merkene ble sterkt redusert ved 40 mg /kg. Ki67 immunoreaktivitets ble redusert på begge nivåer av cetuximab eksponering.
TK1 protein nivåer reflekterer ikke
V600EBRAF hemming i COLO 205 celler
Analogt til Difi modellen behandlet med cetuximab, vi evaluerte sammenhenger mellom target-hemming, nedstrøms effektorer, og TK1 nivåer i en
V600EBRAF uttrykkende cellelinje, COLO 205, ble behandlet med en selektiv
V600EBRAF inhibitor (fig. 3). PLX4032 eksponering i 48 timer førte til konsentrasjonsavhengig inhibering av p-MEK nivåer. Paradoksalt nok, ble p-ERK nivåer øket på en konsentrasjonsavhengig måte, bortsett fra ved den høyeste dosen (5 uM) (fig. 3A). Misforholdet mellom p-MEK og p-ERK ble ikke observert ved eksponerings varigheten av 2 timer (Fig. S6) eller 24 timer (Fig. S7). Selv om p-AKT Ser473-nivåene ble redusert med bare moderat PLX4032 eksponering på 48 timer, ble det observert en konsentrasjonsavhengig økning i p-rpS6 som korrelert med økningen i p-ERK. Samtidig økt p-rpS6 og redusert DUSP6 nivåer antydet at økningen i p-ERK var i hvert fall delvis skyldes redusert fosfatase aktivitet som ble sannsynligvis relatert til mTOR aktivering [20]. PLX4032 eksponering førte til en beskjeden økning i p27 protein nivåer. TK1 nivåer ble økt litt ved lavere konsentrasjoner PLX4032 og uforandret fra kjøretøyet ved høyere nivåer av eksponering, med unntak av den høyeste konsentrasjonen (5 uM). Overraskende,
TK1
mRNA nivåer syntes å være tettere knyttet til hemming av p-MEK og, i motsetning TK1 protein nivåer, ble redusert i en vesentlig konsentrasjonsavhengig måte (Fig. 3B).
COLO 205-celler ble samlet 48 timer etter PLX 4032 eksponering ved 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, eller 5 uM. (A) Western blot analyse viste mål inhibering av p-MEK til tross for økt p-ERK nivåer. PI3K-mTOR signal ble forhøyet i en PLX 4032 avhengig måte som utstilt ved en jevn økning i p-rpS6 nivåer. ERK-fosfatase DUSP6 redusert i forbindelse med mTOR-signalisering og var omvendt proporsjonal med p-ERK nivåer. En svak økning i P27-nivåer ble observert samtidig med kun moderate endringer i TK1 nivåer, bortsett fra ved den høyeste dosen av PLX4032. (B) Redusert
TK1
mRNA nivåer ble observert ved alle narkotika konsentrasjoner over 10 nM (p 0,05).
[
18F] -FLT PET, men ikke [ ,,,0],
18F] -FDG PET, reflekterer forhøyet mTOR aktivitet og korrelerer med en mangel på p-ERK hemming i PLX4720 behandlet COLO 205 xenografter
Mus som bærer COLO 205 xenotransplantater ble behandlet daglig med 60 mg /kg PLX4720 for 4 dager og avbildes med [
18F] -FLT PET eller [
18F] -FDG PET (fig. 4). Etter avtale med
in vitro
studier som viser at BRAF hemming hadde liten effekt på TK1 nivåer i COLO 205 celler, behandling med PLX4720 hadde liten effekt på [
18F] -FLT PET billeddiagnostikk. Motsatt [
18F] -FDG PET ble betydelig redusert i tilsvarende behandlet kohorter (Fig. 4B). Etter avtale med bildebehandling, TK1 nivåer av PLX4720 behandlet xenografter var lik behandlede kontroller. Også ligner på
in vitro
studier, fant vi forhøyede p-ERK nivåer og p-rpS6 nivåer i PLX4720 behandlet xenografter i forhold til kjøretøy behandlet kontroller, til tross for hemming av BRAF effektor, p-MEK.
(A) representant tverrgående [
18F] -FLT og [
18F] -FDG PET-bilder ervervet etter tre daglige behandlinger med bil eller 60 mg /kg PLX4720 (tumor indikert av pilspiss). (B) Kvantifisering av PET data illustrert lik [
18F] -FLT opptak i svulster kjøretøy-behandlet og PLX4720 behandlet. I motsetning til [
18F] -FLT PET, fremkalte PLX4720 eksponering en betydelig reduksjon i [
18F] -FDG opptak (p = 0,0006). (C) Western blot-analyse av kjøretøy- og PLX4720-behandlede tumor vev bekreftet at PLX4720 hadde ingen effekt på TK1 proteinnivåer i overensstemmelse med [
18F] -FLT PET. Målrette inhibering som målt ved p-MEK-nivåer ble observert. Men i likhet med
in vitro
studier PLX4720 behandlet COLO 205 xenografter viste forhøyede p-ERK og p-rpS6 protein nivåer i forhold til kjøretøykontroller.
Regulering av TK1 følgende mTOR eller dual PI3K-mTOR-hemming og
V600EBRAF hemming i COLO 205 celler
For å undersøke mTOR rolle i TK1 regulering følgende
V600EBRAF hemming, dyrkede COLO 205 celler ble behandlet samtidig med 250 nM pp242, en selektiv mTORC1 /mTORC2 inhibitor [21] og økende konsentrasjoner av PLX4032 i 48 timer (fig. 5). Legge PP242 hadde liten effekt på PLX4032 avhengig hemming av p-MEK, men likevel effektivt blokkert aktivering av p-AKT på Ser473 og avstumpet den tidligere observert aktivering av p-rpS6 forårsaket av PLX4032 eksponering (sammenlign fig. 3A). Imidlertid mTOR blokade var utilstrekkelig til å dempe p-ERK eller p-AKT Thr308 nivåer i et PLX4032-avhengig måte, og heller ikke for fullstendig å dempe p-rpS6 nivåer (Fig. 5A). Som med monoterapi
in vitro
studier p-rpS6 aktivering korrelert med en svak demping av DUSP6 nivåer og en svak økning av p-ERK ved høyere PLX4032 konsentrasjoner. Ikke desto mindre, kombinert inhibering av p-AKT Ser473 og p-MEK resulterte i drastisk redusert TK1, på både protein- og mRNA-nivå. I nærvær av forhøyet p27,
TK1
mRNA nivåer falt dramatisk, med betydelige reduksjoner observert ved PLX4032 konsentrasjoner så lave som 10 nM (Fig. 5A). Videre antyder at AKT-aktivitet var ansvarlig for post-translasjonell modifikasjon og degradering av p27, i nærvær av p-AKT Ser473-inhibering, ble p27 protein dramatisk forhøyet men
p27
mRNA var ikke (fig. 5C).
(A) Western blot fra Colo 205 celler behandlet med PP242 (250 nM) og økende PLX4032. I likhet med monoterapi PLX4032, p-MEK, men ikke p-ERK, ble hemmet i en PLX4032 avhengig måte. I samsvar med mTORC1 /mTORC2 hemming, p-AKT Ser473, men ikke p-AKT Thr308, ble hemmet. I motsetning til monoterapi PLX4032, noe som resulterte i konsentrasjonsavhengig aktivering av p-rpS6, kombinerte behandlingsopprettholdt p-rpS6 Nivåer i det vesentlige baseline nivå, bortsett fra ved den høyeste PLX4032 konsentrasjon. Tilsvarende DUSP6 nivåer ble inverst relatert til p-ERK proteinnivåer. Med kombinert mTOR og
V600EBRAF blokade, P27 og TK1 proteinnivåer ble omvendt korrelert og dramatisk påvirket av PLX4032 eksponering. (B) På tilsvarende måte,
TK1
mRNA ble signifikant redusert ved PLX4032 konsentrasjoner så lave som 10 nM. (C) Til tross for høye p27 protein nivåer,
p27
mRNA var upåvirket av kombinert mTOR-
V600EBRAF hemming.
Gitt at kombinert
V600EBRAF-mTOR-hemming ble utilstrekkelig å dempe p-rpS6, og kombinert med den observasjon at PI3K-aktivitet og nedstrøms signalisering har vært foreslått som en mekanisme for resistens mot BRAF inhibering i kolorektal cancer [22] og melanom [23], [24], evaluerte vi virkningen av dual PI3K-mTOR-inhibering i COLO 205-celler i forbindelse med
V600EBRAF inhibering (fig. 6). COLO 205-celler ble behandlet med enten PLX4032, BEZ235, et lite molekyl dual inhibitor av PI3K og mTOR [25], eller en kombinasjon i 24 timer. Faktisk, inhibering av både mTOR-aktivitet, som målt ved p-AKT Ser473, og PI3K-aktivitet, som målt ved p-AKT Thr308, i nærvær av PLX4032 ført til større p27 protein nivå og redusert TK1 proteinnivåer. Disse resultatene blir bedt om vår vurdering av denne kombinasjonen
in vivo
.
Enkelt middel PLX4032 resultert i aktivering av p-AKT Ser473 etter 24 timers eksponering ved to konsentrasjoner (100 nm, 1 mm).
