Abstract
De uttrykk nivåer og regulatoriske roller MIR-497 i kreft i bukspyttkjertelen er uklare. Den kliniske verdien av plasma insulin-like growth factor 1 reseptor (IGF-1R) i bukspyttkjertel kreft har ikke blitt undersøkt. I denne studien, viste vi at MIR-497 var signifikant nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev. Oppregulering av MIR-497 i BxPC-3 og ASPC-1 bukspyttkjertelkreft cellelinjer hemmet spredning, økt apoptose, re-sensibiliserte celler til gemcitabin og undertrykte IGF-1R og p-AKT uttrykk gjennom direkte nedregulering av IGF-1R protein uttrykk. Motsatte effekter ble observert etter nedregulering av MIR-497. Plasma IGF-1R nivåer hos pasienter med bukspyttkjertelkreft økt betydelig, sammenlignet med pasienter med kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer og bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster (
P = 0,006
,
P = 0,018
og
P = 0.004
, henholdsvis), og vises mulige verdier for å skille bukspyttkjertelen lesjoner. Men nivåene i bukspyttkjertelen kreftpasienter sammenlignes med resultatene hos friske frivillige (
P = 0,095
). Svulsten steder og TNM stadium ble assosiert med plasma IGF-1R nivåer (
P = 0,013 Hotell og
P = 0,01
, henholdsvis). Det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse mellom høye og lave IGF-1R uttrykk grupper. I konklusjonen, viste vi at MIR-497 svekket malignitet av kreft i bukspyttkjertelen celler og fremmet følsomheten celler til gemcitabin ved direkte nedregulering av IGF-1R uttrykk. Plasma IGF-1R vises en potensiell verdi for å skille bukspyttkjertelen lesjoner og kan bli en ny biomarkør for guiding TNM stadium av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Xu JW, Wang TX, du L, Zheng LF, Shu H, Zhang TP et al. (2014) Insulin-like Growth Factor 1 reseptor (IGF-1R) som et mål av MiR-497 og Plasma IGF-1R nivåer forbundet med TNM stadium av kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10,1371 /journal.pone.0092847
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 27 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 81272484, 81141027), Beijing Natural Science Foundation (No. 7,132,179), Beijing Municipal Natural Science Foundation (7.100.003) og Forsknings Special Fund for offentlig velferd Industry of Health ( 201202007). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en aggressiv og ødeleggende sykdom. PDAC har en ekstremt dårlig prognose med en 5-års overlevelse lavere enn 5% [1]. Selv om mekanismene for bukspyttkjertelkreftutvikling, har de nye markører for tidlig oppdagelse, og de nye terapeutiske strategier vært mye undersøkt [2], [3], [4], total overlevelse har ikke blitt bedre de siste 80 årene [5] . De molekylære mekanismer av progresjon av PDAC, inkludert proliferasjon, apoptose, medikamentresistens, uklare.
mirnas er korte ikke-kodende RNA, som kan inhibere translasjon av budbringer-RNA (mRNA) i protein ved binding til 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR). Mirnas kan fungere som onkogener eller tumor dempere i reguleringen av kreftutvikling, metastatisk kapasitet og narkotika motstand [6]. Nedregulering av MIR-497 har blitt observert i bryst, tykk- og livmorhalskreft [7], [8], [9]. Men det er ingen rapport om Mir-497 uttrykk nivåer i kreft i bukspyttkjertelen i dag. Insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R) ble identifisert som et mål for MIR-497. Nedregulering av MIR-497 bidrar til malignitet av tykktarmskreft og livmorhalskreft ved oppregulering IGF-1R [8], [9]. Men de regulatoriske roller og mekanismer for MIR-497 i kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt uklart.
IGF-1R er en tyrosin kinase reseptor, som innebærer i reguleringen av spredning, apoptose, differensiering og malign transformasjon av kreftceller [10]. Oppregulering av IGF-1R i humane PDAC vev har blitt rapportert [11] og medarbeidere med høyere svulst klasse og dårlig overlevelse [12]. Likevel plasma IGF-1R nivåer i bukspyttkjertelen kreftpasienter ble ikke påvist i tidligere studier. De kliniske verdier av plasma IGF-1R i bukspyttkjertelkreft er ukjent.
I denne studien fant vi at MIR-497 var signifikant nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev. Oppregulering av MIR-497 hemmet spredning, økt apoptose og fremmet følsomhet for gemcitabin gjennom direkte downregulating IGF-1R uttrykk i PDAC kreftceller
in vitro
. Vi viste også at nivåene av plasma IGF-1R i bukspyttkjertelen kreftpasienter sammenlignes med resultatene hos friske frivillige, men høyere enn hos pasienter med kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer og bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster, og viste verdier for å skille bukspyttkjertelen lesjoner. Den tumor steder og TNM stadium var assosiert med plasma IGF-1R nivåer. Det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse tid mellom høye og lave IGF-1R uttrykk grupper.
Metoder
Etikk uttalelse
Studiene ble utført i samsvar med etikk godkjenning fra Institutional Review Boards of Peking Union Medical College Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
Oppdager uttrykk for MIR-497 ved in situ hybridisering (ISH)
10 formalinfikserte, parafininnstøpte kreft i bukspyttkjertelen prøver og matchet tumor- tilstøtende vev ble oppnådd og gjort til microarray. Uttrykket nivåer av MIR-497 i vev ble oppdaget ved hjelp miRCURY LNA deteksjon probe for MIR-497 (Exiqon, Vedbæk, Danmark, produktnummer: 38256-15). ISH ble utført som følgende beskrivelse. I korthet, ble objektglassene inkubert ved 37 ° C i 30 minutter, deparaffinized i xylen, og rehydrert med gradert alkohol vasker. Da objektglass ble plassert i 4% paraformaldehyd i 20 min i et avtrekksskap, og deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) tre ganger. Glassene ble deretter behandlet med 15 ug /ml proteinase K i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter vasket lysbildene med PBS og fikset dem i 4% paraformaldehyde i 15 minutter etter det. Etter skylling, ble objektglassene pre-hybridisert med hybridiseringsbuffer i 1 time ved værelses 50 ° C og deretter hybridisert over natten ved 4 ° C i en hybridiseringsbuffer inneholdende proben. Strenge vaskinger ble utført ved 50 ° C i 20 minutter, og deretter ble objektglassene inkubert i en blokkerende oppløsning i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble objektglassene inkubert i blokkeringsløsning med alkalisk fosfatase-konjugert anti-DIG-Fab-fragment over natten ved 4 ° C. Den kolorimetriske påvisningsreaksjonen ble utført ved anvendelse av NBT /BCIP kit (ThermoFisher Scientific) i henhold til produsentens protokoll. ISH Resultatene ble registrert som prosentandelen av positive celler.
Cell kultur og reagenser
BxPC-3 og ASPC-1 PDAC cellelinjer ble vennlig levert av professor Helmut Freiss (Universitetet i Heidelberg, Tyskland ), som oppnådd fra American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. PDAC celler ble dyrket i en fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint plasma (FBS, Hyclone). De primære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, inkludert IGF-I Receptor β (D23H3) XP Rabbit mAb (# 9750), β-aktin (13E5) Rabbit mAb (# 4970), Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XPRabbit mAb (# 4060), Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (# 4685), Caspase-3 antistoff (# 9662) og PARP antistoff (# 9542).
Mirna transfeksjon
MiR-497 etterligner (5′- CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 «, 5′-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′), etterligner kontroll (5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′), MIR-497 inhibitor (5»- ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 «), og inhibitor-kontroll (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3») ble syntetisert ved Genepharma (Shanghai, Kina). Mirnas på 50-100 nM ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll.
Cellular RNA ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) assay
Celler ble transfektert i 6-brønns plater. Etter 48 timers transfeksjon, ble total RNA ekstrahert ved hjelp av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. For IGF-1R kvantitativ analyse, ble total-RNA reverstranskribert ved hjelp av revers transkripsjon kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn Master Mix (Takara, Japan). GAPDH ble servert som endogen kontroll
IGF-1R Forward primer. 5′-TCTGGCTTGATTGGTCTGGC-3 «
Reverse primer: 5′-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3′
GAPDH Forward primer: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 «, etter
Reverse primer: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′
for MIR-497 kvantitative analysen ble TaqMan miRNA analysen brukes i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems). U6 ble anvendt som en endogen kontroll. Brett endringer ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metode.
spredningsanalyse
In vitro
spredning ble analysert ved hjelp av en celletall kit (CCK-8). BxPC-3 celler og ASPC-1 celler ble transfektert i 6-brønners plater (5 × 10
5cells /brønn). Etter 24 timer ble cellene trypsinert og sådd på nytt i 96-brønn plater (1000 celler /brønn). 10 ul /brønn CCK-8-reagens ble tilsatt ved 0, 24, 48, 72 timer, respektivt, og inkubert i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk tetthet (OD) ble målt ved 450 nm og 630 nm av en mikroplateleser (Wellscan MK3, Thermo /Labsystems, Finland).
kjemosensitivitet analyse
BxPC-3 og ASPC-1 celler ble transfektert i 24 timer, belagt på 96-brønners plater (4000 celler /brønn), og ble behandlet med fortynnet i serie gemcitabin (Eli Lilly and Company) i tre paralleller. Etter 48 timer inkubering ble 10 ul /brønn CCK-8-reagens tilsatt og inkubert i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk tetthet (OD) ble målt ved 450 nm og 630 nm ved anvendelse av en mikroplateleser.
Western blotting
Etter 48 timers transfeksjon i 6-brønns plater ble cellene spaltet med trypsin-løsning og lysert med RIPA buffer (Applygen, Beijing). Totale proteiner ble separert ved natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). Etter blokkering med 5% fettfri tørrmelk ved romtemperatur i 1 time, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranene ble deretter vasket og inkubert med en pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Applygen, Beijing) ved romtemperatur i 1 time. Proteinbånd ble visualisert med echochemiluminescence (ECL) deteksjon system, og uttrykket nivåer av disse proteinene ble evaluert ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0-programvare (Media Cybernetics, USA).
Dual-luciferase reporter analysen
pmiR-RB-Report-IGF-1R-3′-UTR vektorer som inneholder vill type eller muterte målsekvens ble bygget av RiboBio Co., Ltd (Guangzhou, Kina). BxPC-3-celler ble sådd ut i 12 brønners plater (1 x 10
5-celler /brønn) og ko-transfektert med MIR-497 etterligner og vektorer som uttrykker muterte target-sekvensen, eller ko-transfektert med etterligner og vektorer som uttrykker villtype-mål sekvens bruker lipofektamin 2000. etter transfeksjon i 48 timer, ble luciferase aktivitet målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) i henhold til produsentens protokoll.
Pasienter og plasma IGF-1R uttrykk
Plasmaprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble oppsamlet fra 42 bukspyttkjertelcancerpasienter. Plasma prøver fra pasienter med andre pankreastumorer (29 pasienter, inkludert serøs cystadenoma (7 tilfeller), mucinous cystadenoma (8 tilfeller), solid pseudopapillary tumor (10 tilfeller) og intra-duktalt papillær mucinous svulst (4 tilfeller)), kronisk pankreatitt ( CP, 19 pasienter), bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster (PNET, 19 pasienter) og friske frivillige (30 tilfeller) ble samlet som kontroller. Kreft i bukspyttkjertelen, PNET og andre pankreastumorer ble diagnostisert gjennom patologisk undersøkelse. CP ble diagnostisert i henhold til de kliniske diagnostiske kriterier. Blodprøver ble sentrifugert ved 3000 omdreininger per minutt (rpm) i 10 minutter. Plasma ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C før bruk. Plasma IGF-1R nivåer ble oppdaget ved hjelp av menneskelig IGF-1R ELISA Kit (Katalognummer: CSB-E13766h, CUSABIO, Kina). Etter produsentens protokoll
Statistisk analyse
SPSS v.13.0 programvare (SPSS, Inc, Chicago, IL) ble brukt for statistiske analyser. Kontinuerlige data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) og sammenlignet med variansanalyse (ANOVA), student
t
test eller Mann-Whitney
U
test. Kategoriske data ble presentert som prosent og sammenlignet ved hjelp av en Pearson χ
2 test eller Fisher eksakt test når celletall var mindre enn 5. Kaplan-Meier metoden ble brukt for overlevelsesanalyse ved bruk av log-rank test. Statistisk signifikans ble definert som
P 0,05
.
Resultater
MiR-497 ble nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev
MiR-497 nivåer i 10 bukspyttkjertelkreft prøver og matchet tumor tilstøtende vev ble oppdaget ved hjelp av ISH. Den gjennomsnittlige prosentandelen av positive celler i bukspyttkjertelen cancervev var 30,0% ± 35,4%, som er betydelig lavere enn den i tumor tilstøtende vev (93.5.0% ± 2,4%) (
P = 0,000
). ( Figur 1)
MiR-497 nivåer i bukspyttkjertelen vev ble oppdaget ved hjelp av ISH (200 ×). (A) Negativ kontroll. (B) ISH for MIR-497 i kreft i bukspyttkjertelen vev. (C) ISH for MIR-497 i tumor nærliggende vev. (D) Den gjennomsnittlige prosentandelen av positive celler i bukspyttkjertelen cancervev var 30,0% ± 35,4%, som er betydelig lavere enn den i tumor tilstøtende vev (93.5.0% ± 2,4%). Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD.
MiR-497 hemmet spredning
Etter 48 timer med transfeksjon med Mir-497 etterligner eller hemmer, MIR-497 nivåer var signifikant oppregulert eller nedregulert (Figur S1 A, B). Videre MIR-497 oppregulering signifikant hemmet proliferasjonen av PDAC celler (figur 2 A, B). I motsetning til dette, MIR-497 nedregulering fremmes spredning (figur 2 C, D).
Proliferasjon ble analysert ved hjelp av CCK-8-analyse. (A, B) Transfeksjon med Mir-497 etterligner trykt PDAC celler spredning i ASPC-en og BxPC-3 celler, henholdsvis. (C, D) Transfeksjon med MIR-497 hemmer forfremmet PDAC celler spredning. (*
P
0,05
)
MiR-497 forfremmet følsomhet for gemcitabin
Etter gemcitabin behandling i 48 timer, det. hemming priser av PDAC celler transfektert med Mir-497 etterligner var betydelig høyere enn celler transfektert med ligner kontroll (figur 3 A, B). Celler transfektert med MIR-497-inhibitor var mer resistente mot gemcitabin behandling enn celler transfektert med inhibitor-kontroll. (Figur 3 A, C).
(A) ASPC-1-celler ble transfektert i 24 timer, og deretter behandlet med 100 nM gemcitabin i 48 timer. Oppregulering av MIR-497 ved transfeksjon av ligner re-sensibilisert celler til gemcitabin. Nedregulering av MIR-497 ved transfeksjon av inhibitor redusert følsomheten av celler til gemcitabin. (B) BxPC-3-celler ble transfektert i 24 timer, og behandlet med fortynnet i serie gemcitabin (1 nM, 10 nM, 30nm, 100 nM). Celler transfektert med MIR-497 etterligner var mer følsomme for gemcitabin. (C) Celler transfektert med MIR-497-inhibitor var mer resistente mot gemcitabin. (*
P
0,05
).
MiR-497 økt uttrykk av spaltet caspase-3 og PARP aktiveres av gemcitabin
caspase-3 og Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er avgjørende for apoptose. Transfekterte celler ble behandlet med gemcitabin i 48 timer, og deretter ble detektert nivåene av spaltede kaspase-3 og PARP ved western blotting. Vi fant at oppregulering av MIR-497 økte nivåene av spaltede kaspase-3 og spaltet PARP (figur 4 A, B, figur S2). Omvendt, nedregulering av MIR-497 reduserte nivåene av spaltede kaspase-3 og spaltet PARP. (Figur 4 A, B, figur S2).
Celler ble transfektert inn i 6-brønners plater. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble ASPC-1 og BxPC-3-celler behandlet med 10 uM og 10 nM gemcitabin, henholdsvis. Etter ytterligere 48 timer ble cellene høstet og totalt protein ble ekstrahert. (A) Oppregulering av MIR-497 ved transfeksjon av etterligner i ASPC-1-celler økt ekspresjon av spaltet caspase-3 og PARP, mens hemming av MIR-497 ved transfeksjon av inhibitor redusert ekspresjon av spaltet caspase-3 og PARP, uten noen virkning på nivåene av total caspase-3 og PARP. (B) Samme resultater ble observert i BxPC-3-celler.
MiR-497 trykkes IGF-1 R-proteinekspresjon ved å binde seg til det 3′-UTR
I henhold til forutsigelse av open access databaser (TargetScan, miRBase Targets, PicTarget, microRNA.org), ble IGF-1R betraktet som en kandidat mål av MIR-497. For å bekrefte denne spådommen, utførte vi en luciferase reporter analysen. Vi fant luciferase aktivitet var signifikant redusert etter co-transfeksjon av MIR-497 etterligner og vektorer som uttrykker villtype målsekvens i BxPC-3 celler, sammenlignet med i celler co-transfektert med ligner og vektorer som uttrykker mutert målsekvens (
P
0,05
). (B) Et mRNA-nivåer av IGF-1R ble påvist ved QRT-PCR. GAPDH ble servert som en intern kontroll. Transfeksjon med etterligner i BxPC-3-celler ikke undertrykke ekspresjon av IGF-1 R-mRNA. (C) Et uttrykk nivåer av IGF-1 R, p-AKT og AKT ble detektert. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Oppregulering av MIR-497 ved transfeksjon av etterligner i ASPC-1cells inhiberte signifikant nivåer av IGF-1R og p-AKT, mens nedregulering av MIR-497 ved transfeksjon av inhibitor økte nivåer av IGF-1R og p-AKT, uten noen effekt på nivåene av total AKT. (D) Samme resultat ble vist i BxPC-3 celler.
For ytterligere å bekrefte, ble western blotting utført. Vi fant at oppregulering av MIR-497 undertrykket ekspresjon av IGF-1 R-protein uten noen endring i ekspresjonen av IGF-1R mRNA (Figur 5 B, C, D, fig S3). I motsetning til dette, nedregulering av MIR-497 økte IGF-1 R-proteinekspresjon (figur 5 C, D, fig S3). I tillegg undersøkte vi nivået av p-AKT-mediert av IGF-1R. Vi har observert at nivået av p-AKT betydelig redusert etter oppregulering av MIR-497. Tvert imot, inhibering av MIR-497 økt nivå av p-AKT (
P 0,05
). (Figur 5 C, D, fig S3)
Plasma IGF-1R nivåer hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Plasma IGF-1 R-nivåer ble påvist ved hjelp av ELISA. Plasmanivået av IGF-1R hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer, PNET og friske frivillige var 0,823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0,562 ± 0,3 ng /ml, 0,460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml, respektivt. Nivåene hos pasienter med bukspyttkjertelkreft økt betydelig, sammenlignet med pasienter med kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer og PNET (
P = 0,006
,
P = 0,018
, og
P = 0,004
, henholdsvis.). Det var ingen signifikant forskjell i plasma IGF-1R nivåer mellom pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og friske frivillige (
P = 0,095
). (Figur 6).
Plasma IGF-1 R-nivåer ble påvist ved hjelp av ELISA. Nivåene av plasma IGF-1R i bukspyttkjertelen kreftpasienter sammenlignes med resultatene hos friske frivillige, men høyere enn hos pasienter med kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer og PNET. Andre pankreastumorer inkludert serøs cystadenoma, mucinous cystadenoma, solid pseudopapillary svulsten og intra-duktalt papillær mucinous svulst. PNET, bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster.
Den diagnostiske verdien av plasma IGF-1R
Den diagnostiske verdien av plasma IGF-1R ble evaluert med ROC-kurven. Vi viste at plasma IGF-1R vises en verdi for å skille bukspyttkjertelkreft av kronisk pankreatitt og PNET (AUC = 0,713, 95% KI: 0,564 til 0,862,
P = 0,008
; AUC = 0,711, 95% KI: 0,581 til 0,840,
P = 0,009
, henholdsvis). Når cut-off verdi definert på 0,257 ng /ml, sensitivitet og spesifisitet for å skille bukspyttkjertelkreft av kronisk pankreatitt var 95,2% og 47,3%. Når cut-off verdi definert på 0,699 ng /ml, sensitivitet og spesifisitet for å skille bukspyttkjertelkreft fra PNET var 47,6% og 89,5%. Plasma IGF-1R kan også brukes i differensiere bukspyttkjertelkreft fra andre pankreastumorer (AUC = 0,634, 95% KI: 0.504-0.763,
P = 0,057
). Når cut-off verdi definert på 0,925 ng /ml, sensitivitet og spesifisitet for å differensiere kreft i bukspyttkjertelen fra bukspyttkjertelen godartede svulster var 33,3% og 89,7%.
Sammenhengen mellom plasma IGF-1R nivåer og clinicopathological parametre og overlevelse analyse
Pasientene ble delt inn i høy og lav uttrykk grupper som bruker 75
th persentil av plasma IGF-1R nivåer. Tumor steder og TNM stadium ble assosiert med plasma IGF-1R nivåer (
P = 0,013
,
P = 0,01
hhv. Tabell 1). Median overlevelse var 18 måneder, og 1-, 3-års overlevelse var 64% og 23,1%, henholdsvis. Median overlevelse ganger i høye og lave uttrykk gruppene var 11 og 18 måneder, henholdsvis. ble ikke observert noen signifikant forskjell i total overlevelse tid mellom høye og lave uttrykk grupper (
P = 0,366
).
Diskusjoner
Redusert Mir-497 uttrykk har vært vist i bryst, kolorektal og livmorhalskreft [7], [8], [9]. Men det er ingen rapport om Mir-497 uttrykk nivåer i kreft i bukspyttkjertelen vev. Oppregulering av MIR-497 kan undertrykke kreftceller spredning, fremme apoptose, redusere migrasjon og invasjon kapasitet og øke kjemosensitivitet [16], [17], [9]. Men roller og mekanismer for MIR-497 i bukspyttkjertelkreft er fortsatt ukjent. I denne studien, viste vi MIR-497 var signifikant nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev. Oppregulering av MIR-497 hemmet celler spredning, økt apoptose og fremmet følsomhet for gemcitabin ved direkte downregulating IGF-1R protein uttrykk.
Vår studie identifisert rollen MIR-497 i regulering av malignitet av kreft i bukspyttkjertelen. Resultatene støttet at Mir-497 hemmet kreftceller spredning, fremmet apoptose og økt kjemosensitivitet, som rapportert av litteraturen [9], [16], [17].
Da vi undersøkte mekanismene for MIR-497 i å regulere utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Vi fant IGF-1R var et direkte mål på MIR-497 med en luciferase reporter analysen, som også ble rapportert i kolorektal kreft og livmorhalskreft [8], [9]. Vi utførte også western blotting for ytterligere bekreftelse. Vi viste at oppregulering av MIR-497 sank IGF-1R protein nivåer uten noen endring i mRNA uttrykk. Nedregulering av MIR-497 økt IGF-1R protein nivåer. I tillegg har vi undersøkt ekspresjon av IGF-1 R-mediert nedstrøms molekyl. Vi fant nivået av p-AKT sank signifikant etter oppregulering av MIR-497. Hemming av MIR-497 økt uttrykk av p-AKT. Derfor spekulerte vi at MIR-497 svekket malignitet av bukspyttkjertelkreft ved delvis å undertrykke IGF-1R /AKT sti.
IGF-1R /AKT veien har blitt identifisert til å involvere i reguleringen av flere biologiske prosesser kreft [18], [19]. AKT kan aktivere BAD av fosforylering på Ser136 [20] eller aktivere NF-kB via regulerings IKB kinase (IKK) [21], og dermed resulterer i anti-apoptotiske effekter. AKT sti innebærer også i chemoresistance. Akt2 hemming opphever gemcitabin-indusert aktivering av akt2 og NF-kB, og forbedrer gemcitabin-indusert PUMA (p53-oppregulert modulator av apoptose) oppregulering, noe som resulterer i chemosensitization av bukspyttkjertel kreft til gemcitabin [22]. I samsvar med disse studiene våre data indikerer at inhibering av IGF-1 R /AKT-reaksjonsveien kan delvis ta hensyn til virkningene av MIR-497 for kreft i bukspyttkjertelen celler. Imidlertid kan MIR-497 også dempe malignitet av kreft ved å regulere andre mål, som for eksempel TARBP2, dicer, BCL2, CCND1, CCNE1, CDC25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].
Økt IGF-1R uttrykk har blitt funnet i mange kreftformer [26] og viser prognostiske verdier [27]. Høy uttrykk for IGF-1R i humane PDAC vev har også blitt rapportert [11] og medarbeidere med høyere svulst klasse og dårlig overlevelse [12]. Imidlertid har plasma IGF-1R nivåer i bukspyttkjertelen kreftpasienter ikke er oppdaget. Vår studie viste at plasma IGF-1R nivåer hos pasienter med bukspyttkjertelkreft økt betydelig, sammenlignet med pasienter med kronisk pankreatitt, andre pankreastumorer og PNET. Men det var ingen signifikant forskjell i plasma IGF-1R nivåer mellom bukspyttkjertelen kreftpasienter og friske frivillige, som kan belyses dels ved at IGF-1R ble generelt uttrykt i normale vev, slik som lever, endometrium og nerveceller [28]. Verdien av plasma IGF-1R ved diagnose av kreft i bukspyttkjertelen ble evaluert i denne studien. Det var en potensiell verdi for å skille bukspyttkjertelkreft av kronisk pankreatitt, PNET og andre pankreastumorer. Men diagnostisk sensitivitet eller spesifisitet var ikke perfekt, ble store prøve påvisninger for å ytterligere identifisere diagnostiske verdien av plasma IGF-1R.
TNM stadium ble assosiert med plasma IGF-1R nivåer i vår studie. Pasienter med avansert stadium svulster hadde høye nivåer av plasma IGF-1R. Plasma IGF-1R kan bli en ny biomarkør for guiding TNM stadium av kreft i bukspyttkjertelen. Overraskende høy uttrykk for plasma IGF-1R var ikke en negativ prognostisk faktor i denne studien.
Konklusjon
MiR-497 var signifikant nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev. Oppregulering av MIR-497 trykt malignitet av kreft i bukspyttkjertelen og re-sensitivisert PDAC celler til gemcitabin ved direkte downregulating IGF-1R protein uttrykk. Plasma IGF-1R nivåer i bukspyttkjertelen kreftpasienter økt, og vises mulige verdier for å skille bukspyttkjertelen lesjoner. IGF-1R kan også være en ny plasma biomarkør for guiding TNM stadium av kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
uttrykk nivået av MIR-497 etter transfeksjon av etterligner eller hemmer. MiR-497 uttrykk ble oppdaget av QRT-PCR. U6 ble servert som en intern kontroll. (A) BxPC-3 celler transfektert med Mir-497 etterligner viste en økning i Mir-497 uttrykk. (B) celler transfektert med MIR-497-inhibitor viste en reduksjon i MIR-497 uttrykk. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD. (*
P 0,05
)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
relative ekspresjonsnivåer av spaltede kaspase-3 og PARP. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD. (A) De relative uttrykk nivåer av proteiner i ASPC-1-celler. (B) De relative uttrykk nivåer av proteiner i BxPC-3-celler. (*
P 0,05
)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
relative uttrykk nivåer av IGF-1R og p-AKT. Relative ekspresjonsnivåer ble vist som gjennomsnitt ± SD. (A) De relative nivåer av IGF-1R og p-AKT i ASPC-1-celler. (B) De relative nivåer av proteiner i BxPC-3-celler. (*
P 0,05
)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s003 plakater (TIF)
