Abstract
Aberrant histone acetylering spiller en avgjørende rolle i neoplastiske prosessen via epigenetisk stanse av svulst suppressor gener (TSGs); Derfor har hemning av histon deacetylases (HDAC) blir et lovende mål i kreftbehandling. For å undersøke korrelasjonen av histone acetylering med clinicopathological funksjoner og TSG uttrykk, undersøkte vi uttrykket av acetylert H3 (AcH3), RARβ2, E-cadherin og β-catenin ved immunhistokjemi i 65 livmorhals plateepitelkarsinom pasienter. Resultatene viste at det ikke foreligger AcH3 er direkte assosiert med dårlig histologisk differensiering og lymfeknutemetastase så vel som redusert /negativ ekspresjon av RARβ2, E-cadherin, og β-catenin i kliniske tumorprøver. Vi har videre vist at klinisk tilgjengelige HDAC-inhibitorer valproinsyre (VPA) og suberoylanilide hydroksamsyre (Saha), i kombinasjon med all-trans retinsyre (ATRA), kan overvinne den epigenetiske hindringer for transkripsjon av RARβ2 i humane cervikale kreftceller. Kromatin immunoutfelling analyse viste at kombinasjonen behandlingen økte anriking av acetylert histon i RARβ2-RARE promoter-regionen. På bakgrunn av disse funn evaluert vi antitumor effekter indusert ved kombinert VPA og ATRA behandling i en xenograft modell implantert med dårlig differensiert humane karsinomer. Spesielt, VPA restaurert RARβ2 uttrykk via epigenetisk modulering. Additive antitumoreffekt ble produsert i tumorxenotransplantater ved å kombinere VPA med Atrå behandling. Mekanistisk kombinasjonsbehandling reaktivert ekspresjon av TSGs RARβ2, E-cadherin, P21
CIP1
, og P53 og reduserte nivået av p-Stat3. Sekvensielt, bidro oppregulering av involucrin og loricrin, som indikerer terminal differensiering, sterkt til tumorvekstinhibitering sammen med delvis apoptose. I konklusjonen, målrettet behandling med HDAC hemmere og RARβ2 agonister kan representere en roman terapeutisk tilnærming for pasienter med livmorhals plateepitelkarsinom
Citation. Feng D, Wu J, Tian Y, Zhou H, Zhou Y, Hu W , et al. (2013) målretting av Histone Deacetylases å reaktivere Tumor suppressor gener og terapeutisk potensial i et menneske livmorhalskreft Xenotransplantat Model. PLoS ONE 8 (11): e80657. doi: 10,1371 /journal.pone.0080657
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 25. april 2013, Godkjent: 06.10.2013; Publisert: 19.11.2013
Copyright: © 2013 Feng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (30901606, 81001168,81072127, 81372779 og 81372777) og Anhui Provincial Natural Science Foundation (110406M176 og 110406M178). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylige studier har antydet at endring i kromatinstruktur som følge av histon-acetylering kan være viktig for den neoplastiske prosessen [1] – [3]. Acetylering av histoner status bestemmes av histon-deacetylase (HDAC) og histon-acetyl-transferase (HAT). Kreft Utviklingen er drevet av genetiske og epigenetiske forandringer på cellenivå som aktiverer og inaktiverer onkogener og tumorsuppressorgener (TSGs), henholdsvis [4]. Transkripsjonen lyddemping av histon-deacetylering er en av de veletablerte mekanismer for TSG inaktive [1], [5] – [7]. Noen studier har vist at deacetylert histoner på promoter regioner undertrykke uttrykk for TSGs, slik som
retinoblastom product: [8], retinoic-syre reseptor β (
RARβ
) [9],
p21 product: [10],
p53 product: [6],
p16 product: [11],
E-cadherin product: [5], og mange andre. Dermed har hemming av HDAC enzymer blitt allment akseptert som en strategi for å modulere genekspresjon gjennom induksjon av histone hyperacetylation og re-uttrykk for forstummet TSGs.
Av alle TSGs, RARβ2, og E-cadherin spille en viktig rolle i modulering av cellevekst og differensiering i både friske og ondartede celler [9]. Muligheten av retinsyre for å virke som en Kjemopreventivt middel lettes primært ved dets interaksjon med RARβ2 [9], [12]. E-cadherin er et intercellulært adhesjonsmolekyl i epitel-celler, som binder til P-catenin for å danne et kompleks som spiller en viktig rolle i å opprettholde den morfologiske integritet av den normale epitel [13], [14]. Studier av epiteltumorer har konsekvent vist at nedregulering av RARβ2 er en viktig hendelse i malignitet, og at den påfølgende avvikende uttrykk for E-cadherin /p-catenin komplekser korrelerer med konvertering av tidlig stadium svulster i invasive kreftformer [15], [ ,,,0],16]. Tapet av RARβ2 uttrykk i tumorceller har blitt tilskrevet stanse av genet promoter-regionen via histon deacetylering og hypermethylation. Derfor har bruken av HDAC-inhibitorer, enten alene eller i kombinasjon med DNA-metyltransferase (DNMT) inhibitorer, er vist å gjenopprette de transkripsjons- og vekst- regulerende virkninger av RARβ2 [9], [17], [18]. Vår tidligere arbeid har også avdekket at kombinasjonen av valproinsyre (VPA), en klinisk tilgjengelig HDAC hemmer, og all-trans retinsyre (ATRA) fremmer synergieffekter i reaktivere sovende RARβ2 og sterkt hemmende livmorhalskreft cellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
ved å fremme differensiering via PI3K /Akt vei [19]. Men til vår kunnskap, sammenhengen mellom histone acetylering og TSG uttrykk i menneskelige livmorhalskreft vevsprøver og potensialet utnyttelse av histone acetylering i målrettet kreftbehandling er ikke fullstendig evaluert. I denne studien undersøkte vi histon H3 acetylering og TSG uttrykk i livmorhalskreft og sin tilknytning til clinicopathological parametere. Videre vurderte vi det terapeutiske potensialet i HDAC hemmer VPA kombinert med Atrå i behandling av en svulst xenograft modell avledet fra menneskelig livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
denne studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen i Anhui Medical University. De parafininnstøpte vevsprøver pasient brukt i denne studien ble oppnådd som beskrevet i vår tidligere rapport [20]. Kreft vev for implantering i mus ble oppnådd fra pasienter med kreft i livmorhalsen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Godkjenning for
in vivo
forsøk med dyr ble gitt av komiteen for bruk og stell av dyr av Anhui Medical University.
Pasienter og prøver
Formalin-fiksert parafin- innebygde prøver fra livmorhalskreft i 65 pasienter med diagnosen livmorhals plateepitelkarsinom ble trukket fra arkivene til Avdeling for patologi i Anhui Provincial Hospital tilsluttet Anhui Medical University i perioden fra 2002 til 2008. de kliniske faser ble bestemt av to sertifiserte gynekologer i henhold til den modifiserte International Federation of Gynecology Obstetrics (FIGO) system for livmorhalskreft publisert i 2000. svulstene ble klassifisert som vel – moderat eller dårlig differensiert – av minst to patologer i henhold til kriteriene som foreslås av Verdens helseorganisasjon. Detaljert clinicopathological informasjon er vist i tabell 1. Alle pasienter ble behandlet med radikal hysterektomi. Ingen av pasientene hadde fått noen tumor-spesifikk terapi før kirurgisk inngrep.
Cellekultur og behandling
Menneskelige livmorhalskreft cellelinjer HeLa, Siha, CaSki, og C33A ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM (Gibco, USA) med 10% føtalt bovint serum (Gibco). VPA (Sigma-Aldrich, USA) ble oppløst i PBS og anvendt i en sluttkonsentrasjon på 3 mmol /l. Saha og ATRA ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, oppløst i DMSO, og som brukes ved sluttkonsentrasjoner på 10 umol /L og 1 pmol /L, henholdsvis. Cellene ble behandlet enten med VPA eller Saha alene eller i kombinasjon med ATRA i 48 timer. Kontroll celler ble behandlet med bilen alene.
Immunhistokjemisk farging og evaluering immunoreaktivitets
Parafin blokker av svulstene ble kuttet i 5
μ
m skiver og deretter behandlet ved hjelp av standard deparaffinisation og rehydrering teknikker. Endogene peroksydaser ble blokkert ved bruk av 3% -ig hydrogenperoksyd. For antigen gjenfinning, ble platene behandlet ved mikrobølgeoppvarming i 0,01 M natriumcitrat (pH 6,0). Glassene ble pre-inkubert i 5% geiteserum i TBS (pH 7,6) før primære antistoffer ble tilsatt. De følgende primære antistoff-fortynninger ble anvendt: 1:100 til acetylert histon H3 (Santa Cruz, USA), 1:100 for RARβ2 (Santa Cruz), 01:50 for E-cadherin (Abcam, UK), 1:100 for β -catenin (Abcam), 1:100 for involucrin (Santa Cruz), 1:500 for loricrin (Abcam), og 1:200 for Ki67 (BOOSTER, Kina). Bindingen av de primære antistoffer ble visualisert ved hjelp av ChemMate Detection Kit (BOOSTER). Glassene ble lett motfarget med Mayer haematoksylin i 30 sekunder
Immunreaktiviteten ble semikvantitativt bedømt på basis av fargeintensitet og fordeling ved hjelp av immunoreaktivitet poengsum som følger: a. Intensitet x andel poengsum [16], [21]. Intensiteten resultatet ble definert som 0, negativ; 1, svak; 2, moderat; eller 3, sterk, og andelen resultatet ble definert som 0, negativ; 1, 10%; 2, 11-50%; 3, 51-80%; eller 4, 80% positive celler. Den totale poengsum varierte fra 0 til 12. Immunreaktiviteten ble delt inn i tre nivåer på basis av den endelige Resultat: negativ immunoreaktivitet ble definert som en total poengsum på 0; lav immunoreaktivitets ble definert som en total score på 1-4; og høy immunoreaktivitets ble definert som en total poengsum høyere enn 4. farget tumorvev ble scoret av to forskere som var blindet for de kliniske data.
RNA isolering og real-time PCR kvantifisering
ett mikrogram total RNA som ble ekstrahert fra vevene, ble omdannet til cDNA ved anvendelse av Superscript III revers transkriptase (Takara, Japan). Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført ved hjelp av 50 ng cDNA, spesifikke primere (tabell 2), den SYBR®
Premiks Ex Taq
™ Kit (Takara), og en Opticon® to real- time PCR instrument (MJ Research, USA). Genuttrykk nivåer ble bestemt ved bruk av standardkurve metode og uttrykt i forhold til GAPDH uttrykket.
Antistoffer og immunoblotting
acetylert histon H3 (AcH3, 1:500), RARβ2 (1 :500), og involucrin (1:500) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Den Stat3 (1:1000), p-Stat3 (1:2000), P21 (1:1000), og GAPDH (1:2000) antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology. E-cadherin (1:500), β-catenin (1:5000), og loricrin (1:2000) antistoffer ble kjøpt fra Abcam. P53 (1:500), caspase-3 (1:1000), og Bcl-2 (1:200) antistoffer ble erholdt fra BOOSTER Technology. Protein ble fremstilt fra vevet i henhold til den kit (# 89900, Thermo, USA) anvisningen, bortsett fra tilsetning av en syre ekstraksjonstrinn for histoner [19]. Etter elektroforese ble proteinene overført til polyvinylidenfluorid (PVDF-membraner) og probet med de angitte primære antistoffer. Inkubering med artsspesifikke antistoffer (sekundære cellesignalisering) ble utført ved romtemperatur i en time. Blottene ble utviklet med kjemiluminescenssubstrat (Thermo), og autoradiografi ble utført med X-OMAT film (Kodak, Rochester, New York).
Chromatin immunoprecipitation analysen
Chromatin immunoprecipitation (chip) ble utført bruker EZ-chip Assay kit (Millipore, USA) med en chip-grade antistoff til acetylert histon H3 (H3K9ac, Abcam). Kort fortalt ble livmorhalskreftceller dyrket i 150 mm kultur retter. Cellene ble deretter behandlet med enten VPA (3 mmol /L) eller Saha (10 umol /l) alene eller i kombinasjon med ATRA (1 umol /l) i 48 timer. Cellene ble deretter kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, og reaksjonen ble stanset med 0,125 M glycin. Cellene ble skrapet, resuspendert i lyseringsbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, og 50 mM Tris-HCl, pH 8,1) supplert med protease inhibitor cocktail på is, og ultralydbehandlet for å oppnå DNA-fragmenter av 200-1000 bp i lengde , som bekreftet ved elektroforese på 1% agarosegeler. Den skjærpåvirkede DNA ble sentrifugert ved 12000 x
g
ved 4 ° C i 10 minutter, og supernatanten ble oppsamlet. Ti prosent av supernatanten ble reservert til bruk som inngang DNA og behandlet for videre bruk som en positiv kontroll. Løselig kromatin ble immunopresipitert over natten med et anti-H3K9ac antistoff. Den immunopresipitert kromatin Komplekset ble høstet ved bruk av protein G-agarose perler, og tverrbindingen ble reversert ved tilsetning av NaCl til en sluttkonsentrasjon på 200 mM ved 65 ° C i 5 timer. DNA ble renset ved hjelp av sentrifugekolonner levert med settet. DNA-prøvene, samt inngangsmaterialet og mock immunoutfellingsstudier prøvene, ble anvendt som templater for semikvantitativ og real-time PCR for å bestemme den relative anrikning av RARβ2-RARE-promoteren. De primere for RARβ2-RARE promoter er vist i Tabell 2.
Implantasjon av originale menneskelige tumorxenotransplantater hos mus og medikamentell behandling
Fire uker gamle BALB /c nakne mus ble oppnådd fra Laboratory Animal Center of the Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i et patogen-frie dyr anlegg for en uke før bruk. En livmorhalskreft eksemplar av dårlig differensiert plateepitelkarsinom, som ble bekreftet av histologi, ble oppnådd med informert samtykke fra en pasient som gjennomgår operasjon innen en time etter hysterektomi. Prøven ble vasket med fosfat-bufret saltløsning (pH 7,4) inneholdende 10 000 U /ml penicillin og streptomycin og deretter seksjonert i små biter på omtrent 2-4 mm
3 for implantasjon. Disse små vevsblokker ble implantert inn i det subkutane vevet av tre nakne mus ved fotens rygg ved hjelp av en trokar.
Etter 6-8 uker, en porsjon av tumorknuter som utviklet seg ble skåret ut under sterile betingelser. Denne prøven ble umiddelbart oppdelt i små fragmenter og injiseres inn i andre nakne mus. Når håndgripelig svulster ble etablert, ble 20 mus tilfeldig plassert inn i fire grupper: kontroll, VPA, ATRA, og kombinasjonen. VPA ble fortynnet i 0,9% natriumklorid, mens ATRA ble oppløst i renset sesamolje. Musene ble administrert VPA (300 mg /kg /d) og /eller ATRA (15 mg /kg /d) daglig via intraperitoneal (i.p.) injeksjon og intragastrisk (i.g.) gavage nål, respektivt. Kontrollgruppen mottok bæreren alene etter den samme plan. Tumorvolumet ble målt med en kaliper to ganger ukentlig, og beregnet i henhold til følgende formel: (lengde x bredde
2) /2. Dyrene ble behandlet i 4 uker og deretter avlivet. Svulster ble høstet og festes med 4% paraformaldehyde for patologisk evaluering eller frosset på flytende nitrogen for PCR, chip, og immunblotanalyse like svulstene massen ble registrert. Tumorvekstinhibering (TGI) ble beregnet ved å subtrahere fra 100% av midlere tumormasse ble behandlet /kontroll bety tumormasse x 100%.
TUNEL assay
Ved mottakelsen av hver tumorprøve, en liten del av tumoren ble fiksert i 4% paraformaldehyd og innstøpt i parafin. Etter deparaffinization, ble seksjonene vasket og permeabilisert i 5 min på is med 0,1% Triton X-100 og deretter inkubert med proteinase K (Sigma-Aldrich) i 10 minutter ved romtemperatur. TUNEL farging ble utført ved hjelp av en
in situ
apoptose-deteksjon kit (Keygene Technology, Kina), i henhold til produsentens anvisninger. Snittene ble dekket med TUNEL merking reaksjonsblanding (ekvilibreringsbuffer, biotin-11-dUTP, TdT enzym) og inkubert ved 37 ° C i 1 time i et fuktighetskammer. Seksjonene ble videre merket med streptavidin-FITC i mørke i 30 min. Etter kontra med DAPI (2 mikrogram /ml), ble tunel-positive celler telles fra fluorescens bilder tatt fra 10 tilfeldige felt på 200 × forstørrelse.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakken (versjon 13, SPSS Inc., USA). Korrelasjonen mellom clinicopathological parametere og immunhistokjemiske data ble vurdert ved hjelp av chi-squared test eller Fishers eksakte test. Sammenhengen mellom ekspresjonen av AcH3, RARβ2, E-cadherin, og β-catenin ble analysert ved anvendelse av chi-kvadrat-test for en lineær trend. Den inter-observatør samstemmighet i immunoreaktivitets poengsum mellom to forskerne ble vurdert av κ-statistikk. Ifølge Fleskens [22], κ-verdier 0,20 indikerer dårlig avtale; 0,21 til 0,40 rettferdig avtale; 0,41 til 0,60 moderat enighet; 0,61 til 0,80 god avtale; og 0,81 til 1,00 utmerket avtale. ANOVA ble brukt til å analysere statistisk signifikans for den relative berikelse av RARβ2 promoter i ChIP analysen og de
in vivo
xenograft modeller. En
P
-verdi av. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Clinicopathological egenskaper
I alt 65 tilfeller av primær livmorhals plateepitelkarsinom karsinom ble analysert. Deres clinicopathological funksjoner, inkludert tumor differensiering, staging informasjon og nodal metastaser, ble anmeldt og er oppsummert i tabell 1.
Foreningen for clinicopathological variabler med uttrykket nivåer av AcH3, RARβ2, E-cadherin og β- catenin
Representative resultater av vår immunhistokjemisk analyse for AcH3, RARβ2, E-cadherin, og β-catenin er vist i figur 1. i normal cervikal epitel, alle fire parametere ble positivt farget i cellene av suprabasal til basallaget, med tydelig ekspresjon av AcH3 i kjernen, RARβ2 i cytoplasma og kjerner, og E-cadherin og β-catenin hovedsakelig på membranen (figur 1). I kreftvev, immunreaktiviteten intensiteten av disse fire parametrene var sterk i godt differensierte svulster og redusert i moderat differensiert karsinom, med svak eller negativ merking i dårlig differensierte karsinomer (figur 1A).
(A) venstre panel viser seksjoner fra normal cervical vev. AcH3 farging var sterk i kreftceller i godt differensierte karsinomer. AcH3 uttrykk ble redusert eller fraværende i moderat og dårlig differensierte karsinomer, henholdsvis. Lignende uttrykk mønstre ble observert for farging av RARβ2, E-cadherin, og β-catenin. (B) Det var signifikante forskjeller i immunoreaktivitets score for AcH3, RARβ2, E-cadherin og β-catenin blant godt, moderat og dårlig differensierte plateepitelkarsinom.
Immunhistokjemisk farging ble scoret av to forskere. Tabell 3 viser samsvar mellom de to forskerne for de tre nivåene av immunoreaktivitets for AcH3, RARβ2, E-cadherin og β-catenin. En sammenligning av resultatene med κ-statistikken viste utmerket avtale RARβ2 og E-cadherin scoring (κ = 0,840, 0,876) og god avtale for AcH3 og β-catenin scoring (κ = 0,710, 0,657). Den samlede κ-verdi var 0,778 (god avtale), noe som indikerer samsvar mellom de immunoreaktivitets score gitt av de to forskerne.
Forholdet mellom clinicopathological funksjoner og immunoreaktivitets score for AcH3, RARβ2, E- cadherin, og β-catenin er vist i tabell 1. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller med hensyn til alder eller klinisk stadium mellom disse fire parametre. Men uttrykket av disse fire parametrene viste en signifikant korrelasjon med histologisk differensiering (
P
0,01) og med knutemetastaser (
P
0,01) (tabell 1). Fordelingen av de positivt fargede tumorceller plottet mot deres immunoreaktivitet score i pasientprøvene er vist i figur 1B. AcH3, RARβ2, E-cadherin, og β-catenin ekspresjon positivt korrelert med histologisk differensiering (r = 0,737, 0,531, 0,574, og 0,549, respektivt,
P
0,01) (tabell 1). For H3 acetylering, 94,4% (17/18) av de godt differensiert tilfeller viste høye uttrykk nivåer, mens 37% (10/27) av moderat differensierte tilfeller viste høye uttrykk nivåer. Sterkt uttrykk ble ikke observert i dårlig differensierte tilfeller (0/20). Andelen av tumorer med høy immunoreaktivitet for E-cadherin og β-catenin ekspresjon var over 72% hos pasienter med godt differensierte tumorer. Men for RARβ2 uttrykk, bare 39% (7/18) av pasientene hadde en total poengsum 4, mens 61% (11/18) av pasientene oppviste lav immunoreaktivitet. Tilsvarende var det en statistisk signifikant korrelasjon mellom H3 acetylering og ekspresjon av RARβ2, E-cadherin, og β-catenin (r = 0,560, r = 0,731, og r = 0,733, henholdsvis
P
0,01) (figur 1B).
HDAC hemmere i kombinasjon med Atrå gjenopprette RARβ2 uttrykk gjennom RARβ2-RARE
Som vist i figur 2A, den HDAC hemmer Saha (i tråd med vår tidligere arbeid på VPA [19]) alene eller i kombinasjon med ATRA sterkt indusert hyperacetylation av histon H3 og gjenopprettet RARβ2 ekspresjon i livmorhalskreft cellelinjer. For ytterligere å forstå mekanismen for histon acetylering-indusert re-ekspresjon av RARβ2, utførte vi en chip analyse ved bruk av et anti-H3K9ac-antistoff for å bestemme bindingen av acetylert histon H3 til den RARβ2 promoter region (-168 /+ 22), som inkluderer kjerneområdet av RARE (-55 /-35) og TATA-boksen (figur 2B). Den hyperacetylation av lysin 9 på histon H3 (H3K9ac) er vanligvis forbundet med aktivt å transkriberte gener [23]. Sammenlignet med kontrollgruppen, Siha celler behandlet med HDAC-inhibitorer (10 umol /L Saha eller 3 mmol /l VPA) alene i 48 timer viste en signifikant økning i anriking av RARβ2-RARE basert på semi-kvantitativ (figur 2C) og real-time PCR (figur 2D). Effekten var størst når cellene ble behandlet med både HDAC-inhibitorer og ATRA (1 pmol /L). Dette kombinert behandling var mer effektiv på å indusere histone acetylering på RARβ2-RARE regionen enn noen enkelt medikament. Disse resultatene indikerer at RARE i RARβ2 promoter er funksjonell og at histone acetylering på RARβ2-RARE region er nært korrelert med RARβ2 re-uttrykk i livmorhalskreftceller.
(A) Saha (10 mikromol /L ) behandling for 48 timer, enten alene eller i kombinasjon med ATRA (1 mikromol /L), sterkt indusert hyperacetylation av histon H3 og restaurert RARβ2 uttrykk i HeLa, Siha, CaSki, og C33A celler. (B) Skjematisk av RARβ2-promoter-regionen. De eksoner av RARβ2 er representert med svarte bokser. Pilen indikerer transkripsjonsstart stedet. PCR-regionen (-168 til 22) for chip-analysen inkluderte kjerneområdet av de sjeldne, TATA-boksen, og 22 bp av exon 1. (C) Representative ChIP-PCR data. PCR-produkter ble visualisert ved hjelp av en 1% agarosegel farget med etidiumbromid. (D) DNA-prøver fra den anti-H3K9ac IP samt inngangsmaterialet og mock immunoutfellingsstudier prøvene ble kvantifisert ved sanntids-PCR. Behandling med enten 10 mikromol /L Saha eller 3 mmol /L VPA ført til en betydelig økning i RARβ2-RARE berikelse. Den største økningen i RARβ2-RARE berikelse ble observert med kombinasjonsbehandling. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Kombinert behandling av VPA og Atrå hemmer utviklingen av tumorxenotransplantater avledet fra humane givere
Fire uker etter den opprinnelige implantasjon av livmorhalskreft avledet fra en human donor, ble tumor gjenkjennelig ved transplantasjonsstedet og fortsatte å vokse langsomt. En rask vekst ble observert i andre generasjon; det tok bare 2 uker for en merkbar xenograft å danne. Histologisk undersøkelse viste egenskaper som var meget lik de for den opprinnelige pasientens livmorhalskreft (figur 3D)
Når tumorene var håndgripelig, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper:. Kontrollen (bærer), VPA (300 mg /kg VPA), Atrå (Atrå 15 mg /kg), og kombinasjonen. De forskjellige behandlingene ble administrert daglig i 28 dager. Tumorvolumer og musevekt ble beregnet hver to dager. Kombinasjonen av VPA og ATRA merkbart hemmet veksten av tumor-xenografter lignet med hvert enkelt medikament eller kjøretøyet behandling (
P
0,05) (A). På dag 28 ble musene avlivet, og tumorxenografter ble høstet (B). Tumor masse data var i samsvar med tumorvolumer. Greater regresjon i tumorvekst ble observert for den kombinerte behandlingen enn for de enkeltlegemiddelmyndigheter (
P
0,05) (C). VPA og kombinasjonsbehandlingen særlig forbedret graden av histologiske differensiering. Individuelle kreftceller hadde rikelig eosinofil keratinized cytoplasma (piler), og mitotiske tallene var fraværende. De tumorxenotransplantater behandlet med kjøretøyet eller Atrå forble dårlig differensiert, lik den originale humane tumorer. Mitotiske figurer (piler) er vanlige i disse prøvene, og cytoplasma er eosinofil til amfofile, med minimal eller fraværende keratinisering (D). *
P
. 0,05, versus enkeltmedikament behandlede gruppen
For å bestemme effekten av VPA og Atrå på tumor xenograft vekst, dyr mottatt kjøretøy som kontroll, VPA (300 mg /kg /d ip), ATRA (15 mg /kg /d ig), eller kombinasjonsbehandling i 28 dager som tumorene ble etablert. Behandlingen har ikke åpenbar toksisitet i mus. Etter 28 dager var gjennomsnittlig tumorvolum for kombinasjonsbehandlingsgruppen var 66.84 ± 19.10 mm
3, mens tumorvolumet for mus behandlet med bærer, VPA, og ATRA var 316.65 ± 94.58 mm
3, 119,83 ± 7,74 mm
3, og 208.64 ± 76.61 mm
3, henholdsvis (figur 3A og B). I samsvar med tumorvolumdata, den gjennomsnittlige tumorvekt for kontrollgruppen var 0,99 ± 0,09 g, mens tumorvekter for VPA, ATRA, og kombinasjonen behandlingsgruppene var 0,402 ± 0,02 g, 0,618 ± 0,16 g, og 0,264 ± 0,09 g, respektivt (figur 3C). Disse data indikerer at xenotransplantater ble undertrykt av 59,39%, 37,58% og 73,33% (prosentandel av tumorvekst-inhibering,% TGI) for VPA, ATRA, og kombinerte behandlinger, respektivt (figur 3A). Dataene viser at kombinasjonen behandlingen resulterte i større vekst inhibering av tumorxenografter enn både enkeltmedikamentbehandling.
Viktigere er det histologiske utseende viste at VPA og kombinasjonsbehandling forbedret graden av histologiske differensiering i tumor xenotransplantater . Som vist i figur 3D, kreftceller fra xenotransplantater behandlet med VPA alene eller i kombinasjon med ATRA har rikelig eosinofil keratiniserte cytoplasma, mens mitotiske figurer er fraværende eller er angitt bare av og til. Imidlertid kreftceller i vev fra både kontroll- og ATRA-behandlede grupper ble dårlig differensiert. Mitotiske figurer var vanlige (2-4 per høyeffekts felt i kontrollgruppen, men ≤2 per høyeffekts-feltet i ATRA-behandlede gruppen), og cytoplasma var eosinofil til amfofile, mens keratinisering var minimal eller fraværende, lik den opprinnelige karsinom. Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved immunhistokjemisk farging for involucrin og loricrin (markører for terminal epitel differensiering) i vev fra tumorxenotransplantater (figur 4). Ekspresjonen av involucrin og loricrin ble indusert vesentlig i tumorer fra mus behandlet med VPA alene, sammenlignet med tumorene fra kontrollmusene og ATRA-behandlede mus. De største involucrin og loricrin ekspresjonsnivåene ble funnet i tumorer fra mus som var behandlet med kombinasjonen av legemidler. Celleproliferasjon ble evaluert ved Ki67 farging. Behandling med VPA i kombinasjon med ATRA førte til en betydelig reduksjon i Ki67-positive celler i forhold til VPA, ATRA, eller kjøretøy behandling (13,0%
vs
39,4, 71,2, og 78,6, respektivt;.
P
0,05) (figur 5B). I tillegg til å indusere differensiering, VPA også fremmer apoptose [24]. For å utforske denne effekten, utførte vi TUNEL flekker å evaluere apoptose i tumorxenotransplantater (figur 5A). I tumorer fra kontrollmus, antallet av apoptotiske celler var minimal (3,6 ± 1,14). Antallet av apoptotiske celler i tumorer fra ATRA-behandlede mus var ikke signifikant forskjellig fra de i mus behandlet med VPA alene eller kjøretøyet. Det var en signifikant økning i apoptotiske celler (20,60 ± 4,16) i kombinasjons-behandlede tumorer.
Behandling med VPA alene betydelig øket nivå av histon H3-acetylering, restaurert RARβ2 uttrykk, og induserte ekspresjon av terminalen differensiering markører involucrin og loricrin, mens behandling med kombinasjonen av VPA og Atrå ført til større effekt i reaktivere disse genene uttrykk sammenlignet med enten enkel behandling. Små positive celler ble observert i vev fra den ATRA-behandlede gruppen.
(A) Celle apoptose ble evaluert ved bruk av TUNEL-analysen. Apoptotiske celler (grønn) ble talt fra fluorescens bilder tatt fra 10 tilfeldige felt på 200 × forstørrelse. Behandling med en kombinasjon av VPA og ATRA betydelig økt apoptose i forhold til kjøretøyet eller enkeltmedikamentbehandling. (B) Celleformering ble evaluert ved hjelp av Ki67 farging. Fordelingen av Ki67-positive celler ble scoret av to forskere. En betydelig reduksjon i antallet Ki67-positive celler ble observert i tumorer behandlet med kombinasjonen av legemidler sammenlignet med VPA behandling alene. Det var bare litt reduksjon i antall Ki67-positive celler i ATRA behandlede gruppe sammenlignet med kontrollgruppen. *
P
0,05, **
P
0,01, versus kontrollgruppen
VPA og Atrå gjenopprette RARβ2 uttrykk via epigenetisk modifikasjon og sekvensielt. hemme tumorvekst ved å aktivere TSGs uttrykk
histon H3 acetylering status for tumorxenotransplantater ble bestemt ved hjelp av immunhistokjemi og Western blot analyse. Som vist i figurene 4 og 6, VPA behandling betydelig øket nivå av acetylert H3 sammenlignet med kontrollen og den ATRA gruppen. Når det kombineres med Atrå, viste VPA en tydelig additiv effekt i histone epigenetisk modifikasjon. For å undersøke effekten av disse reagensene på nivå av histon-acetylering ved RARβ2-promoter-regionen, ble en chip-målingen ble utført.
