Abstract
HER2 er overuttrykt i 15-20% av brystkreft. Økt forekomst av HER2 er kjent for å redusere apoptose, men de underliggende mekanismene for denne foreningen fortsatt uklare. For å belyse de mekanismer for HER2-mediert overlevelse, undersøkte vi forholdet mellom HER2 og p53 oppregulert modulator av apoptose (PUMA), en potent induser apoptose. Våre resultater viste at HER2 samhandler med Puma, som var uavhengig av HER2 aktivering. I tillegg observerte vi at HER2 samhandlet med PUMA både mitokondrie og ikke-mitokondrielle avdelinger. Vi neste undersøkt om HER2 phosphorylates PUMA. Spesielt, har PUMA tyrosinfosforylering aldri blitt rapportert. Ved hjelp av en intracellulær analysen, fant vi PUMA å være fosforylert i brystkreftceller med aktivert HER2. Via cellefritt HER2 kinase analysen, observerte vi at PUMA var direkte fosforylert av HER2. Aktivering av HER2 redusert PUMA protein halveringstid. For å identifisere hvilke av de tre tyrosinene innenfor PUMA er målrettet av HER2, genererte vi tre PUMA non-fosforylering mutanter hver med en enkelt Tyr → Phe substitusjon. Resultatene viste at hver PUMA enkelt mutant hadde mistet noen, men ikke alle fosforylering av HER2 indikerer at HER2 er rettet mot alle tre tyrosinene. Derfor opprettet vi et ekstra PUMA mutant med alle tre tyrosinene muterte (TM-PUMA) som ikke kunne fosforyleres av HER2. Viktigere var TM-PUMA funnet å ha en lengre halveringstid enn PUMA. En invers assosiasjon ble observert mellom HER2 og PUMA i 93 invasiv brystkreft prøver. Vi har videre funnet at TM-Puma undertrykket vekst av brystkreftceller i større grad enn Puma. Også TM-PUMA hadde en sterkere tilbøyelighet til å indusere apoptose enn PUMA. Sammen våre resultater viser for første gang, at Puma kan være fosforylert tyrosin og at HER2-mediert fosforylering destabiliserer Puma protein. HER2-Puma samspill representerer en ny mekanisme ved hvilken Puma er regulert, og en ny molekylær basis for HER2-mediert vekst og overlevelse av kreftceller
relasjon:. Carpenter RL, Han W, Paw I, Lo HW ( 2013) HER2 fosforylerer og destabiliserer Pro-apoptotiske PUMA, Fører til antagonized apoptose i kreftceller. PLoS ONE 8 (11): e78836. doi: 10,1371 /journal.pone.0078836
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 15 august 2013; Godkjent: 24 september 2013; Publisert: 13.11.2013
Copyright: © 2013 Carpenter et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health stipend K01-CA118423, og W81XWH-11-1-0600 fra United States Department of Defense, Pediatric hjernesvulst Foundation, Beez Foundation og egenutført Divisjon for kirurgiske fag Dani P. Bolognesi, Ph.D. Award og Clarence Gardner, Ph.D. Award (til H-WL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Brystkreftfrekvensen faller, men det er fortsatt et betydelig folkehelsetrussel. Nåværende estimater indikerer at det vil være 300.000 nye tilfeller og 40.000 dødsfall fra brystkreft i 2013 [1]. Det er anslått at det vil bli flere nye brystkrefttilfeller hos kvinner enn noen annen type kreft i 2013 [1]. HER2 er overuttrykt i 15-20% av menneskelige brystkreft og dette overekspresjon er assosiert med dårlig pasientutfall blant annet redusert total overlevelse, økt svulst tilbakefall, og mer aggressiv sykdom [2] – [4]. HER2-aktivering skjer ved heterodimerisering med andre ErbB-familien reseptorer, slik som heregulin binding til HER3 det vil da heterodimerize med HER2 for å aktivere nedstrøms HER2 trasé [5].
Overekspresjon av HER2 er kjent for å redusere apoptose. Pro-apoptotiske og anti-apoptotiske Bcl-2 proteiner kontrollere indre apoptotiske sti på mitokondriene. Positive korrelasjoner er påvist mellom HER2 ekspresjon og anti-apoptotiske proteiner som Bcl-xL, Mcl-1, og Bcl-2 [6] – [8]. I tillegg tvunget ekspresjon av HER2 som skyldes økt protein nivåer av anti-apoptotiske proteiner som Bcl-2 og Bcl-xL mens hemming av HER2 redusert Mcl-1 og økt ekspresjon Bax [6], [7], [9]. HER2 kan også aktivere PI3K-AKT og ERK1 /2-signalisering, som kan regulere apoptose ved å kontrollere genekspresjon, slik som oppregulering av Survivin, og post-translasjonell regulering, slik som fosforylering og inaktivering av pro-apoptotiske Bad [10], [11 ]. HER2 regulering av apoptose har primært blitt observert å være mediert av nedstrøms signal mens direkte regulering av BCL-2 proteiner ved HER2 ikke er vurdert.
PUMA
genet ble først identifisert i 2001 [ ,,,0],12], [13] som en skjerm for transkripsjons mål av p53.
BBC3
genet ble identifisert kort tid etter av gjær to-hybrid screening og cDNA for dette genet matchet som PUMA [14]. Denne senere oppdagelsen av
BBC3
genet også fastslått at PUMA uttrykk kan være forårsaket av apoptotiske stimuli uavhengig av p53 [14]. Puma inneholder to funksjonelle domener på den C-terminale enden, den BH3 domene og mitokondrielle lokaliseringssignal (MLS) [15], [16]. Funksjonell aktivitet av PUMA er initiert av protein targeting til den ytre mitokondriemembranen hvor PUMA samhandler med anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer hemme deres undertrykkelse av Bax og Bak [12], [17]. Hemming av anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer fører til aktivering av pro-apoptotiske proteiner Bax /Bak utløsende mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP) og frigjøring av cytokrom C [12], [16], [17]. Cytoplasmatiske cytokrom C til slutt danner apoptosome som fører til aktivering av kaspaser effektor 3/9 og apoptose. Tap av Puma aktivitet har vært forbundet med flere krefttyper. Delesjon av en del av kromosom 19, der
Puma
gen befinner seg, har blitt rapportert i flere krefttyper [13], [18], [19]. I tillegg
PUMA
er et p53-induserbar genet p53 og har mutasjoner i mer enn 40% av kreft [20]. Derfor har nedsatt PUMA induksjon blitt observert med p53 mutasjon eller sletting [13], [21]. Også kreftceller med PUMA slettet har høy motstand mot p53-induserbar behandlinger som DNA-skadende midler, UV, og gamma-bestråling blant annet [19]. Imidlertid har en rekke studier har rapportert at PUMA uttrykk kan være forårsaket av p53-uavhengige mekanismer [19], [22] – [25].
En direkte kobling mellom HER2 og PUMA er ikke undersøkt. Også ukjent er om PUMA gjennomgår tyrosinfosforylering. I denne studien fant vi et nytt funn som PUMA kan fosforyleres på tyrosinrester direkte av HER2. Videre PUMA fosforylering av HER2 fører til PUMA destabilisering og celle overlevelse. Vi viser også at en PUMA mutant som ikke kan fosforylert på tyrosin rester (TM-PUMA) har en forbedret evne til å indusere apoptose. Til sammen vår studie avdekket en roman HER2 → PUMA signaliserer aksen som representerer en ny mekanisme som PUMA protein og PUMA-mediert celledød er regulert. Våre funn gir også bevis implicating PUMA nedregulering som en ny molekylære grunnlaget for HER2-mediert vekst og overlevelse.
Materialer og metoder
Celler og cellekultur
MDA-MB -453, MCF-7, BT 474-, og SK-BR3 humane brystcancercellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection, ATCC (Manassas, VA). MDA-MB-453-celler ble opprettholdt i Leibovitz L-15-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 0% karbondioksyd. MCF-7-celler ble opprettholdt i MEM-medium supplert med 10% FBS, 1 mM natrium pyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, og 10 ug /ml bovint insulin. BT-474-celler ble holdt i DMEM-medium supplert med 10% FBS. SK-BR3-celler ble opprettholdt i McCoys 5a-medium supplert med 10% FBS. MCF-7 /HER2-celler ble opprettholdt i MEM-medium supplert med 10% FBS, 1 mM natrium pyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 10 ug /ml bovint insulin, og 350 ug /mL G418.
kjemikalier og reagenser
Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri) med mindre annet er oppgitt. Cycloheximide ble kjøpt fra Amresco (Solon, OH), ble MG132 kjøpt fra Calbiochem (San Diego, CA), ble anisomycin kjøpt fra Enzo og biovitenskap (Farmingdale, New York), og Lapatinib ble kjøpt fra LC Laboratories (Woburn, MA). Tubulin, β-actin, og IgG-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma. HA antistoff ble kjøpt fra Roche (Indianapolis, IN), ble PARP-1 antistoff kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA), ble COX IV antistoff kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA), og 4G10 antistoff ble kjøpt fra Millipore ( Billerica, MA). PUMA, HER2, og fosfor-HER2 (Y1248) antistoffer ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA).
Plasmider
PHA-PUMA plasmid ble vennlig levert av Dr. Bert Vogel via Addgene plasmid 16588 [13]. Generering av enkelt mutante Pumas (Y58F-PUMA, Y152F-PUMA, og Y172F-PUMA) samt trippel mutant (Y58F /Y152F /Y172F-PUMA) ble gjort ved hjelp av en QuikChange seterettet mutagenese kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere som brukes for mutagenese var følgende: Y58F-Forward 5′-TGCCCGCTGCCTTTCTCTGCGCCCCCA-3 «, Y58F-Reverse 5′-TGGGGGCGCAGA GAAAGGCAGCGGGCA-3′, Y152F-Forward 5»-CTCAACGCACAGTTTGAGCGGCGGAGA-3 «, Y152F-Reverse 5»-TCTCCGCCGCTCAAACTGTGCGTTGAG- 3 «, Y172F-Forward 5′-TCACCTGGAGGGTCCTGTTCAATCTCATCAT-3′, og Y172F-revers 5»-ATGATGAGATTGAACAGGACCCTCCAGGGTGA-3 «. Mutasjonen ble bekreftet ved sekvensering.
Immunoutfelling /Western blotting (IP /IM)
Celler ble lysert med RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP- 40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksycholat) supplert med protease /fosfatase-hemmere, etterfulgt av sonikering og samling av supernatanten. Hele celleekstrakter ble pre-erte med 1 pg kanin IgG og 20 ul protein-A-agarose i 1 time ved 4 ° C. Ryddet lysater ble deretter inkubert med 1 pg HER2 eller Puma antistoff eller kontroll kanin IgG ved 4 ° C over natten med omrøring. Protein A-agarose ble så tilsatt og inkubert ved 4 ° C i 60 minutter med omrøring. Protein A-agarose-pellets ble oppsamlet og vasket flere ganger med RIPA-buffer ved 4 ° C. Vaskede pellets ble kokt og underkastet SDS-PAGE og immunblotting som beskrevet tidligere [26]. Fastsettelse av PUMA tyrosinfosforylering ble bestemt av immunoprecipitation fra PUMA fulgt av immunoblotting hjelp av anti-fosfor-tyrosin 4G10 Platinum antistoff (Millipore).
Cell-free HER2 kinase Analyser
Rekombinant human PUMA protein ( Origene, Rockville, MD) ble defosforylert med rekombinant humant PTP1B protein ved 30 ° C etterfulgt av PTP1B inaktivering ved 65 ° C. Defosforylert Puma ble deretter inkubert med rekombinant humant HER2-protein (Promega, Madison, WI) og ATP ved 30 ° C. Prøven ble deretter kokt og underkastet SDS-PAGE og immunblotting ved anvendelse av anti-fosfo-tyrosin 4G10 platina-antistoff (Millipore).
Immunoutfelling-kinase-analyse
Celler ble transfektert med HA-merket Puma plasmider og cellelysater ble oppsamlet som beskrevet ovenfor. Immunopresipitert ble utført med HA-antistoff som beskrevet ovenfor. Etter vaskinger ble protein A-agarose pellets defosforylert med rekombinant humant PTP1B, etterfulgt av inkubasjon med rekombinant humant HER2 som beskrevet ovenfor. Prøvene ble så kokt og underkastet SDS-PAGE og immunblotting ved anvendelse av anti-fosfo-tyrosin 4G10 platina-antistoff (Millipore).
kolonidannelse Assays
Etter transfeksjon av plasmider angitte celler ble sådd inn i seks -vel kulturplater for å bestemme forankringsavhengig vekst klonogene som vi tidligere beskrevet [27]. Etter transfeksjon ble celler også utsådd i 6-brønners plater med agarose for å bestemme forankrings-uavhengig vekst klonogene. Brønner forbelagt med et bunnlag på 0,5% agarose og celler ble sådd inn i topplaget med 0,35% agarose. Etter 2-4 uker ble kolonier med eller uten agarose farget med krystall-fiolett blå oppløsning (Sigma) i 1 time og kolonier ble tellet under et mikroskop. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Vurdering av apoptose
Celler ble transfektert med angitt plasmider, behandlet med angitte forbindelser, og høstet med trypsin /EDTA. Apoptose ble deretter bestemt ved FITC-Annexin V /propidiumjodid- deteksjon kit fra BD Pharmingen (San Jose, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en BD FACSCalibur strømningscytometer. PARP-1 cleavage ble bestemt ved hjelp av immunoblotting av cellelysater følgende angitte transfeksjon og behandling.
Fastsettelse av PUMA MITOKONDRIELLE Levels
Mitokondriefraksjonering ble utført ved hjelp av en analyse kit fra Pierce /Thermo Scientific (Rockford, IL), i henhold til produsentens instruksjoner som vi har beskrevet tidligere [26]. I korthet protein ble isolert fra mitokondrie-ekstrakt (ME) og den ikke-mitokondriell ekstrakt (NME). ME og NME ble deretter utsatt for SDS-PAGE og immunoblotting. Band intensiteter ble deretter målt ved bruk av NIH ImageJ programvare. Omfanget av PUMA mitokondrie lokalisering (mtPUMA Index) ble beregnet ved hjelp av bandet tettheter med følgende ligning:.% ME er prosent av den totale ME lastet og% NME er prosent av den totale NME lastet for immunoblotting
immunhistokjemi for klinisk tumorprøver
Lysbilder ble kjøpt fra USA Biomaks (Rockville, MD). Vurdering av HER2 intensitet (0-3 +) ble gjennomført av amerikanske Biomaks. Puma påvisning ble utført som vi tidligere beskrevet [28]. Lysbilder ble inkubert med PUMA antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Histologiske score (H-score) ble beregnet fra begge prosent positivitet (A%, A = 1-100) og intensitet (B = 0-3 +) med følgende ligning: H-Score = A × B. Chi-kvadrat analyse ble brukt for å bestemme forholdet mellom HER2 intensitet og PUMA H-Score.
Statistiske analyser
Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. Forskjeller ble bestemt via One-Way ANOVA med Tukey post-hoc test eller t-test der det er hensiktsmessig. ble utført chi-kvadrat analyse for IHC resultater. Signifikans ble satt til p. 0,05
Resultater
HER2 Fysisk Associates med PUMA
For å undersøke om HER2 har noen samspill med PUMA, vi først vurdert om HER2 kan fysisk samhandle med PUMA bruker immunoprecipitation /western blotting (IP /WB). Vi brukte SK-BR3 og BT-474 bryst-kreftceller som overuttrykker de HER2 grunn av HER2 genamplifisering. Vi immunopresipitert HER2 fra disse cellene, og fant at Puma kunne påvises med HER2 trekke ned i begge cellelinjer (figur 1a). Dette indikerte en roman opplever at HER2 fysisk samhandler med PUMA. Det er verdt å merke seg at vi ikke oppdager et samspill mellom HER2 og Bad eller BMF, andre BH3-bare proteiner, noe som tyder på samspillet med HER2 er spesifikk for PUMA (Figur 1a). Vi neste vurdert om HER2-kinase aktivitet var nødvendig for samspillet med PUMA. For dette ble cellene behandlet med eller uten heregulin som et middel for aktivering av HER2-kinase-aktivitet. Av notatet, har HER2 ikke har åpenbare ligander og er avhengig av binding til heregulin-bundet HER3 for aktivering; HER3 har ikke kinase-aktivitet [5]. Som vist i figur 1b, ble HER2 aktivert ved heregulin, men dette ikke vesentlig endrer interaksjonen av HER2 med Puma. Cellene ble deretter behandlet med eller uten lapatinib, som hemmer HER2-aktivering [29]. Lapatinib redusert HER2 aktivisering, men også ikke påvirke samspillet mellom HER2 og PUMA (Figur 1c). Til sammen indikerer disse data at HER2 fysisk kan interagere med Puma og denne interaksjonen er ikke avhengig kinaseaktivitet av HER2.
a) SKBR3 og BT-474 celler ble lysert og totalt protein underkastet immunoutfelling med enten kontroll IgG eller HER2-antistoffer etterfulgt av immunoblotting med angitte antistoffer. Helcellelysater ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. b) MDA-MB-453-celler ble inkubert i serumfritt medium i 16 timer, etterfulgt av behandling med heregulin (100 ng /ml) i 30 minutter. Cellene ble deretter lysert og totalt protein ble underkastet immunoutfelling med enten kontroll IgG eller HER2-antistoffer, etterfulgt av immunblotting med angitte antistoffer. Helcellelysater ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. c) MDA-MB-453-celler ble inkubert med lapatinibs (10 uM) i to timer. Cellene ble deretter lysert og totalt protein ble underkastet immunoutfelling med enten kontroll IgG eller HER2-antistoffer, etterfulgt av immunblotting med angitte antistoffer. Helcellelysater ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. d) mitokondrielle (ME) og ikke-mitokondriell ekstrakt (NME) ble isolert fra BT-474-celler og begge ekstrakter ble underkastet immunoutfelling med angitte antistoffer. ME og NME ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer.
PUMA lokaliserer primært til mitokondriene som den inneholder en mitokondrie lokaliseringssignal [12], [16] men PUMA har også blitt observert å fremme apoptose uten mitokondrie lokalisering [15]. I tillegg er HER2 primært lokalisert i plasmamembranen, men har nylig blitt funnet å lokalisere til mitokondriene, hvor den påvirker cellulær metabolisme og fremmer motstand av trastuzumab [30]. Derfor vi neste bestemmes hvor PUMA og HER2 fysisk samhandle. Mitokondriell (ME) og ikke-mitokondrie ekstrakter (NME) ble isolert fra BT-474-celler og immunblotting for α-tubulin og COX IV bekreftet at det var effektiv isolering av mitokondrielle og ikke-mitokondrielle fraksjoner (figur 1d). Figur 1d viser at PUMA og HER2 ble påvist i både ME og NME bekrefter tidligere observasjoner [30]. Til tross for lasting av like mengder protein (60 mikrogram), det syntes å være større PUMA og HER2 nivåer i ME enn NME. Dette er imidlertid tydelig ubalanse på grunn av det faktum at 60 mikrogram er 80% av ME høstet, men bare 2% av NME høstet. For å bestemme samspillet mellom HER2 og PUMA, ble HER2 immunopresipitert fra like mengder av ME og NME fulgt av immunoblotting. Vi observerte samspillet mellom HER2 og PUMA i både ME og NME (figur 1d). Disse er de første data som indikerer HER2 fysisk kommuniserer med Puma og at denne interaksjon forekommer i og ut av mitokondrie rommet.
HER2 Direkte fosforylerer Puma
Etter deteksjon av en direkte interaksjon mellom HER2 og Puma , neste fastsatte vi om PUMA kan bli fosforylert av HER2. Så langt vi kjenner til, PUMA tyrosinfosforylering har ikke tidligere blitt rapportert. Hvis du først vurdere om PUMA kan tyrosin fosforyleres intracellulært, sultet vi HER2-overuttrykk celler i 16 timer og deretter behandlet cellene med eller uten heregulin å aktivere HER2. Vi utsettes cellelysatene til IP /WB ved hjelp av en PUMA antistoff for IP og immunoblottet med anti-fosfo-tyrosin antistoffer. Som vist i figur 2a, er tyrosin-fosforylerte Puma lett detektert i heregulin-stimulerte celler som uttrykte aktivert fosforylert HER2 (p-HER2). Men MCF-7 celler som uttrykker lave nivåer av HER2, ikke svare på heregulin og viste ikke signifikant PUMA tyrosinfosforylering (figur 2b). I motsetning til dette, MCF-7-celler med stabil, tvunget til økt forekomst av HER2 (MCF-7 /HER2-celler) viser Puma tyrosinfosforylering i respons til heregulin (figur 2c). Disse resultatene er de første til å vise at PUMA kan fosforyleres på tyrosinrester og dette skjedde med HER2 stimulering av heregulin.
MDA-MB-453 (a), eller MCF-7 (b), eller MCF- 7 /HER2 (c) cellene ble inkubert i serumfritt medium i 16 timer, etterfulgt av behandling med heregulin (100 ng /ml) i 30 min. Cellene ble deretter lysert og totalt protein ble underkastet immunoutfelling med enten kontroll IgG eller Puma antistoffer etterfulgt av immunblotting med angitte antistoffer. Helcellelysater ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. Tyrosin-fosforylert PUMA ble oppdaget med 4G10 phospho-tyrosin antistoffer. Rekombinant Puma protein ble underkastet HER2 kinaseanalyse (som angitt i Fremgangsmåter Materialer) i nærvær eller fravær av lapatinibs (d) eller med økende nivåer av rekombinant protein Puma (e). f) Rekombinant HER2 ble immunoutfelt i nærvær eller fravær av renset Puma, etterfulgt av immunblotting med angitte antistoffer.
ved ønsket å bestemme hvorvidt HER2 kan direkte å fosforylere Puma. For å oppnå dette har vi brukt kommersielt tilgjengelige rensede rekombinante Puma og HER2-proteiner for å utføre en cellefri kinase assay. Som vist på figur 2d, Puma var sterkt fosforylert på tyrosin-rester i nærvær av HER2. Som forventet, HER2 gikk auto-fosforylering. I nærvær av lapatinib, ble HER2-fosforylering tapt, og følgelig var det ingen tyrosinfosforylering av Puma. Vi observerte også en dose-respons økning i tyrosin-fosforylering av Puma med økende nivåer av Puma protein i nærvær av HER2 (figur 2e). Ved hjelp av IP-WB, vi viser videre at nedtrekk av rekombinant HER2 også resulterer i rullegardin av renset Puma (figur 2f) som bekrefter HER2 forbinder direkte med Puma i sammenheng med den cellefrie kinase assay. Disse resultatene viser for første gang at PUMA kan fosforyleres på tyrosinrester direkte av HER2.
HER2 phosphorylates PUMA på Three tyrosinrester
Et søk av menneske PUMA proteinsekvens avslørte tilstedeværelsen av tre tyrosinrester, nemlig Y58, Y152, og Y172 (figur 3a). Alle tre tyrosin-rester i Puma ble funnet å være konservert i flere pattedyr-arter (figur 3a), indikerer disse rester er potensielt funksjonelt viktig. For å bestemme hvilke spesifikke Puma tyrosinrest (e) som fosforylerer HER2, gjennomførte vi seterettet mutagenese for å mutere hvert tyrosin (Tyr, Y) til fenylalanin (Phe, F) ved anvendelse av en ekspresjonsvektor som bærer HA-merket Puma som templat. Fenylalanin har den samme som R-gruppen tyrosine uten oksygen til å binde fosfat og kan således ikke bli fosforylert. Disse Puma mutanter (Y58F-, Y152F-, Y172F-PUMA), sammen med vill-type Puma (WT-PUMA), ble uttrykt i celler, immunopresipitert ved hjelp av en HA-tag antistoff, og utsatt for HER2-kinase analysen. Som vist i figur 3B, ble WT-Puma sterkt fosforylert av rekombinant HER2 mens alle mutanter viste en lav grad av fosforylering, noe som indikerer at alle tre tyrosiner kan fosforyleres. For å fullt ut forstå de biologiske konsekvensene av PUMA tyrosinfosforylering vi opprettet en ekstra PUMA mutant, en trippel mutant PUMA (TM-PUMA), der alle tre tyrosinene (Y58, Y152, og Y172) ble mutert til fenylalanin. Ved hjelp av den cellefrie HER2-kinase-analyse (figur 3b), viste WT-Puma fosfo-tyrosin-bånd, mens ingen ble detektert med TM-Puma, som indikerer TM-Puma ikke er fosforylert av HER2. For å utelukke muligheten for at TM-PUMA ikke kan være tyrosin-fosforylert på grunn av sin manglende evne til å samhandle med HER2, neste fastsatte vi om TM-PUMA kan fysisk samhandle med HER2. IP /WB med en HER2-antistoff (figur 3c) viste at HER2 interaksjon med både WT-Puma og TM-Puma likt som indikerer mangel på TM-PUMA fosforylering av HER2 er ikke på grunn av redusert interaksjon mellom de to proteiner. Tatt sammen resultatene i figurene 2 og 3 er den første bevis som viser at Puma gjennomgår tyrosinfosforylering, og at HER2 direkte kan fosforylere Puma.
a) Lineær representasjon av Puma protein med hvert tyrosin, BH3 domene, og mitokondrie lokalisering signal (MLS) domene indikert (øvre panel). Tyrosinene 58, 152, og 172 i PUMA protein er bevart over flere pattedyrarter, som er angitt (nedre panel). b) Wild-type HA-merket PUMA protein ble mutert slik at hver tyrosin ble endret til fenylalanin (Y58F, Y152F, Y172F) eller alle tyrosinene ble mutert (trippel mutant: TM). MCF-7-celler ble transfektert med WT-PUMA eller hver Puma mutant og helt cellelysat ble underkastet immunoutfelling med enten kontroll IgG eller HA-rettede antistoffer. Etter immunoutfelling ble produktet underkastet HER2 kinaseanalyse som er angitt i avsnittet Materialer og metoder. c) WT-PUMA eller TM-PUMA ble transfektert inn i MDA-MB-453 celler. Celler ble lysert og totalt protein underkastet immunoutfelling og immunblotting med angitte antistoffer. Helcellelysater ble også utsatt for immunblotting med angitte antistoffer.
TM-PUMA har en lengre halveringstid enn WT-PUMA
siden ønsket å finne ut om PUMA fosforylering av HER2 endret PUMA stabilitet. For å oppnå dette, vurdert vi protein halveringstiden ved bruk av sykloheksimid, som inhiberer proteinsyntese som tillater påvisning av når proteinene brytes ned. Cycloheximide er en vanlig metode for å bestemme proteinstabilitet som flere relevante papirer har brukt denne metoden i de senere år [31] – [34]. Således ble HER2-overuttrykkende MDA-MB-453-celler behandlet med cykloheksimid i opp til 16 timer i nærvær eller fravær av heregulin å aktivere HER2. Som vist i figur 4a, heregulin indusert aktivering av HER2 i disse cellene, og førte også til forbedret Puma proteinnedbrytingen. For ytterligere å undersøke stabiliteten av PUMA, vurdert vi PUMA halveringstid ved hjelp av MCF-7 celler, som har lav HER2 uttrykk, eller MCF-7 /HER2-celler, som har stabil overekspresjon av HER2. Figur 4b viser at Puma nedbrytes hurtigere i MCF-7 /HER2-celler sammenlignet med MCF-7-celler som indikerer økt forekomst av HER2 reduserer Puma stabilitet. Vi neste bestemmes om halveringstiden for TM-Puma, som ikke kan bli fosforylert tyrosin, skiller seg fra WT-Puma. Cellene ble transfektert med enten WT-PUMA eller TM-PUMA fulgt av cycloheximide behandling. Som vist i figur 4c, WT-Puma nivåer betydelig redusert på 16 timer, mens TM-Puma nivåer ikke vesentlig avta. Etter kvantifisering av PUMA båndssignaler og plotte dem over tid, fant vi at halveringstiden for WT-PUMA var ca 7 timer mens det av TM-PUMA var lengre enn 16 timer. Det er tidligere vist at PUMA kan være rettet mot proteasome for degradering [31]. For å finne ut om WT-PUMA eller TM-PUMA er regulert av proteasome, utførte vi halveringstiden eksperiment i nærvær av proteasominhibitor MG132. Som vist i figur 4d, observerte vi at WT-Puma halveringstiden kan forlenges med hemmingen av proteasomet bekrefter tidligere resultater [31]. Disse resultatene tyder på HER2-mediert fosforylering reduserer halveringstiden til Puma.
a) MDA-MB-453-celler ble inkubert i serumfritt medium i 16 timer etterfulgt av behandling med heregulin (100 ng /ml) og cykloheksimid (10 ug /ml). Hele cellelysat ble utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. b) MCF-7 MCF-7 og /HER2-celler ble inkubert i serumfritt medium i 16 timer, etterfulgt av behandling med heregulin (100 ng /ml) og cykloheksimid (10 ug /ml). Hele cellelysat ble utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. C, D) MCF-7-celler ble transfektert med HER2 og enten WT-Puma eller TM-Puma. Celler ble inkubert i serumfritt medium i 16 timer, etterfulgt av behandling med heregulin (100 ng /ml) og cykloheksimid (10 ug /ml) uten (c) eller med MG132 (10 pM) ko-behandling (d). Hele cellelysat ble utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. e) MCF-7-celler ble transfektert med WT-PUMA eller TM-Puma og mitokondrier ble isolert. ME og NME ble utsatt for immunblotting med angitte antistoffer. f) Chi-kvadrat tabeller for analyse av kliniske kreftprøver. Med-High HER2 = 2-3 +. Lav HER2 = 0-1 +. g) Prøve IHC bilder av kliniske kreftprøver for High HER2 + Lav PUMA (case 1) og lav HER2 + Høy PUMA (sak 2).
neste spurt om TM-PUMA beholder evnen til å gjennomgå translocalization til mitokondriene hvor PUMA fremmer apoptose. Dermed ble WT-PUMA eller TM-PUMA transfektert inn i cellene etterfulgt av isolering av ME og NME med påfølgende immunoblotting. Som Figur 4e viser, TM-Puma beholdt evnen til å gjennomgå mitokondrie lokalisering. Videre har vi observert større grad av TM-PUMA sammenlignet med WT-PUMA i ME, som ble bekreftet av beregning av mtPUMA Index (se Materialer og metoder) som resulterer i 3,3 ganger mer TM-PUMA i mitokondriene enn WT-PUMA. En større TM-Puma nivå i mitokondriene er sannsynlig et resultat av økt proteinstabilitet av TM-Puma protein i nærvær av HER2. Sammen utgjør disse dataene viser at PUMA protein stabilitet er redusert med HER2-aktivering og blokkerer PUMA tyrosinfosforylering forbedrer PUMA stabilitet og resulterer i større mitokondrie nivåer av PUMA.
For å vurdere om dette forholdet opprettholdes
in vivo
utførte vi immunhistokjemi på et sett av kliniske kreftprøver (n = 93) for å oppdage HER2 og PUMA. Etter å score, fordelt vi prøvene til lav HER2 (0-1 + intensitet) eller medium til høy HER2 (2-3 + intensitet). PUMA ble delt inn i høy PUMA (enten ≥150 H-Score eller ≥100 H-Score) eller lav PUMA (enten 150 H-Score eller 100 H-Score). Vi utførte en chi-kvadrat analyse for å bestemme forholdet mellom HER2 og PUMA uttrykk (figur 4f). Den chi-kvadrat analyse ved hjelp av enten PUMA barriere (150 H-Score eller 100 H-Score) resulterte i statistisk signifikans (p = 0,045 og p = 0,027, henholdsvis). Disse dataene antyder vev med høy HER2 uttrykk har en tendens til å ha lavere PUMA uttrykk
in vivo plakater (figur 4g) støtter våre data fra cellelinjer som HER2 kan nedregulere PUMA uttrykk.
TM-PUMA har en sterkere effekt enn WT-PUMA på Undertrykke klonogene Vekst
Figur 4 indikerte at TM-PUMA hadde større protein stabilitet og høyere proteinnivåer i mitokondriene, noe som kan tyde på at TM-PUMA har en forbedret evne til å fremme apoptose . For å undersøke effekten av TM-PUMA på celle levedyktighet, uttrykte vi en tom vektor, WT-PUMA eller TM-PUMA i to forskjellige HER2-overuttrykk brystkreft cellelinjer, nemlig BT-474 (figur 5e) og MDA-MB-453 (figur 5f) celler, og overvåket den evnen som disse celler til å danne kolonier.
