Abstract
Nyere forskning har antydet at visse plantebaserte polyfenoler, dvs. ursolic syre (UA), som er rapportert å ha antitumor-aktivitet, kan brukes til å sensibilisere tumorceller for strålebehandling av inhiberende reaksjonsveier som fører til strålebehandling motstand. Dette eksperimentet er designet for å undersøke effektene og mulig mekanisme for bestrålingssensibilisering av UA i BGC-823 cellelinje fra menneskelig adenokarsinom magekreft
in vitro
. UA forårsaket cytotoksisitet i en doseavhengig måte, og vi brukte en sub-cytotoksisitet konsentrasjon på UA å teste radioenhancement effekt med UA i magekreft. Radiosensitivity ble bestemt ved klonogene overlevelsesanalyse. Gjenlevende brøkdel av det kombinerte gruppen med bestråling og sub-cytotoksisitet UA betydelig redusert sammenlignet med bestråling gruppe. Den forbedrede bestrålingssensibilisering effekten var assosiert med økt G2 /M arrest, økt reaktive oksygenforbindelser (ROS), nedregulert Ki-67 nivå og forbedret apoptose. I konklusjonen, som UA demonstrert potent antiproliferation effekt og synergistisk effekt, kan det brukes som et potensielt legemiddel sensitive for bruk av strålebehandling
Citation. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L , Qian X, et al. (2015) Forbedring av stråling effekter av ursolic Acid i BGC-823 Menneskelig Adenocarcinoma Gastric Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169
Redaktør: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, USA
mottatt: 26 januar 2015; Godkjent: 24 juni 2015; Publisert: 15.07.2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (Grant nr 81172094), Topp Seks Talenter Prosjekt i Jiangsu-provinsen (Grant No. 2011ws005), og Medical Science and Technology utviklingsprosjekter av Nanjing (Grant No. ZKX10011). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for en nedgang i forekomsten, er magekreft fortsatt regnes som en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Kirurgi er fortsatt bærebjelken i noen kurativ behandling; Men omtrent to tredjedeler av pasientene med diagnosen magekreft har inoperabel lokalt avansert og /eller metastatisk sykdom. Den 5-års overlevelse for pasienter som ble diagnostisert med avansert lokoregionalt magekreft, og har gjennomgått kurativ reseksjon forbli lav på grunn av høy risiko for lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser selv om reseksjon ble antatt å være helbredende. [1] Et perspektiv randomisert Intergroup (INT) -0116 studie (556 pasienter) og retrospektiv koreansk erfaring (990 pasienter) viste en reduksjon i lokal tilbakefall med postoperativ regional stråling kombinert med kjemoterapi og en høyere overlevelse i adjuvant armen. [2] strålebehandling er hoved~~POS=TRUNC lokoregionalt kontroll modalitet for unresectable magekreft [3] The National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer anbefaler strålebehandling som en standard behandling for magekreft pasienter med høy risiko for tilbakefall.; [4] Det er imidlertid to store begrensninger i forbindelse med behandling av magekreft med stråling: (1) indre eller ervervet resistens overfor radioterapi; (2) ikke-spesifikk toksisitet mot mageslimhinnen og omkringliggende normalt vev. [2,5]
For å møte disse begrensningene, har vitenskapelige gjort forsøk på å søke etter en effektiv radiosensitizer fra urter med lavere toksisitet og høyere effekt. Nyere forskning har antydet at mange plante-avledet polyfenoler, inkludert curcumin, Flavopiridol, emodin, ursolic syre og etc, kan brukes til å bevisstgjøre kreftceller til kjemoterapi og strålebehandling ved å hemme de veier som fører til behandlingsresistens. [6,7, 8] Disse midler har også blitt funnet å være beskyttende fra terapi-assosierte toksisitet. [5] ursolic syre (UA), et pentasyklisk triterpene syre, som er ansett som en av de mest lovende Kjemopreventivt middel for kreft, har vist seg å be antitumor aktiviteter inkludert hemme startfasen og opprykk. [9,10] det også indusert tumorcelledifferensiering ved regulering av uttrykk for differensiering-spesifikke gener i mus F9 teratokarsinomceller celler. [11] i tillegg har det vært bevis som viser at UA produserte en anti-angiogen effekt i chick chorioalantoic membran og en anti-invasiv aktivitet i HT1080 menneskelig fibrosarkom celler. [12,13]
Men tidligere forskning har ennå til å demonstrere om UA kan forbedre strålingseffekter i ondartet svulst . Eksperimentet er designet for å undersøke effekten og mulig mekanisme in vitro av bestrålingssensibilisering av UA i BGC-823 cellelinje fra menneske adenokarsinom magekreft for å gi den teoretiske støtte til klinisk bruk.
Materiale og metode
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
BGC-823-celler ble erholdt fra Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina) og lagret i RPMI 1640 medium med 10% kalve bovint serum ved 37 ° C i en vannmettet atmosfære med 5% CO
2.
Cell Cvtotoksisitetsmålinq
cytotoksisitet ble bestemt ved MTT analyse utført en publisert tidligere. [14] For å illustrere, celler ble sådd ut i 8 × 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater og fikk feste seg over natten. Deretter ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50ug /ml) i 48 timer i et minimum på tre replikere brønner. Hver brønn ble deretter tilsatt 20 ul MTT, fremstilt ved å blande 5 mg MTT med 1 ml fysiologisk saltvann, og inkubert i ytterligere 4 timer. Mediet i hver brønn ble erstattet med 150ul DMSO. Absorbansen ble bestemt med en mikroplateleser (BIP-RAD) ved 490 nm. De blanke kontrollbrønner ble anvendt for nullstilling absorbans. Inhiberings-graden (IR%) ble beregnet ved bruk av bakgrunnskorrigerte absorbans ved følgende ligning:.
IC
50 ble definert som den konsentrasjonen som er nødvendig for 50% inhibering av cellevekst
Cell gruppering og in vitro ioniserende stråling
Cellene ble tilfeldig inndelt i 4 grupper: kontrollgruppen (A), UA gruppe (B), strålebehandling (RT) gruppe (C), og kombinerte gruppen (D ). De BGC-823-celler ble dyrket i 6-brønners plater, og deretter gruppe B og D ble behandlet med UA, mens gruppe C og D ble bestrålt ved bruk av en 6-MeV elektronstråle lineær akselerator (Elekta, Sverige).
klonogene overlevelse analyse
Radiosensitivity ble bestemt av klonogene overlevelse analyse. Celler (500-2000 per brønn) ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Da celler ble behandlet med UA (0, 6,25 og 10ug /ml) i 24 timer og deretter eksponert for økende doser av RT (0, 2, 4, 6 og 8Gy). Etter 10-14 dagers inkubasjon, kolonier besto av mer enn 50 celler ble observert. Koloniene ble vasket omhyggelig, farget med etanol /krystallfiolett fargestoff, og deretter telles. Den plating effektivitet (PE) ble beregnet som (gjennomsnittlig kimtall /celler seeded), og gjenlevende fraksjon (SF) ble beregnet som [bety kimtall /(celler seeded × PE)], hvor PE ble definert som (bety kimtall for un-bestrålt Kontroll /celler seeded). D
0-verdier ble beregnet ved en multi-target enkelt-hit-modell [S = 1 – (1-e
-D /D0)
N], som representerte den gjennomsnittlige dose av en dødelig eksponering. Sensitive enhancement ratio (SER) ble beregnet som D
0 forholdet mellom kombinasjonsbehandling og RT alene.
Cell syklus analyse
Påvirkningen av cellesyklusen ble analysert ved hjelp av propidium jodid /RNase buffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) flekker i henhold til produsentens instruksjoner. 2,5 x 10
5-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Deretter ble cellene behandlet med UA (0 og 10ug /ml) i 24 timer og deretter utsatt for RT (0 og 2Gy) i 48 timer. Celler ble oppsamlet ved trypsinering, fiksert i 70% etanol ved -20 ° C, vasket i PBS, resuspendert i 1 ml PBS inneholdende 1 mg /ml RNase og 50 ug /ml propidiumjodid, ble inkubert i mørke i 30 min ved 37 ° C, og analysert ved flowcytometri (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).
Måling av apoptose
celler kvantifisering av apoptose celler ble evaluert ved hjelp av en Annexin-V-FITC apoptose Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. 2,5 x 10
5-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Deretter ble cellene behandlet med UA (0 og 10ug /ml) i 24 timer og deretter utsatt for RT (0 og 2Gy) i 48 timer. Celler ble oppsamlet ved trypsinering, og resuspendert i 500ul av bindingsbuffer, og 5 ul av Annexin-V-fluorescein-isotiocyanat (FITC), og deretter, ble 5 ul av propidiumjodid (PI) ble tilsatt. Analyser ble utført med en flowcytometri.
Påvisning av reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjon
Konsentrasjonene av intracellulær ROS ble oppdaget ved hjelp av membran-gjennomtrengelig fluorescerende prober 2 «, 7»-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. 1 x 10
6-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Deretter ble cellene behandlet med UA (0 og 10ug /ml) i 24 timer, og deretter eksponert til romtemperatur (0 og 2Gy) i 48 timer. Celler ble oppsamlet ved trypsinering, resuspendert DCFH-DA i 30 min, vasket med serumfritt RPMI 1640, og deretter detektert ved strømningscytometri. Den midlere fluorescensintensitet (MFI) representert intracellulært ROS nivå.
Immunohistokjemisk farging for å vurdere Ki-67 ekspresjon
Ki-67-protein-ekspresjon ble evaluert av avidin-biotin-kompleks immunhistokjemisk (ZSGB-BIO , Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. 2 x 10
4 celler ble sådd ut i 6-brønns plater med et dekkglass for hver brønn, og fikk feste seg over natten. Da celler ble behandlet med UA (0 og 10ug /ml) i 24 timer, og deretter eksponert til romtemperatur (0 og 2Gy) i 24 timer. Deretter ble dekkglass ble fiksert i 4% paraformaldehyd, inkubert med 0,5% Triton X-100 i 20 min, vasket i PBS og inkubert med 3% H
2o
2 i 15 minutter. Etter skylling med PBS tre ganger, ble cellene som var festet på dekkglassene inkubert med Ki-67 monoklonale antistoffer for 60 min ved 37 ° C, og deretter vasket i PBS igjen. Biotin-konjugert sekundære antistoffer for 20min ved 20-37 ° C, vasket med PBS for fire ganger, deretter farget av DAB Farging Kit, vasket med vann, og deretter kontra med hematoksylin.
Statistisk analyse
dataene ble rapportert som gjennomsnitt ± SD, og at sammenligninger ble utført ved en-veis ANOVA. P 0,05 ble akseptert som signifikant. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS, v. 17.0.
Resultater
cytotoksiske effektene av UA på BGC-823 celler
Den cytotoksiske effekten av UA på BGC-823 celler ble evaluert basert på MTT analysen. Vi fant ut at UA doseavhengig økt cytotoksisitet i magekreft cellelinje BGC-823 (figur 1). Den halvmaksimalt hemmende konsentrasjon (IC
50) verdier for BGC-823 var 17.5ug /ml. Svakt cytotoksisitet ( 15%) av UA for BGC-823, 10ug /ml, ble brukt for etterfølgende planlagte eksperimenter, for å kontrollere for radioenhancement på grunn av en direkte cytotoksisk effekt
Etter 48 timer inkubasjon med UA ved. de angitte konsentrasjoner, cytotoksisitet ble bestemt ved MTT-analyse. UA forårsaket cytotoksisitet i en doseavhengig måte, IC
50 UA for BGC-823 ble 17.5ug /ml, og vi definert 10ug /ml som en svak cytotoksisitet (sub-cytotoksisitet) ( 15%) konsentrasjon .
De bestrålingssensibilisering effektene av UA in vitro
Cell overlevelseskurver målt ved klonogene overlevelse analyse ble illustrert i figur 2. Sammenlignet med RT bare, SF
2 av RT kombinert med UA betydelig redusert i BGC-823 celler, SER verdier av den kombinerte gruppene var 1.180 ganger og 1,315 ganger. Disse resultatene indikerte at UA forbedret strålingseffekten av BGC-823 på en doseavhengig måte innenfor en svak cytotoksisitet konsentrasjoner.
Radiosensitivity ble bestemt ved klonogene overlevelsesanalyse. Gjenlevende brøkdel av de kombinerte gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med bestråling gruppe (** p 0,01)..
Cellesyklus distribusjon og induksjon av apoptose
For å undersøke om RT og /eller UA behandling kan føre til en hvilken som helst perturbasjon av cellesyklusen, en analyse av BGC-823-celler behandlet med 2Gy bestråling og /eller 10ug /ml UA ble utført. I forhold til kontrollgruppen, 10ug /ml UA alene ga nesten ingen virkning på cellesyklusen. Men den kombinerte gruppen av UA og bestråling indusert cellesyklus-stans i G
en fase (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) og G
2 /M-fasen (3,14% VS 13,67%, p 0,01, figur 3D)
UA økt RT indusert ROS dannelse
det er allment akseptert at celledreping etter eksponering for ioniserende stråling er delvis mediert av ROS. [16] ROS analyse ved hjelp av DCF-DA produserte gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI), som representert intracellulære ROS nivå i hver gruppe (fig 4A og 4B). MFI av UA alene gruppe, RT alene gruppen og UA + RT gruppe økte med 1,15 ganger, 1,53 ganger og 2,09 ganger sammenlignet med kontrollgruppen. Nivået av ROS av kombinasjonsgruppen økt betydelig i forhold til RT alene-gruppen, avslører at å legge UA til RT indusert mer ROS dannelse enn RT alene.
Konsentrasjonene av intracellulær ROS ble påvist ved hjelp av membran-gjennomtrengelig fluorescerende sonder 20, 70-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) ved flowcytometri. Gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI) representert intracellulære ROS nivå. Den MFI forskjellen mellom kombinasjonsgruppen og RT gruppen var signifikant (P 0,01) (ns: ikke signifikant; **: P 0,01)
Immunhistokjemisk farging av Ki-67
.
Ki-67 er kjent som en kjernefysisk antigen, som ofte korrelerer med celleformering. Våre forsøk har oppdaget den positive frekvensen av Ki-67 protein ved immunhistokjemisk farging, og resultatene ble vist i figur 5. Prosent av Ki-67 positive celler i den kombinerte gruppen redusert vesentlig sammenlignet med kontrollgruppen, så vel som strålingsterapigruppen .
fig 5A viste bilder av resultatene av Ki-67 immunhistokjemisk farging av BGC-823 cellelinje (forstørrelse: 10 x 40). Prosentandelen av Ki-67 positive celler i den kombinerte gruppen redusert vesentlig sammenlignet med kontrollgruppen, så vel som strålingsterapigruppen. Fig 5B viste at forskjellen mellom kontrollgruppen og den UA gruppen var ikke-signifikant; Men det var en betydelig nedgang mellom kombinasjonsgruppen og RT-gruppen (** P 0,01).
Diskusjoner
Denne forskningen undersøkte effekten og mulig mekanisme for UA som en radiosensitizer. MTT-analysen og klonogene overlevelsesanalyse viste at IR kombinert med UA var overlegen i cytotoksisitet enn IR alene. Denne effekten ble observert i begge grupper med forskjellige sub-cytotoksiske konsentrasjoner av UA, 6.25ug /ml og 10ug /ml. På denne dosen, UA hadde liten cytotoksisitet mot menneskers adenokarsinom magekreft cellelinje BGC823 og ikke har vesentlig cytotoksisitet til normal mage cellelinje. [17] Dette viser at UA var en lovende bestrålingssensibilisering
in vitro
.
Sentralt i kreft strålebehandling er å maksimere terapeutisk effekt å svulstvev mens skade på normalt vev minimeres. Mens utdypet planlegging og senere fysiske teknikker kan trygt øke stråledosen til svulstvev mens dosen reduseres til omkringliggende normalt vev, [18] dagens strålebehandling teknikker kan fortsatt ikke unngå å skade nærliggende normalt vev. Ytterligere radioterapeutiske fordel kan bli funnet ved å undersøke den biologiske respons av tumoren mikromiljøet for å avdekke hvordan å øke en svulst følsomhet for stråling eller inhibere bivirkninger ved stråling. [19]
Normale vev rundt magekreft, slik som tarm og mage, er følsomme for ioniserende stråling. Som et resultat av dette må den ioniserende strålingsdose mot tumorvev være begrenset. Dessuten vil de overlappende bivirkninger av ioniserende stråling forsterke radioterapi bivirkninger, og til og med avbryte behandlingen. Sub-cytotoksisitet konsentrasjon av UA i kombinasjon med ioniserende stråling, kan imidlertid øke cytotoksisiteten av ioniserende stråling, mens lav konsentrasjon UA er nesten ufarlig for normale vev. Denne strategien kan øke den terapeutiske indeksen til svulstvev uten å øke stråledose og radioterapeutiske bivirkning.
For å identifisere mekanismen for bestrålingssensibilisering av UA, utførte vi analyse i flere trinn. Først, analyserte vi cellesyklusfordelingen. Sub-cytotoksisitet konsentrasjon på UA ikke ga noen signifikant effekt på cellesyklusen, mens sammenligne med ioniserende stråling alene, den kombinerte behandling forbedrede G
2 /M arrest. Den radiosensitiviteten av celler som er korrelert til cellesyklus, og korrelasjonen er høyere i G
2 /M-fase og lavere i S-fasen. Dette kan være den viktigste underliggende årsaken til den forbedrede bestrålingssensibilisering observert i denne studien. For det andre, vi analyserte intracellulære ROS nivåer. ROS-nivået i kombinasjonsgruppen signifikant økt sammenlignet med kontrollgruppen, UA alene gruppe, eller til og med ioniserende stråling gruppe. Tilsetningen av UA for ioniserende stråling indusert mer ROS formasjonen. Ioniserende stråling indusert radiolyse av vann, som genererte ROS, så som hydroksylradikaler og superoksid. Disse molekylene ROS spilte en viktig rolle i ioniserende stråleinduserte cellulære lesjoner, slik som oksydativ DNA-skade, som kan føre til både klonogene død og apoptose. For det tredje, i denne undersøkelsen, fant vi at andelen av Ki-67 positive celler i kombinasjonsgruppen redusert vesentlig sammenlignet med kontrollgruppen eller strålebehandling gruppe. Ki-67 er kjent som et cellesyklus-assosiert antigen og et nyttig markør proliferasjon. Ki-67 proteinnivået er korrelert med høyere spredning og metastaser evne. [20,21]
I konklusjonen, er denne studien første forsøk på å vise at UA kan synergize med ioniserende stråling mot menneskelige mage kreft cellelinjer . Den underliggende mekanismen for forbedret bestrålingssensibilisering effekt kan være den forbedrede G2 /M arrest, økt ROS og nedregulert Ki-67 nivå. Kollektivt, som UA demonstrert potent antiproliferation effekt og synergistisk effekt, kan det brukes som et potensielt legemiddel sensitive for bruk av strålebehandling. Men det er uten tvil at videre forskning er nødvendig for å vurdere muligheten og fordelene ved å bruke tradisjonell kinesisk medisin som radiosensibiliserende før selve kliniske applikasjoner. Flere eksperimenter og gjennomkjøringer er nødvendig i andre tumortyper og i dyreforsøk, for å bekrefte effektiviteten av den foreslåtte strategi.
