Abstract
Interleukin (IL) -6 har vist seg å være en viktig medvirkende faktor i veksten og utviklingen av eggstokkreft. Cytokin utøver pro-tumorigent aktivitet gjennom aktivering av flere signalveier spesielt signal svinger og aktivator av transkripsjon (STAT3) og ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2. Derfor er rettet mot IL-6 stadig mer attraktivt som et behandlingsalternativ i eggstokkreft. Her undersøkte vi effekten av minocycline på IL-6 og dets signalveier i eggstokkreft.
In vitro
, minocycline ble funnet å vesentlig undertrykke både konstituerende og IL-1β eller 4-hydroxyestradiol (4-OH-E2) stimulert IL-6 uttrykk i menneskelig eggstokkreft celler; OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3. Videre minocycline nedregulert to hovedkomponenter i IL-6-reseptor-system (IL-6Rα og gp130) og blokkert aktivering av STAT3 og ERK1 /2 veier som fører til undertrykkelse av den nedstrøms produkt MCL-1. Hos hunn nakne mus som bærer intraperitoneale OVCAR-3-tumorer, akutt administrasjon (4 og 24 timer) av minocyklin (30 mg /kg) førte til undertrykkelse av IL-6. Selv enkeltdose av minocycline var effektive ved signifikant å senke plasma og tumor IL-6 nivåer. I tråd med dette, tumor uttrykk for p-STAT3, ble p-ERK1 /2 og MCL-en redusert i minocycline-behandlede mus. Evaluering av den funksjonelle innblanding av minocyklin på metastatisk aktivitet avslørte kapasitet minocyklin til å inhibere cellulær migrasjon, invasjon og adhesjon assosiert med nedregulering av matriks-metalloproteinaser (MMP) -2 og 9. Således kan data tyder på en mulig rolle for minocycline i undertrykker IL-6 ekspresjon og aktivitet. Disse effektene kan vise seg å være en viktig egenskap til de kommende kliniske studier av minocycline i eggstokkreft
Citation. Ataie-Kachoie P, Morris DL, Pourgholami MH (2013) Minocycline undertrykker interleukin-6, Its Receptor System og signalveier og svekker migrasjon, invasjon og heft kapasitet eggstokkreft celler: In vitro og in vivo studier. PLoS ONE 8 (4): e60817. doi: 10,1371 /journal.pone.0060817
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 28 november 2012; Godkjent: 03.03.2013; Publisert: 08.04.2013
Copyright: © 2013 Ataie-Kachoie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en svært dødelig gynekologisk kreft som generelle prognosen har vært dårlig de siste tiårene [1]. For å forklare de underliggende molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen av denne dødelige malignitet en rekke teorier har blitt foreslått så langt [1]. Overbevisende data støtter involvering av den inflammatoriske stromal mikromiljøet, forårsaket av over-uttrykk for cytokiner og kjemokiner fremme eggstokkreft tumorigenesis og kreft progresjon [2]. I særdeleshet, IL-6 produsert av tumor og /eller aktiverte immunceller som er blitt postulert å være en viktig funksjonelt cytokin som endrer tumorceller oppførsel gjennom kompliserte mekanismer [3]. IL-6 er uttrykt i primære, humane ovarie overflate-epitelceller og er blitt detektert dypt høyere i tumorvev [4], plasma og ondartede ascites av eggstokkkreftpasienter [5]. IL-6 uttrykk i eggstokkreft svulsten mikromiljøet kan påvirke vertens immunforsvarsmekanismer samt tumorcellevekst, spredning, differensiering og angiogenese [6]. Det også induserer metastaser ved oppregulering av kreftceller adhesjon og invasjon kapasitet [7]. Videre, IL-6 påvirkninger klinisk sykdomsstatus og prognose, ved utviser resistens mot konvensjonell terapi [8], stimulerende ondartet ascites formasjon [9], og indusering av symptomer som anoreksi, endret energimetabolisme, tretthet og anemi [10]. Nyere data tyder på at blokkering av IL-6 kan tilby et lovende terapeutisk strategi for å bedre behandling av pasienter med eggstokkreft. Inhibering av IL-6 signal har vist seg å dempe tumorvekst og de apoptotiske og metastatiske arrangementer i eggstokkkreftpasienter. Det resulterte også i lengre perioder med sykdomsstabilisering, reversering av chemoresistance og amplifisert vert immunitet hos pasienter med tilbakevendende kjemoresistent ovariekreft [3].
IL-6 overfører sine signaler gjennom samvirker med en reseptor kompleks bestående av liganden -binding glykoprotein betegnet IL-6R og den signal-overførende komponent gp130. Det er to typer av IL-6R, dvs. cellemembran-IL-6 reseptor (IL-6Rα) med lav affinitet som danner et kompleks med gp130 etter binding til IL-6 for å starte det intracellulære signal (klassisk signalering), og en oppløselig IL-6 reseptor (sIL-6R) som binder seg til IL-6 og deretter med membranen reseptor β kjede – gp130 fører til signaltransduksjon (trans-signalering) [11]. Den signaltransduksjon av IL-6 involverer aktivering av flere onkogene veier. Spesielt STAT3 fosforyleres og aktiveres i respons til IL-6. Etter fosforylering, danner STAT3 en dimer som deretter blir translokert til kjernen for å regulere ekspresjonen av flere gener som fører til induksjon av en serie av hendelser, inkludert tumorcellevekst, overlevelse og metastasering. I tillegg til STAT3 er mitogen aktivert protein-kinaser (MAPK) kaskade også aktivert i respons til IL-6 som fører til hyperfosforylering av en rekke proteiner, inkludert ERK1 /2 som i sin tur medierer aktivering av transkripsjonsfaktorer med forskjellige virkninger på tumorceller inkludert induksjon av overlevelse, migrasjon og invasjon kapasitet [12].
Minocycline (7-dimetylamino-6-desoxytertracycline) er et godt tolerert og trygt antibiotika fra andre generasjon tetracyklin familien. Foruten sin bredspektret antibiotikum aktivitet, minocycline også anerkjent som en anti inflammatorisk agent. Den brukes klinisk i behandling av sykdommer med inflammatorisk bakgrunn, slik som akne [13] og bulløs pemfigoid [14]. Videre har minocycline vist seg effektiv i behandling av autoimmune sykdommer så som revmatoid artritt [15] og sklerodermi [16]. Potente antiinflammatoriske og cellemodulerende aktivitet av minocyklin er antatt å være mediert gjennom hemming av proinflammatoriske cytokiner slik som tumornekrosefaktor α [17] og IL-1β [18]; og undertrykkelse av MMP’er [19]. Av spesiell interesse, er data som viser undertrykkelse av IL-6 av minocycline i monocytter [20] og sentralnervesystemet bosatt eller infiltrere celler [21]. Denne hemmende effekten har også blitt rapportert til IL-6 bølge observert i nevropatisk smerte [22]. Eksperimentelle data ved hjelp av ulike carcinom cellelinjer og dyremodeller har også vist at minocyklin og en rekke andre tetracykliner og deres kjemisk modifiserte derivater kan hemme tumorvekst og metastase ved å undertrykke matriksmetalloproteinaser og ved en direkte effekt på celleproliferasjon. Antitumor effektene av disse midlene har hittil blitt dokumentert i prekliniske modeller av leukemi [23], melanom [24], nyre, prostata [25] og brystkreft [26]. Langs denne linjen, har vi nylig kommunisert foreløpige resultater viser at minocycline hemmer veksten av menneskelig eggstokkreft xenografter [27], [28] og også undertrykker eggstokkreft indusert malign ascites formasjon [28]. Erkjennelsen av disse egenskaper i tillegg til den gunstige farmakologiske og fysiokjemiske profil av minocyklin inkludert høy lipofile egenskap, fullstendig absorpsjon [29], en lang halveringstid, klinisk ønskede farmakokinetiske karakteristika [30] og en god sikkerhetsprofil (gjennomsnittlig tolereres oral dose 400 mg /dag) [31] førte oss til å utforme denne studien å profilere dette stoffet med hensyn til dens virkninger på IL-6 og IL-6 signalveier i eggstokkreft. Heri presenterer vi vår
in vitro
resultater som viser evne minocycline å redusere både konstituerende og stimulert (enten ved IL-1 ß eller 4-OH-E2) IL-6 uttrykk i eggstokkreft celler. Videre har vi vist at minocycline undertrykker IL-6-reseptor-system (IL-6R og gp130), signalveier (STAT3 og ERK1 /2) og nedstrøms mål MCL-1 i disse cellene. I tillegg har vi vist at minocycline forstyrrer de metastatiske potensialer av eggstokkreft celler som ble forbundet med undertrykkelse av MMP-2 og MMP-9. Dette blir etterfulgt av vår
in vivo
-basert undersøkelse avslører for første gang virkningene av minocyklin for å redusere både plasma og tumoral IL-6 ekspresjon i tillegg til nedregulering av tumor p-STAT3, p-ERK1 /2 og MCL-en i en eksperimentell modell av eggstokkreft hos mus.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr verker er blitt gjennomført i henhold til University of New South Wales Animal Care og etisk komité (ACEC) retningslinjer. Alle prosedyrer utført på mus var i henhold til protokollen er godkjent av ACEC (godkjenningsnummer: 9 /23B). Og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse
Kjemi og Antistoffer
Med mindre annet oppgitt, ble alle legemidler og kjemikalier som brukes i denne studien hentet fra Sigma-Aldrich (Australian datterselskap, Sydney, Australia). Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt i denne studien: kanin polyklonale antistoffer spesifikke for IL-6Rα, gp130, Tyr
705-p-STAT3, STAT3, Mcl-1, p-P44 /42 MAPK (p-ERK1 /2) , P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Cell Signaling Technology, Sydney, Australia), MMP-2 og MMP-9 (Santa Cruz, Sydney, Australia) og mus monoklonale anti-β-aktin (R OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3-celler, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med 2 mM L-glutamin, 2 g /l natriumbikarbonat, 4,5 g /l glukose, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat (Invitrogen, Sydney, Australia) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin (50 U /ml) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO2.
in vivo
Eksperimenter
Kvinne naken atymiske Balb C nu /nu mus (6 uker gammel) ble kjøpt fra biologiske ressurser (Det medisinske fakultet, Universitetet i New South Wales). Musene ble plassert og vedlikeholdes i laminær skap under spesifikke patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av University of New South Wales Animal Care og etisk komité (ACEC). Alle prosedyrer utført på mus var i henhold til protokollen er godkjent av ACEC (godkjenningsnummer: 9 /23B) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. I korthet, 10 x 10
6 log-fase vekst OVCAR-3-celler suspendert i 0,5 ml fosfat-buffret saltvann (PBS) ble injisert intraperitonealt (i.p.) til hver mus. På dag 28 etter inokulasjon celle, ble mus randomisert til en av de behandlings eller kontrollgruppene. Minocycline ble oppløst i sterilt normalt saltvann (0,6 mg /ml). Mus ble injisert i.p. med en enkeltdose av minocycline (30 mg /kg). Kontrollgruppen mottok sterilt normalt saltvann i stedet. Ved slutten av behandlingsperioden (4 eller 24 timer) ble blod oppsamlet ved hjertepunksjon, ble dyrene avlivet ved hjelp av Lethabarb R (100 mg /kg) i.p. injeksjon (VIRBAC, Sydney, Australia) og svulster ble umiddelbart dissekert og bevart i -80 ° C i western blot analyse.
Immunocytochemistry Farging
Celler ble sådd på steriliserte glass dekkglass. Deretter ble de behandlet med minocycline i 24 timer, vasket med PBS og fiksert med 100 ul pr lysbilde av avkjølte 95% etanol, 5% iseddik i 10 min. Fikserte celler ble deretter vasket og inkubert i 0,3% Tween 20 i 20 minutter, vasket med PBS, blokkert med 1% BSA, inkubert med primære antistoffer i 1% BSA, etterfulgt av Alexafluor-konjugerte sekundære antistoffer i 1% BSA. Cellekjerner ble farget med propidiumjodid (PI) (1:2000 fortynning) i 1 min før dekkglass ble montert på objektglass ved hjelp av glyserol, og analysert for protein ekspresjon ved hjelp av Olympus IX71 laser scanning mikroskop med 60 x neddyppingsobjektivet linse.
Enzyme-Linked immunosorbent Assay (ELISA) for IL-6
in vitro
ble cellene sådd ut i 6-brønns plater i 10% FBS media i 24 timer for å fullføre feste . Deretter ble de enten stimulert med IL-1β (10 ng /ml) eller 4-OH-E2 (50 ug /ml) eller ikke-stimulert med eller uten forbehandling med minocycline. IL-6 produsert i kulturmediet ble kvantifisert ved anvendelse av IL-6-spesifikk ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner (Biolegend Inc., San Diego, CA). De vedlagte celler ble tellet for å normalisere IL-6 konsentrasjoner mot antall celler. Kvantitativ bestemmelse av IL-6 innholdet i plasma fra
in vivo
studie ble også utført ved hjelp av samme ELISA kit.
Western Blot analyse
For å undersøke effekten av minocycline på cellulær ekspresjon av gp130, IL-6Rα, p-STAT3, STAT3, Mcl-1, p-ERK, ERK, MMP-2 og MMP-9, western blot-analyse ble utført i henhold til standard prosedyre. I korthet ble cellene vasket i iskald PBS og ekstrahert i 30 minutter med en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM NaN3, 1% Triton X-100, 1% NP -40, 1 mM EGTA, 10% fosfatase-inhibitor og protease-inhibitor cocktail. Lysater ble fjernet ved sentrifugering ved 13.000 x
g
i 30 min og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-rød proteinanalyse. Ekvivalente mengder av fullcelle-ekstrakter ble oppløst ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og overført til en polyvinylidendifluorid-membran (Millipore Corporation, MA, USA). Membranene ble deretter probet med spesifikke antistoffer. Immun-komplekser ble påvist ved anvendelse av pepperrot-peroksidase konjugert med enten anti-mus eller anti-kanin, etterfulgt av kjemiluminescens deteksjon (Perkin Eimer Cetus, Foster City, CA, USA). For å demonstrere lik protein lasting, ble blotter strippet og reprobed med et spesifikt antistoff som gjenkjenner β-aktin.
Transwell migrasjon og invasjon analysen
Cell migrasjon og invasjon ble bestemt ved hjelp av en 24-brønns Transwell system med polykarbonat membraner av 8 mm porestørrelse (Life Technologies, Vic, Australia). I korthet, ble 1 x 10
3-celler sådd ut i 0,1% BSA RPMI-medium inneholdende varierende konsentrasjon av minocycline i det øvre kammer (normal kammer for migrering analysen og matrigel belagt kammer for invasjon analyse). Det nedre kammer ble fylt med det samme medium inneholdende 1% FBS. Etter inkubering i 18 timer ved 37 ° C, ble cellene i det øvre kammer fjernes forsiktig med en bomullsdott, og cellene som hadde gjennomløpt å reversere overflate av membranen ble fiksert i metanol, farget med Giemsa-løsning. For hver replikere (n = 3), migrasjon eller invasjon av cellene ble kvantifisert ved å telle de fargede celler (celler per fem felt) under invertert mikroskop.
celleadhesjonsanalyse
Analysen var utført som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [32]. Kort sagt ble SKOV-3-celler dyrket til 70% konfluens, serum-utarmet, og deretter behandlet med varierende konsentrasjoner av minocyklin (0-100 uM) i 18 timer. Celler ble fjernet ved anvendelse av ikke-enzymatisk løsgjøring løsning, vasket to ganger, resuspendert i RPMI uten serum inneholdende forskjellige konsentrasjoner av minocyklin (0-100 uM), og sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn på 96-brønners plater belagt med kollagen IV. Etter 30 min inkubasjon ved 37 ° C, ble mediet fjernet, og platene ble vasket to ganger i PBS. Cellene ble så fiksert med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett oppløsning, forsiktig vasket 3 ganger med PBS, og krystallfiolett-solubilisert ved hjelp av eddiksyre /metanol /vann (10:30:60), og absorbans ble avlest ved 595 nm.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble gjort med Graph Pad Prism programvare versjon 5.0 (CA, USA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Studenten
t
-test ble brukt til å sammenligne to uavhengige grupper betyr. En enveis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å bestemme de statistiske forskjeller mellom mer enn to grupper, og en to-veis gjentatte målinger ANOVA ble brukt til å evaluere tid og behandling interaksjonseffekter for den avhengige variable IL-6; en signifikant interaksjon ble tolket av en etterfølgende enkle effekter analyse med Bonferroni korreksjon. Statistisk signifikans ble etablert på
p
. 0,05 nivå
Resultater
Minocycline Reduserer konstitutiv ekspresjon av IL-6 i eggstokkreft celler
Å undersøke effekten av minocyklin på IL-6-ekspresjon i eggstokkreft celler, ble immunofluorescerende farging utført etter 24 timers behandling av OVCAR-3 (med lav IL-6 ekspresjon), SKOV-3 (med middels IL-6 ekspresjon), og CAOV -3 (med høy IL-6 ekspresjon) cellelinjer med minocycline (100 uM). Resultatene viste at minocycline betydelig redusert ekspresjon av IL-6 i alle tre eggstokk-kreft-cellelinjer (Fig. 1). For å kvantifisere denne effekten, ble ELISA-test som benyttes for å bestemme IL-6-nivåer i cellekulturmedier bade OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3-celler behandlet med minocycline (100 pM) i 1, 2, 4, 6 og 24 h. Som vist på fig. 2, for OVCAR-3-celler IL-6 var ikke påvisbar i media. Imidlertid minocycline behandlingen resulterte i tidsavhengig reduksjon i IL-6-ekspresjon i både SKOV-3 og CAOV-3-celler som var signifikant ved 6 timer med prosentuelle reduksjon i forhold til kontroll: 55 ± 5% for SKOV-3 (p 0,001 ), og 25 ± 4,5% for CAOV-3 (p 0,05); og 24 timer med prosentvis reduksjon i forhold til kontroll: 60 ± 7% for Skov-3 (p 0,001) og 35 ± 3,5% for CAOV-3 (p 0,001)
Representative confocal bilder av IL-. 6 (grønn) i OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3-celler under kontroll betingelser og eksponert overfor minocyklin (100 uM) i 24 timer. Celler ble også farget med propidiumjodid (rød). Bilder ble erholdt ved 60 x forstørrelse. Skalaen stolpene representerer 20 um.
minocycline (100 pM) ble redusert IL-6 ekspresjon av SKOV-3 og CAOV-3-celler i en tidsavhengig mønster som analysert ved hjelp av ELISA. Verdiene som vises er gjennomsnitt ± SD av data fra tre uavhengige eksperimenter (*
p
0,05 og ***
p
. 0,001
vs
kontrollgruppen) .
Minocycline Blocks IL-6 Surge i eggstokkreft celler stimulert med IL-1β eller 4-OH-E2
IL-1β er en potent induser av IL-6 i menneskets celler [33]. Det er blitt vist at både normale og maligne epiteliale eggstokk-celler sammen med aktiverte immunceller i stroma produserer IL-1β. Videre konstitutiv produksjon av IL-1β av eggstokk-carcinoma celler stimulerer produksjonen av cytokiner, slik som IL-6 [34]. For å simulere hva som skjer i ovarietumorer, brukte vi IL-1β (10 ng /ml) for å indusere IL-6 uttrykk i eggstokkreft celler og deretter undersøkt om minocycline kan blokkere økningen i IL-6 uttrykk. Ved hjelp av standard ELISA-kit, ble IL-6 konsentrasjoner i media av OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3 måles ved forskjellige tidspunkter etter stimulering med IL-1β. Det ble observert at IL-6-konsentrasjonen øket i en tidsavhengig måte i nærvær av IL-1β i media bading alle tre cellelinjer. Maksimal økning ble observert ved 6 timer med den prosentvise økning i forhold til kontroll av 335 ± 15% for OVCAR-3 (p 0,001), 110 ± 6% for SKOV-3 og 90 ± 5% for CAOV-3 (p 0,01); og 24 t med den prosentvise høyning i forhold til kontroll av 940 ± 13% for OVCAR-3, 185 ± 7,8% for SKOV-3 og 100 ± 5,4% for CAOV-3 (p 0,001) (figur 3A.). Forbehandling av IL-1β-stimulerte celler med minocycline (100 pM) førte til signifikant inhibering av IL-6-bølge ved 6 h (den prosentvise reduksjon i forhold til IL-1β stimulert gruppe: 40 ± 7,3% for OVCAR-3, 50 ± 4.5 % for SKOV-3 og 35 ± 6,2% for CAOV-3, p 0,05); og 24 timer (den prosentvise inhibering i forhold til IL-1β stimulert gruppe: 50 ± 3,8% for OVCAR-3, 50 ± 2,5% SKOV-3 og 30 ± 5% for CAOV-3, p 0,001). For ytterligere å bekrefte at IL-6-produksjon modulerende effekt av minocyklin, ble virkningen av medikamentet undersøkt i 4-OH-E2-behandlede eggstokkreft celler. Det er godt dokumentert at steroidhormoner, spesielt østrogener kan modulere cytokinproduksjon ved induksjon av IL-1β gen på transkripsjonsnivå [35]. 4-OH-E2 er katekol metabolitt av 17β-østradiol som er den mest biologisk aktive ovarialt østrogen. I eggstokkreft celler, er 4-OH-E2 en potent mitogen stoff [36] som induserer andre vekstfaktorer og kreftfremkallende trasé [37]. Her, OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3-celler ble behandlet med 4-OH-E2 (50 ug /ml) og IL-6-konsentrasjon ble målt i cellekulturmedia etter 6 og 24 timer. For OVCAR-3 celler, IL-6 var ikke påvises i media opp til 24 timer etter 4-OH-E2 behandling. Men 4-OH-E2-behandling resulterte i en signifikant økning i IL-6 konsentrasjoner i både SKOV-3 og CAOV-3-celler media ved 6 h (5 og 12 ganger økning for SKOV-3 og CAOV-3, henholdsvis) ( p 0,001); og 24 timer (6 og 3 ganger økning for SKOV-3 og CAOV-3, henholdsvis) (p 0,01) (Fig. 3B). Som vist på fig. 3B, minocycline forbehandling av 4-OH-E2-stimulerte celler resulterte i konsentrasjonsavhengig inhibering av IL-6-ekspresjon. Ved en konsentrasjon på 100 uM minocyklin blokkerte fullstendig IL-6 bølge som induseres av 4-OH-E2 i begge SKOV-3 og CAOV-3 cellelinjer.
(A), OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV -3-celler ble forbehandlet med minocycline (100 uM), etterfulgt av stimulering med IL-1β (10 ng /ml) i forskjellige tidspunkter. Nivåer av IL-6 i dyrkningsmedier ble kvantifisert ved sandwich-ELISA. Hver data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (*
p
0,05, **
p
0,01 og ***
p
. 0,001
vs
kontrollgruppen,
# p 0,05 og
###
p
. 0,01
vs
IL-1β-stimulert gruppe). (B) OVCAR-3, SKOV-3 og CAOV-3-celler ble forhåndsbehandlet i 1 time med varierende konsentrasjoner av minocyklin (0-100 pM) etterfulgt av stimulering med 4-OH-E2 (50 ug /ml) i 6 og 24 timer. Mediene ble samlet opp og IL-6-nivå ble analysert ved hjelp av ELISA. Verdiene som vises er gjennomsnitt ± SD av data fra tre uavhengige forsøk (*
p
0,05, **
p
0,01 og ***
p
0,05 og **
p
0,01
vs
kontrollceller,
#
p
0,05 og
##
p
. 0,01
vs
IL-1β behandlede celler).
Influence of Minocycline på STAT3 og ERK1 /2 Fosforylering og Mcl-1 Expression i IL-1β stimulert og ikke-stimulerte eggstokkreft celler
for å undersøke hvorvidt minocycline hemmer STAT3 fosforylering i eggstokk-kreft, ble SKOV-3-celler som uttrykker vedvarende aktivert STAT3 behandlet med minocycline med eller uten IL-1β stimulering, til forskjellige tidspunkter. Det ble observert at minocycline behandlingen resulterte i nedregulering av basal p-STAT3 på en tidsavhengig måte med maksimal hemmende effekt som opptrer ved 6 h (2,5 gangers reduksjon sammenlignet med kontroll, p 0,01). IL-1β stimulering oppregulert fosforyleringen av STAT3 tidsavhengig med maksimal økning på 6 timer (2,5 gangers økning sammenlignet med kontrollen). Forbehandling av IL-1β-stimulerte celler med minocycline hemmet STAT3 fosforylering med optimal effekt på 6 t (5 ganger reduksjon i forhold til IL-1β-stimulert gruppe, p 0,001). Men denne effekten var reversibel og nivåene av p-STAT3 vendte tilbake til kontrollnivåer etter 24 timers behandling. Det ble ikke observert signifikante endringer i total Stat3 nivåer (Fig. 5A).
Skov-3 celler ble behandlet med minocycline (100 mm) med eller uten IL-1β (10 ng /ml) stimulering for ulike tidspunkt . Uttrykket nivåer av (A) p-STAT3, STAT3; (B) Mcl-1 eller (C) p-ERK1 /2, ERK1 /2 ble anslått ved western blot-analyse. Densitometrisk analyse er uttrykt som gjennomsnitt ± SD intensiteten av optisk tetthet oppnås ved tre uavhengige eksperimenter (*
p
0,05, **
p
0,01 og ***
p
0,001
vs
kontrollceller,
#
p
. 0,05,
##
p
0,01
vs.
IL-1β behandlede celler).
MCL-1 er en apoptose hemmende protein nedstrøms av IL-6 /STAT-3 bane. Vi evaluerte således effekten av minocyklin på Mcl-1 i SKOV-3-celler i henhold til både normale og IL-1β-stimulerte betingelser. I ikke-stimulerte SKOV-3-celler, minocyklin-behandling førte til nedregulering av Mcl-1-protein som starter ved 2 timer (1,5 gangers reduksjon sammenlignet med kontroll, p 0,05) med den maksimale inhibering ved 6 h (3 gangers nedgang sammenlignet kontrollen, s 0,01). Men etterhvert proteinnivåer returnerte til det normale kontrollverdi av 24 timer. Behandling av IL-1-stimulerte celler førte også til en tidsavhengige inhiberende virkning på Mcl-1-protein, hvor den maksimale inhibering kunne observeres ved 24 timer (6 gangers nedgang i forhold til IL-1β-stimulert gruppe, p 0,01) ( fig. 5B).
i et forsøk på å bestemme hvorvidt minocyklin hemmer MAPK-reaksjonsveien, effekter av minocyklin på fosforyleringen av ERK1 /2 i normal og IL-1β indusert SKOV-3-celler ble undersøkt. Som vist på fig. 5C, ble det ikke observert signifikante endringer i p-ERK1 /2 protein nivåer av ikke-stimulerte celler etter minocycline behandling. IL-1β stimulering økt phorphorylation av ERK1 /2 på en riktig måte. Behandling med minocycline før IL-1β stimulering dramatisk undertrykt fosforylering av ERK1 /2 2 h (8 ganger reduksjon i forhold til IL-1β-stimulert gruppe, p 0,01). Imidlertid, p-ERK1 /2 proteinnivåer tilbake til normale kontrollverdier etter 24 timer. Minocycline behandling endret ikke den generelle uttrykk for ERK1 /2 protein.
Minocycline hemmer trans av STAT3 til Nucleus
Etter fosforylering i cytoplasma, STAT3 translocates til kjernen for å treffe sin transkripsjonen aktivitet. Her har vi brukt immunfluorescens konfokalmikroskopi med antistoffer som spesifikt bundet til p-STAT3 (Tyr 705) eller total STAT3 å bekrefte at minocycline blokker fosforylering og kjernefysisk translokasjon av STAT3. Som vist på fig. 6A, minocycline (100 mm) behandling trykt fosforylering av STAT3 i Skov-3 celler som er i samsvar med de vestlige blot analyseresultater. Videre ble nukleær translokasjon av STAT3 hemmet i celler eksponert overfor minocyklin (100 pM) (Fig. 6B).
Confocal immunocytokjemi av (A) p-STAT3 og (B) STAT3 (grønn) i SKOV-3 cellene ble behandlet med 100 uM minocycline i sammenligning med kontrollceller. Kjernene er kontra med propidiumjodid (rød). Bilder ble erholdt ved 60 x forstørrelse. De skala barer representerer 10 mikrometer.
Minocycline Demper Ovarian Cancer Cell metastatisk potensial som er assosiert med redusert MMP-2 og MMP-9 Expression
IL-6 bidrar til eggstokkreft metastaser via en komplisert flertrinnsprosess som involverer adhesjon, migrasjon og invasjon av kreftceller [7]. Vi utførte neste Boyden kammere cellemigrering assay og matrigel invasjon analyse for å bestemme om minocyklin-indusert IL-6 undertrykkelse fører til hemming av SKOV-3-celler metastatisk aktivitet. Behandling med minocycline (18 timer) vesentlig attenuert migreringen (fig. 7A) og invasjon (fig. 7B) evne til SKOV-3-celler på en doseavhengig måte. Videre minocycline hemmet kapasiteten på SKOV-3-celler til å forholde seg til brønner belagt med humant kollagen type-IV på doseavhengig måte (fig. 7D).
Virkningene av minocyklin på SKOV-3 (A) og cellemigrering (B) invasjon ble målt ved hjelp av Transwell-analyse. Minocycline ble påført ved forskjellige konsentrasjoner (0-100 uM) i 18 timer. (C) Ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 anslått ved western blot-analyse etter 18 timers behandling av SKOV-3-celler med varierende konsentrasjon av minocyklin. (D) Cell heft etter 18 timer eksponering for varierende konsentrasjoner av minocycline som beskrevet i Materiale og metode (*
p
0,05, **
p
0,01 og ***
p
0,001
vs
kontroll)
uttrykk av MMP, særlig MMP-2 og MMP-9, kan fremme celle migrasjon og invasjon av.. selektiv proteolyse av ekstracellulære matrix komponenter [38]. For å studere effekten av minocyklin på MMP-aktivitet i eggstokkreft celler, analyserte vi ekspresjonen av MMP-2 og MMP-9 i SKOV-3-celler etter behandling med varierende konsentrasjoner av minocyklin i 18 timer. Som vist på fig. 7C, redusert minocycline både MMP-2 og MMP-9 ekspresjon doseavhengig. Disse dataene antyder at hemming av metastatisk potensial for eggstokkreft celler ved minocycline er assosiert med redusert MMP-2 og MMP-9 uttrykk.
Minocycline hemmer IL-6 i en eksperimentell modell for eggstokkreft i Mus
evnen minocycline å hemme IL-6 og sine baner i eggstokkreft celler
in vitro
var en god indikasjon på at det har potensial til å påvirke IL-6 nivåer
in vivo
. Her, observerte vi at enkeltdose minocycline behandlingen resulterte i en betydelig reduksjon i plasma (Fig. 8A) og tumor (Fig. 8B) IL-6 nivåer både etter 4 og 24 timer. Videre tumorale uttrykk for p-STAT3 og MCL-1 ble signifikant hemmet i 4 og 24 timer behandlingsprøver. Hemming av ERK1 /2 aktivering ble observert i de 4 h behandlede kreftprøver som forenlig med
in vitro
resultater, ser ut til å bli utvunnet av 24 timer (Fig. 8B).
( A) IL-6-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA i plasma hos mus med ip
