Abstract
Det er et presserende behov for bedre behandling ved avansert ovarialcancer, som kan bli møtt av administrering av immun-modulerende monoklonale antistoffer (mAbs) for å generere et tumor-destruktiv immunrespons. Ved hjelp av ID8 mus eggstokkreft modell, undersøkte vi den terapeutiske effekt av forskjellige mAb kombinasjoner i mus med intraperitoneal (i.p.) tumor etablert ved å transplantere 3 x 10
6 ID8 celler 10 dager tidligere. Mens de fleste av de testede mAb var ineffektive når de gis hver for seg eller sammen, de data bekrefter våre tidligere funn at to i.p. injeksjoner av en kombinasjon av anti-CD137 med anti-PD-1 mAb dobler total overlevelse. Mus behandlet med mAb denne kombinasjonen har en vesentlig høyere frekvens og totalt antall CD8
+ T-celler både i peritoneal lavage og milten, og disse cellene er funksjonelle som demonstrert ved antigen-spesifikk cytolytisk aktivitet og IFN-γ produksjon. Selv om administrering av anti-CD137 mAb som et enkelt middel tilsvarende øker CD8
+ T-celler, disse har ingen funksjonell aktivitet, som kan tilbakeføres til oppregulering av co-hemmende PD-1 og Tim-3-molekyler indusert ved CD137 . Tilsetning av anti-kreft legemiddel cisplatin til de to mAb kombinasjonen øket overlevelse 90 dager (og var sannsynligvis kurativt) ved en mekanisme som inkluderte en systemisk CD8
+ T-cellerespons med tumor spesifisitet og immunologisk hukommelse. Påfallende, kombinert behandling av cisplatin og CD137 /PD-1 mAb ga også opphav til den langsiktige overlevelsen av mus med etablerte TC1 lungesvulster. En tilsvarende kombinasjon av de 2 mAbs og cisplatin bør vurderes for klinisk «oversettelse».
Citation: Wei H, Zhao L, Li W, Vifte K, Qian W, Hou S, et al. (2013) Kombi PD-1-blokkaden og CD137 Activation har terapeutisk effekt i Murine Cancer Modeller og synergizes med cisplatin. PLoS ONE 8 (12): e84927. doi: 10,1371 /journal.pone.0084927
Redaktør: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Nederland
mottatt: 5 juni 2013; Godkjent: 20 november 2013; Publisert: 19.12.2013
Copyright: © 2013 Wei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81372528), Ministry of Science Technology of China «973» (No. 2012CB917104), spesial bevilgninger fra Kunnskapsdepartementet i Kina og Shanghai Commission of Education for fremragende forskning team i onkologi og Shanghai KeyProject i onkologi samt ved RO1CA134487 fra amerikanske National Institutes of Health. Virkemiddelapparatet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitelovarialcancer karsinom (EOC) er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer i USA, og er den fjerde vanligste årsaken til kreftdød blant kvinner [1]. Over 70% av kvinner med EOC stede med avansert stadium sykdom og svulst formidling gjennom bukhulen [2]. Standard behandling for eggstokkreft er kirurgisk debulking etterfulgt av platina-taxan basert kjemoterapi [3]. Cisplatin og dets platinaderivater er førstelinje kjemoterapeutika i behandling av eggstokkreft. Cisplatin induserer apoptose av irreversibelt interkalering DNA gjennom inter- og intrakjede DNA-addukter, for derved å indusere DNA-skade og aktivering av apoptotiske maskineri [4]. De fleste pasienter er lydhør overfor kjemoterapi først; imidlertid vil de fleste etterhvert har et tilbakefall og dø av sykdommen. Derfor er nye komplementære strategier for å forbedre utfallet av eggstokkreft.
Det er flere grunner til å anta at immunterapi for EOC kan være effektive [5]. EOC celler uttrykker tumorassosierte antigener mot hvilke spesifikke immunresponser er oppdaget [6-10]. Studier utviklet av Coukos indikerer at immunologiske mekanismer spiller en viktig rolle i den kliniske resultatet siden det er en nær sammenheng mellom overlevelse og tumorinfiltrasjon med CD3
+ T-celler [11]. EOC metastaser er ofte begrenset til bukhulen, noe som letter den lokale leveringen av terapeutiske midler [12]. De fleste pasienter med langt fremskreden sykdom kan bringes i midlertidig klinisk remisjon hvor svulsten belastningen er liten, og derfor mer sannsynlig å svare [9]. Imidlertid har klinisk suksess med immunterapi for EOC vært beskjeden [13].
Flere nyere studier har vist terapeutisk effektivitet både i musemodeller og humane pasienter ved administrasjon av mAbs som kan modifisere immunresponsen når de anvendes alene eller i kombinasjoner. For eksempel mAbs til CTLA4 ha antitumor-effekt ved langvarig total overlevelse hos pasienter med metastatisk melanom, og et anti-CTLA4 mAb er klinisk godkjent av FDA [14]. Gunstige terapeutiske effekter er påvist i mus med etablerte tumorer [14,15] av engasjerende CD137 (aka 4-1BB), ved hjelp av agonist antistoffer, dimer RNA aptamerer eller tumorceller uttrykker et overflate festet anti-CD137 enkelt kjede antistoff [15, 16], og de prekliniske data har ført til kliniske studier med humanisert mAbs rettet mot CD137 [17]. Programmert død 1 (PD-1) proteinet er en co-inhiberende reseptor på T-celler med en struktur lik den til CTLA-4, men med en tydelig biologisk funksjon og spesifisitet ligand [18]. Blokkering av interaksjonen mellom PD-1 og dens ligand, PD-L1, forsterker T-celle immunresponser in vitro og medierer antitumoraktivitet [19-21]. De prekliniske resultatene har ført til nylig rapportert kliniske forsøk som viser at anti-PD-1 og anti-PD-L1 mAb fremstille en imponerende antitumoraktivitet i ikke-småcellet lungekreft, melanom og nyrecellekreft med fullstendig regresjon oppnådd hos noen pasienter [22-24].
På tross av den lovende antitumor effekt av flere mAb, er mange svulster er motstandsdyktige overfor behandling med enkelt anti-CD137, anti-PD-1 eller anti-CTLA4 mAb [25,26] og kombinasjoner av to eller flere mAb’er kan være nødvendig. Vi har nylig demonstrert i alle 4 musetumormodeller, herunder ID8 klon av det MOSEC murine eggstokkreft, at gjentatt levering til tumorstedet av en kombinasjon av mAb’er mot CD137 /PD-1 /CTLA4 forårsaket langtids tumor-regresjoner og selv kurer og at en mAb kombinasjon som også omfattet en mAb til CD19 var enda mer effektiv [27]. Selv om disse data er viktig ved å vise at en overgang fra en Th2-typen inflammatorisk respons, som er utbredt i tumorer [28-30], til en Th1 typen reaksjon kan være helbredende, gjentatt levering av 3-4 mAbs til tumor områder er ikke praktisk for klinisk «oversettelse».
problemet forbundet med behovet for lokal levering kan overvinnes for eggstokk-kreft ettersom de vokser og primært metastaserer i det peritoneale hulrom og er således tilgjengelige. Videre kan antallet av nødvendig mAb’er bli redusert til to, siden vi allerede har funnet at en kombinasjon av anti-CD137 og anti-PD-1 mAb kan doble overlevelsen av mus med etablerte ID8 tumorer, selv om det ikke er helbredende [28]. Basert på disse funnene vi har nå sammenlignet
in vivo
terapeutisk effekt, målt som forlenget total overlevelse, anti-CD137 /PD-en kombinasjon med at de mAbs gitt som enkle midler samt med andre mAbs og mAb kombinasjoner. Vi videre undersøkt systemiske og lokale immunologiske mekanismer som er engasjert av enkle eller kombinerte anti-CD137 /PD-1 mAbs. Viktigere, vi viste senere at en kombinasjon av anti-CD137 /PD-1 mAb med anti-kreft legemiddel cisplatin forlenger betydelig levetid og er sannsynligvis kurativ til 80% av mus med etablert ID8 carcinoma ved en mekanisme som innebærer funksjonell CD8
+ T-celler og har tumor antigen spesifisitet, så vel som immunologisk hukommelse. En lignende diett resulterte også i langtidsoverlevelse av 33,3% av mus med etablert TC1 lungekarsinom. En tilsvarende tilnærming bør være «oversettes «til klinikken.
Materialer og metoder
Mus og cellelinjer
For eksperimenter utført i Kina, 6-8 -week kvinnelig C57BL ble kjøpt fra Animal Experimental Center of the Second Military Medical universitet og dyre protokoller ble godkjent av Institutional Review Board of Second Military Medical University. Dyreforsøk, utført i Seattle benyttes mus kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA) og protokollene ble godkjent av Institutional Review Board of University of Washington.
ID8 er en klone av MOSEC ovarialcancer av C57BL /6 opprinnelse [31] og TC1 er en klon avledet fra primære lunge epitelceller hos C57BL /6-mus ko-transformert med HPV-16 E6 og E7 [27]. De EL4 murine T-celle-lymfom celler er av C57BL /6 opprinnelse [32]. ID8 og TC1 tumorceller ble dyrket i komplett DMEM-medium supplert med 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), ble 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin før cellesuspensjoner fremstilt og transplantert til mus. De EL4 celler og splenocytter ble opprettholdt i et fullstendig medium RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 25 mM HEPES, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
Reagenser
følgende monoklonale antistoffer (mAb) som brukes i dyreforsøk ble kjøpt fra BioXcell (West Lebanon, NH): anti-CD137 (Clone lob12.3), anti-PD-1 (Clone RMP1-14), anti- CTLA4 (Clone 9D9), anti-NK1.1 (Clone PK136), anti-CD8 (Clone 2,43), anti-CD4 (Clone GK1.5) og kontroll (Clone 2A3). Den anti-CD137 antistoff fra klon 2A ble fremstilt i vårt laboratorium som beskrevet tidligere [33].
Dyrestudier
Mus ble injisert intraperitonealt (i.p.) med 3 × 10
6 ID8 celler i 0,1 ml PBS. På dager 10 og 14 etter tumor-inokulering, ble mus injisert i.p. med 0,5 mg av hver mAb i totalt 0,5 ml PBS, som vist i figuren sagn. I forsøk med mAb /cisplatin kombinert terapi, gruppe mus (10 mus per gruppe) peiling 10 dager etablert ID8 svulst fått to doser av kontroll, anti-PD-1, anti-CD137 eller anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg per dose per mus) med 4 dagers intervaller med eller uten cisplatin (10 mg /kg) samtidig administrasjon ved sin første behandling. Musene ble veid hver andre dag og sjekket daglig for hovne magen som indikerer ascites informasjon og for eventuelle tegn på toksisitet, slik som endret atferd, manglende evne til å bevege seg, spise eller drikke. Etter institusjonelle retningslinjer, ble musene drept da de utviklet ascites og hadde en vektøkning 30%. Overlevelsen av hver mus ble registrert og total overlevelse ble beregnet. For kombinerte terapi eksperimenter i TC1 tumormodell, mus (6 pr gruppe) ble injisert subkutant (s.c.) med 5 x 10
5 TC1 celler i 0,1 ml PBS. På dag 5 og 9 etter tumor transplantasjon, ble mus injisert intratumorally (i.t.) med mAbs og /eller cisplatin ved hjelp av dose /planen som beskrives ovenfor. Tre vinkeldiameter på subkutant Tumorene ble målt hver andre dag ved hjelp av et skyvelære, og tumorvolumene ble beregnet i henhold til formelen: 1/2 x (lengde) x (bredde)
2. Mus ble ofret da de virket døende eller deres s.c. Tumorene nådde 10 mm i diameter.
For å vurdere utviklingen av immunologisk hukommelse, 15 langsiktig overlevende mus som fikk cisplatin /anti-PD1 /CD137 kombinasjonsbehandling (samlet fra 2 uavhengige forsøk) eller 5 alders matchet naive mus (som fungerte som kontroll) ble utfordret ip eller subkutant med 3 × 10
6 ID8 celler eller 1 × 10
6 syngene men antigenically forskjellige TC1 celler. Tumorvekst hos mus ble evaluert som beskrevet ovenfor.
For utarming eksperimenter, et anti-CD4 (0,2 mg /mus), anti-CD8 (0,2 mg /mus), anti-NK1.1 (0,1 mg /mus) eller kontroll mAb (0.2 mg /mus) ble injisert ip 48 og 72 timer før behandling og hver 3-4 dager etterpå for varigheten av forsøkene. Uttømming av hensiktsmessige celleundergrupper ble bekreftet ved flowcytometrisk analyse (data ikke vist).
Evaluering av immuncelle undergrupper i milten og peritoneal LAVAGES av flowcytometri
Mus som hadde blitt transplantert intraperitonealt med ID8 celler ble avlivet 7 og 14 dager etter at de hadde blitt injisert med anti-PD1, anti-CD137, anti-PD1 /CD137 eller kontroll som i terapi eksperimenter. Enkeltcellesuspensjoner fra miltene ble fremstilt som tidligere beskrevet [27]. For å oppnå peritoneal-immune celler, ble 3 ml PBS injisert i bukhulen til mus med ID8 tumorer umiddelbart etter avlivning, ble deres buk masseres og væsken ble fjernet, filtrert gjennom en 70 uM cellefilter (BD Biosciences, San Jose, CA) , vasket og immunceller ble isolert ved hjelp av en mus lymfocyttisolasjonsmetoder buffer (Cedarlane, Burlington, Ontario) etter produsentens anvisninger.
Single-cellesuspensjoner ble vasket med FACS flekker buffer og inkubert med musen Fc reseptor binding hemmer i 10 minutter før farging med antistoffer av CD45 (klon 30-F11), CD3 (klon 145-2C11), CD4 (klon GK1.5), CD8 (klon 53-6,7), CD19 (klon eBio1D3), CD11b (klon M1 /70), GR-1 (klon RB6-8C5), TIM-3 (klon 8B.2C12) og PD-1 (klon J43; alle fra eBioscience, San Diego, CA) i 30 minutter. For intracellulær farging av foxp3 (klone FJK-16, eBioscience), IFN-γ (klone XMG1.2; eBioscience) og IL-10 (klone JES5-16E3; eBioscience), celler ble fikset, permeabilized, og farget følge instruksjonen av Cytofix /Cytoperm kit (BD Biovitenskap). Strømningscytometri ble utført ved bruk av FACSCalibur (BD Biosciences) og lymfocyttpopulasjon ble valgt av port CD45-positive celler. Dataene ble analysert ved hjelp av Flow Jo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon). Alt flowcytometri eksperimenter ble utført minst 3 ganger.
Evaluering av antigen-spesifikk immunrespons
isolerte splenocytter fra behandlede mus ble dyrket i nærvær av 10 ug /ml H-2 dB-restricted mesothelin avledede peptider (mesothelin aminosyre 406-414) eller Ctrl HPV-E7-avledet peptid (HPV-E7 49-57, alt fra Shanghai Science Peptide Bioteknologi Co.Ltd, Shanghai.) i 3 dager. Deretter ble IFN-γ i supernatantene påvist ved Mouse IFN-γ Quantikine ELISA-sett (R 0,05
Resultater
Synergistic antitumor effekt av anti-CD137 /PD-1 mAbs
Vi har evaluert antitumor effekt av ulike kombinasjoner av agonistiske eller antagonistiske mAbs mot co-stimulerende eller co-hemmende molekyler i C57BL mus transplantert ip 10 dager tidligere med 3 × 10
6 ID8 celler. Basert på publiserte bevis som indikerer en terapeutisk potensiale i flere tumormodeller vi testet mAbs til CD137, CD40, CTLA-4, PD-1, TIM-3 og LAG-3 [34,35], som enkle midler og i kombinasjoner. Ubehandlede mus og mus som fikk en kontroll mAb utviklet ascites ca 30 dager etter tumorinokulasjon og måtte avlives. Som vist i figur 1, de fleste av de testede mAb kombinasjonene hadde liten eller ingen effekt på den totale overlevelse av tumorbærende mus, og ingen av mAbs var terapeutisk effektive når de brukes alene. I samsvar med våre nylig publiserte resultater [27], kombinert behandling av anti-CTLA4, PD-1 og CD137 mAbs betydelig forlenget overlevelse av mus med den gjennomsnittlige overlevelsestiden øker til 80 dager (Figur 1A, B; p 0,05 sammenlignet med kontroller) . Kombinert behandling av anti-CTLA4, PD-1, TIM-3 og CD40 mAb også undertrykket tumorvekst, men var mindre effektiv med midlere overlevelsestiden 49 dager. Andre mAb kombinasjoner, inklusive anti-CTLA4 /PD-1, anti-CTLA4 /PD-1 /CD40, anti-CTLA4 /PD-1 /TIM-3, anti-CTLA4 /PD-1 /LAG-3 og anti-CTLA4 /PD-1 /LAG-3 /CD40 hadde ingen effekt på tumorvekst.
Mus (5 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 10 dager tidligere ble injisert intraperitonealt to ganger med 4 dagers intervaller med de indikerte mAb kombinasjoner (0,5 mg av hver mAb /mus); overlevelse ble registrert (A, C) og midlere overlevelsestid ble beregnet (B, D). Eksperimentet ble gjentatt en gang med lignende resultater. E, mus (8-9 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 3 dager tidligere ble injisert intraperitonealt to ganger på fire dager intervall med 0,5 mg av kontroll, anti-PD-1, anti-CD137 og anti-PD-1 /CD137 mAb og deres overlevelse ble registrert. * P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med kontroll mAb-behandlede mus.
neste gjentok ovenfor eksperimenter ved hjelp av to forskjellige kloner av mAb mot CD137 (2A og lob12.3). Som vist i figur 1C og D, selv om enkelt mAb behandling ikke forlenge totaloverlevelse, kombinasjon av anti-PD-1 mAb med enten anti-CD137 mAb like forlenget overlevelse av mus med den midlere overlevelsestiden dobles (p 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen og enkelt mAb-grupper), som ble ytterligere forbedret ved tilsetning av anti-CTLA4 mAb (p 0,01 sammenlignet med kontroll og enkelt mAb-grupper). En gjentagelse av forsøket ga lignende resultater (data ikke vist).
Spesielt, gjorde vi ikke oppdage noen uttrykk for CD137 og PD-1 molekyler og deres respektive ligander CD137L og PD-L1 /PD-L2 på overflaten av ID8 eggstokkreft kreftceller (data ikke vist), unntatt muligheten for at inhibering av tumorvekst ID8
in vivo
er direkte mediert av anti-CD137 plus anti-PD-1 mAb.
Interessant, enten anti-CD137 eller anti-PD-1 mAb alene beskyttet mot utvekst av ID8 celler i 3 dager etablerte ID8 modell med respektive 66,7% og 37,5% av musene overlevde 90 dager da forsøket ble avsluttet og musene avlivet (figur 1E). Bukhulen til disse musene var tumorfrie. Det er bemerkelsesverdig at anti-CD137 mAb var mer effektiv enn anti-PD1 mAb og at en kombinasjon av de to var moderat mer effektive (77,8% overlevende mus) enn anti-CD137 mAb alene.
Økt andel av effektor T-celler og redusert andel av immunsuppressive celler indusert av anti-CD137 /PD-1 mAbs
For å undersøke om kombinert anti-PD-1 /CD137 mAbs indusert en systemisk immun reaksjon, injiserte vi mus transplantert 10 dager tidligere med ID8-celler (som i terapi eksperimenter) med enten en kombinasjon av anti-PD-1 /CD137 mAb eller enten mAb alene. Syv dager senere, analyserte vi ved hjelp av strømningscytometri prosent, absolutte tall og effektor funksjon av lymfocytt-delmengdene i miltene fra de behandlede mus. Som vist i figur 2A, milter fra mus behandlet med kombinert anti-PD1 /CD137 mAb viste en signifikant økning i frekvens og absolutte antall CD3
+ (p 0,01) og CD8
+ T (p 0,001) -celler og reduserte nivåer av CD4
+ foxp3
+ regulatoriske T (treg) celler (p 0,001) og GR-1
+ CD11b
+ myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs) (p 0,05 ); representative tomter er vist i (figur 2B). Kombinert anti-PD1 /CD137 mAbs også forhøyet nivåer av CD44
+ CD62L
– effektor /minne (p 0,01), CD44
+ CD62L
+ sentral minne (p 0,05), IFN -γ produserende effektor CD8
+ T celler (p 0,01) og redusert CD8
+ T-celler som produserer IL-10 (p 0,001) i milten (figur 3A); Representative plott er vist i figur 3B. Dataene indikerer at anti-PD-1 /CD137 mAb terapi genereres en systemisk immunrespons som domineres av en signifikant økning CD8
+ effektor-T-celler og nedsatt immunundertrykkende celler.
Mus (3 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 10 dager tidligere ble injisert intraperitonealt med 0,5 mg av kontroll, ble anti-CD137, anti-PD-1 eller anti-PD-1 /CD137 mAb og mAb injeksjonen gjentas 4 dager senere. Syv dager etter den andre injeksjonen ble milten høstet og enkeltcellesuspensjoner fremstilt og farget med fluorescens-merkede antistoffer mot markører for lymfocytt-delmengdene før analyse ved strømningscytometri. Prosentene og antall CD3
+, CD4
+, CD8
+, CD19
+, foxp3
+ /CD4 og GR-1
+ CD11b
+ celler i milter er vist i (A) og representative dotplots er vist i (B). Data er presentert som M ± SEM fra tre mus /gruppe og er representative for 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0.001, Funnene med anti-PD-1 eller CD137 enkelt mAbs blir sammenlignet med kontroll mAb, og resultatene med anti-PD-1 /CD137 mAb blir sammenlignet med både kontroll og enkelt mAb.
Mus (3 /gruppe) som var blitt transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 10 dager tidligere ble injisert intraperitonealt to ganger med 4 dagers intervaller med 0,5 mg av kontroll, anti-CD137, anti-PD-1 eller anti-PD-1 /CD137 mAb. Milter fra behandlede mus ble analysert for fenotyper og effektorfunksjoner av CD8
+ T-lymfocytter ved flowcytometri 7 dager etter den andre injeksjonen mAb. Prosentene og antall CD44
+ CD62L
– effektor /minne og CD44
+ CD62L
+ sentral minne og IFN-γ- og IL-10-produserende celler i CD8
+ T-cellepopulasjonen er vist i (A) og representative dotplots er vist i (B). Data er presentert som M ± SEM fra 3 mus i hver gruppe og er representative for 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001, PD-1 eller CD137 mAb sammenlignet med kontroll mAb, PD-1 /CD137 mAb sammenlignet med kontroll og enkelt mAb.
Antigen-spesifikke CTL respons indusert av anti-CD137 /PD-1 mAbs
Vår tidligere studie vist at kombinert anti-CTLA4 /PD-1 /CD137 mAbs indusere en potent antigen -spesifikk Th1 type immunrespons i milter fra ID8-bærende mus [27], hvis splenocytter produserte høye nivåer av IFN-γ ved stimulering av peptid avledet fra ID8 celle-uttrykkende mesothelin, et godt karakterisert ovarial tumor antigen [9]. På samme måte, vi oppdaget at IFN-γ produksjon av splenocytter fra mus behandlet med kombinert anti-PD-1 /CD137 mAb i respons til stimulering med mesothelin, men ikke et HPV-E7 avledet peptid anvendt som kontroll (data ikke vist). Vi videre fastslått om splenocytes hadde cytolytisk aktivitet. Splenocytter fra mus behandlet med anti-PD-1 /CD137 mAb ble restimulert med UV-bestrålte ID8-celler i 4 dager før CTL-analyser ble utført ved anvendelse av EL4-celler pulsert med HPV-E7 eller mesothelin-avledet peptid som målceller. Som vist i figur 4A, splenocytter fra anti-PD-1 /CD137-behandlede mus viste cytotoksisk aktivitet på EL4 celle pulset med mesothelin men ikke med HPV-E7 peptid. Pre-inkubasjon med CD8-antistoff undertrykte det drepende aktivitet (figur 4B). Vi konkluderer med at kombinert anti-PD-1 /CD137 mAbs fremkalte en svulst antigen-spesifikk CTL respons mediert av CD8 celler.
Mus (3 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 10 dagers tidligere ble injisert intraperitonealt to ganger med 4 dagers intervaller med 0,5 mg av anti-PD-1 /CD137 mAb. Syv dager etter den andre mAb injeksjon, sammenslått splenocytes (5 × 10
6) fra 3 mus ble inkubert med 5 × 10
5 UV-bestrålt ID8 celler for 4 dager. De resulterende Splenocyttene ble deretter evaluert med hensyn til antigen-spesifikk CTL-aktivitet av CytoTox 96 Ikke-radioaktiv cytotoksisitet ved benyttelse EL4-celler pulsert med H-2db begrenset mesothelin eller HPV-E7 peptid som målceller (A). Den drepende aktivitet ble også undersøkt i nærvær av anti-CD4, anti-CD8 eller kontroll-antistoff (B). Data ble uttrykt som M ± SEM av triplikate brønner.
Lokale Th1 type immunrespons fremmet av anti-CD137 /PD-1 mAbs
For å analysere endringen i den lokale immunceller, mus med 10-dagers etablert ID8 tumor ble behandlet med enten enkel eller kombinert anti-PD-1 /CD137 mAb og deres peritoneale LAVAGES ble høstet 7 dager etter den siste injeksjonen mAb. Bekrefter våre tidligere funn [27], behandling av anti-PD-1 /CD137 mAbs indusert betydelig økt infiltrasjon av CD3
+ (p 0,01) og CD8
+ (p 0,01) celler samt redusert infiltrasjon av CD19
+ (p 0,001) celler sammenlignet med enten kontroll eller enkel mAb behandling (figur 5A). Videre analyse av CD44 og CD62L uttrykk viste at de fleste av CD4
+ og CD8
+ T-celler fra anti-PD-1 /CD137 mAbs behandlede mus var CD44
+ CD62L
– effektor /minne T celler og deres prosenter var mye høyere (p 0,01) enn det fra kontrollen eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 5B); representative dotplots er vist i figur S1. Vi bekreftet også reduserte nivåer av tregs og MDSCs som tidligere rapportert (data ikke vist, ref 27).
Mus (3 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 × 10
6 ID8 celler 10 dagers tidligere ble injisert intraperitonealt to ganger med 4 dagers intervaller med 0,5 mg av kontroll, anti-CD137, anti-PD-1 eller anti-PD-1 /CD137 mAb. To uker senere ble peritoneal lavage fra behandlede mus analysert ved strømningscytometri for den prosentvise og fenotypen av peritoneal lymfocytter. Prosentene av CD3
+, CD4
+, CD8
+ og CD19
+ lymfocytter i peritoneal lavage og CD44
+ CD62L
– effektor /minnecellene i CD4
+ og CD8
+ T-celler er vist i (A) og (B) respektivt. Prosentandelen av PD-1
+ TIM-3
+ og PD-1
-TIM-3
+ celler i peritoneal CD4
+ og CD8
+ T-celler er vist i (C) med representative dotplots i fig S2. Data er presentert som M ± SEM fra 3 mus i hver gruppe og er representative for 2 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001, PD-1 eller CD137 mAb sammenlignet med kontroll mAb, PD-1 /CD137 mAb sammenlignet med kontroll og enkelt mAb.
Enkelt CD137 mAb behandlet mus viste også økt infiltrasjon av CD3
+ (p 0,05), CD8
+ (p 0,05) og CD44
+ CD62L
– effektor /minne CD8
+ T (p 0,05) celler i bukhulen, selv om det var ineffektiv i å forlenge total overlevelse (figur 1D). For å utforske mekanismene bak svikt i tumor beskyttelse indusert av anti-CD137 mAb alene, undersøkte vi uttrykket av PD-1 og immun regulator T-celle immunoglobulin mucin (TIM-3) co-hemmende molekyler på T-celler, som har blitt rapportert å være nært knyttet til funksjonell utmattelse av T-celler [36,37]. Som vist i figur 5C, anti-CD137 mAb oppregulert ekspresjon av PD-1 og TIM-3 på peritoneal CD4
+ og CD8
+ T-celler og enkelt anti-PD-1 mAb hadde liten effekt på TIM-3 ekspresjon, selv om det svekkede ekspresjon av PD-1 på CD8
+ T-celler sammenlignet med kontrollen mAb. Spesielt, samtidig PD-1 blokade vesentlig hindret oppregulering av PD-1 og TIM-3 på T-celler indusert ved aktivering CD137; Representative dotplots er vist i (fig S2). I samsvar med den oppregulering av PD-1 og TIM-3, peritoneal-T-celler isolert fra anti-CD137 mAb behandlede mus produserte lavere nivåer av IL-2 og IFN-γ (figur S3).
Langvarig antitumor effekt indusert av kombinert anti-CD137 /PD-1 mAbs og cisplatin
Tidligere studier har rapportert at anti-CD137 mAb synergizes med cisplatin, en vanlig brukt kjemoterapeutisk stoff for eggstokkreft kreft, for å indusere regresjon av muse-CT-26 colon cancer i 60% av musene [38]. For å utforske effekten av anti-PD-1 /CD137 mAbs pluss cisplatin i ID8 eggstokkreft modell, vi først behandlet tumorbærende mus med intraperitonealt injeksjon av en dose av cisplatin fulgt av 2 doser av anti-PD-1 /CD137 mAb i 4 dager intervall. Som vist i figur 6A, kombinert anti-PD-1 /CD137 /cisplatin behandling produserte en signifikant antitumoreffekt sammenlignet med enkelt mAb, begge mAbs eller cisplatin alene, noe som resulterer i den langsiktige overlevelse på 80% (8 mus fra 10 ) mus; Det var ingen overlevelse nytte av cisplatin alene eller kombinert med enten anti-PD-1 eller anti-CD137 mAb. Vi oppnådde tilsvarende resultater fra en gjentatt eksperiment. Fjerning av CD8
+ T-celler fullstendig avskaffet antitumoreffekt (figur 6B), noe som viser en sentral rolle av disse cellene i tumor beskyttelse. De langsiktige overlevende utviklet en systemisk immunrespons med minne og tumor-spesifisitet som demonstrert av deres motstand mot å utfordre med ID8 celler, men ikke til å utfordre med antigenically urelaterte TC1 celler (figur 6C). Control, naive mus bukket under for å utfordre med enten ID8 eller TC1 celler som hadde lignende vekstrater (Figur 6D).
Mus (10 /gruppe) transplantert intraperitonealt med 3 x 10
6 ID8 celler 10 dager tidligere ble injisert intraperitonealt med to doser av kontroll, anti-PD-1, anti-CD137 eller anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg per dose per mus) med 4 dagers intervaller med eller uten samtidig administrering av cisplatin (10 mg /kg) ved den første behandling og deres overlevelse ble evaluert (A). Mus (10 /gruppe) behandlet med kombinert anti-PD-1 /CD137 /cisplatin ble tømt for lymfocytt-delmengdene etter injeksjon av anti-CD4 (0,2 mg /mus), anti-CD8 (0,2 mg /mus), anti-NK1. 1 (0,1 mg /mus) eller kontroll mAb (0.2 mg /mus) 48 og 72 timer før den første behandling og hver 3-4 dager deretter for varigheten av forsøkene. Ubehandlede tumorbærende mus var som negative kontroller (UNT gruppe).
