Abstract
selenoprotein glutationperoksidase-2 (GPx2) ser ut til å ha en dobbel rolle i kreftutvikling. Mens det beskyttet mus fra kreft i tykktarmen i en modell av betennelse-utløst carcinogenese (azoxymethane og dekstran-natriumsulfat-behandling), det fremmet vekst av xenopodet tumorceller. Derfor, analyserte vi effekten av GPx2 i en musemodell for etterligning av sporadisk kolorektal kreft (bare azoxymethane-behandling). GPx2-knockout (KO) og villtype (WT) mus ble justert til en enten marginalt mangel (-se), tilstrekkelig (+ Se), eller supranutritional (++ Se) selen status og ble behandlet seks ganger med azoxymethane (AOM ) å indusere tumorutvikling. I -se og ++ Se-grupper, antall svulster var betydelig lavere i GPx2-KO enn i de respektive WT mus. På + Se dietten, ble antallet av dysplastiske krypter redusert i GPx2-KO mus. Dette kan forklares med mer basal og AOM-indusert apoptotisk celledød i GPx2-KO mus som eliminerer skadet eller pre-maligne epitelceller. I WT dysplastiske krypter GPx2 var oppregulert i forhold til normale krypter som kan være et forsøk på å undertrykke apoptose. I motsetning til i + Se-grupper kreft tallene var lik i begge genotyper men tumorstørrelse var større i GPx2-KO mus. Den sistnevnte var assosiert med en inflammatorisk og tumor-fremmende miljø som innlysende fra infiltrerte inflammatoriske celler i tarmslimhinnen til GPx2-KO mus selv uten noen behandling, og kjennetegnes som lav grad av betennelse. I WT mus antall tumorer hadde en tendens til å være lavest i + Se forhold til -se og ++ Se foring som indikerer at selen kan forsinke tumordannelse bare i tilstrekkelig status. I konklusjonen, rollen GPx2 og antagelig også av selen avhenger av kreft stadium og åpenbart på involvering av betennelse
Citation. Müller MF, Florian S, Pommer S, Osterhoff M, Esworthy RS, Chu FF , et al. (2013) Sletting av glutationperoksidase-2 hemmer Azoxymethane-Induced Colon Cancer Development. PLoS ONE åtte (8): e72055. doi: 10,1371 /journal.pone.0072055
Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore
mottatt: 03.06.2013; Godkjent: 08.07.2013; Publisert: 19 august 2013
Copyright: © 2013 Müller et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation (Br 778 /8-1). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i vestlige land. Epidemiologiske studier knyttet en sub-optimal selen status til en økt risiko for å utvikle CRC [1]. Dette er relevant for bestander utenfor Nord-Amerika som Europa, hvor gjennomsnittlig plasma nivåer selen er 90 mikrogram /L (anmeldt i [2]). Forskjeller i baseline plasma nivåer selen deltakende fag kan ha bidratt til de inkonsistente resultatene fra intervensjonsstudier gjennomført for å studere mulige anti-kreftfremkallende egenskaper selen tilskudd. Følgelig både Nutritional Prevention of Cancer (NPC) og selen og vitamin E Cancer Trial (VELG) viste at deltakerne kommer inn i studien med plasma nivåer selen av ≥120 mg /L ikke tjene tilskudd [2]. Siden selenoprotein P, det mest følsomme markør for selen status [3], er mettet ved 120 ug /l plasma selen, er det foreslått at ved å hindre Se-mediert kreft avhenger optimal selenoprotein uttrykk [2].
den selenoproteome består av proteiner kodet for av 25 gener hos mennesker [4]. Blant dem er fem selen avhengige hydroperoksid reduserende glutation peroksidase (gpx), nemlig GPx1-4 og GPx6. GPx1-4 er uttrykt i murine tarmepitelet [5], men bare GPx2 hovedsakelig er plassert ved bunnen krypten [6], [7], hvor også tarm stamceller bor. I tillegg er GPx2 sterkt uttrykt i kolorektale tumorer [6], [8], [9]. Rollen GPx2 under CRC utvikling er fortsatt uklart. På den ene siden, redusert GPx2 tumor tall i en betennelses utløst colon carcinogenesis modell etter påføring av azoxymethane (AOM) og dekstran-natriumsulfat (DSS) ved å virke anti-inflammatorisk [10]. Dette er konsistent med den spontane ileocolitis og tarmkreft i GPx1 /GPx2 dobbel-knockout mus [11], [12]. Begge kan bli nesten fullstendig reddet av en WT allel av GPx2 men ikke fra GPx1 [13]. På den annen side synes GPx2 å understøtte proliferasjon. Svulster som produseres av AOM /DSS behandling var mindre i GPx2-KO lignet med WT mus [10] som var tumorxenografter avledet fra GPx2-manglende HT-29-celler sammenlignet med kontrollceller [14]. I tillegg er GPx2 oppregulert ved β-catenin [7], [15] og ΔNp63 [16], både indusere spredning.
Formålet med denne studien var å analysere rollen GPx2 og selen i en modell hvor CRC induseres utelukkende av AOM, for derved å etterligne sporadisk colon carcinogenesis hos mennesker [17]. Tumorutviklingen ble overvåket i GPx2-KO og WT mus matet en moderat selen-mangel (-se), -adequate (+ Se) eller -supranutritional (++ Se) kosthold. Siden AOM induserer aktive mutasjoner i β-catenin (anmeldt i [18]), samlokalisering av kjernefysisk β-catenin og forbedret GPx2 uttrykk ble analysert.
Metoder
Dyr og eksperimentell design
C57BL /6J WT og GPx2-KO mus, generert som C57BL /6J; 129SV /J hybrid hadde blitt backcrossed til C57BL /6J mus i fem generasjoner [19] før vi går i studien som kullsøsken. Dyrene ble plassert i individuelt ventilerte bur under spesielle-patogen-frie forhold med en 12 h mørk-lys syklus og fri tilgang til mat og vann. Musene ble matet en torulagjær basert kosthold (No. C1045, Altromin, Lage, Tyskland) med en basal selen innhold på 0,054 mg per kg diett (-se). Se + og ++ Se-diettene ble produsert ved tilsetning av L (+) – selenomethionine (ACROS Organics, Geel, Belgia) for å nå en endelig selenkonsentrasjon på 0,15 mg (+ Se) og 0,6 mg (++ Se) pr kg diett, henholdsvis [20]. Seleninnholdet ble målt fluorimetrisk slik som tidligere beskrevet [21]. Weanling mus ble foret de eksperimentelle diettene i 4 uker for å justere selen status før AOM-behandling og deretter i løpet av eksperimentet (fig. 1A). 10 mg /kg kroppsvekt AOM (Sigma, Steinheim, Tyskland) eller et tilsvarende volum av saltvann (Sigma) ble injisert intraperitonealt en gang i uken i seks uker. Akutte virkninger av AOM ble analysert på 5 mus 8 timer etter den første injeksjonen AOM (kortsiktig eksperiment). Tumorer ble analysert 16 uker etter den siste injeksjonen AOM (langtidsforsøk). 20 AOM-behandlede og 10 saltvannsbehandlede mus per gruppe ble analysert for tumorigenesis og ytterligere 5 dyr ble anvendt for histologi. Studiene ble godkjent av statlige dyreetiske komité (MLUV 32-2347 /4 + 68). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Mus ble anestetisert med Isofluran® og avlivet ved cervikal dislokasjon. Miltvekt ble bestemt og vevsprøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C.
(A) Weanling mus ble foret med en eksperimentell diett som var enten selen-fattig (-SE), -adequate (+ Se) eller -supranutritional (++ Se) i minst 4 uker før AOM injeksjon. AOM ble injisert en gang i uken i seks uker, og musene ble avlivet 16 uker etter siste AOM injeksjon (langsiktig eksperiment). For å studere akutte AOM effekter, ble musene drept 8 timer etter den første injeksjonen AOM (kortsiktig eksperiment). (B) Total GPX-aktivitet ble bestemt for 8 timer etter en enkelt injeksjon saltvann (kontrollgrupper av den kortvarige forsøk) i jejunum og lever av GPx2-KO og WT mus. Verdier er gjennomsnitt + SD, n = 5. Betydningen ble beregnet ved hjelp av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test. *** P≤0.001 vs. WT,
# P≤0.05,
## P≤0.01, og
### P≤0.001 vs. + Se.
Histopatologi av tykktarmskreft og preneoplastiske lesjoner
for å identifisere svulster og preneoplastiske lesjoner ble kolon åpnet i lengderetningen, flat på filterpapir og fiksert i 4% fosfat-bufret formalin pH 7,0 (Roth, Karlsruhe, Tyskland). For identifisering av tumorer og avvikende krypt foci (ACF), ble tykktarm farget med 0,1% metylenblått [22]. Etterpå mucin utarmet foci (MDF) ble identifisert i den samme tykktarmen vev ved sekvensiell farging med høyt jern diamin (HID), og 1% Alcian blått (AB). Prøvene ble analysert ved hjelp av et stereomikroskop (Olympus SZH10, Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Plasseringen og diameteren av lesjoner og antall krypter innenfor en ACF eller MDF (krypt multiplisitet) ble registrert. Alle MDF består av mer enn to krypter og alle svulster ble skåret ut og verifisert av hematoxylin og eosin (H E). Farget seksjoner
Immunohistochemistry og histokjemi
kolon av fem AOM-behandlede dyr på lang sikt eksperiment ble framstilt som rullekake for immunhistokjemiske analyser. For å studere den korttidseffekten av AOM, immunhistokjemi (IHC) ble utført på den distale colon ifølge den beskrevne protokoll [20] med noen modifikasjoner. Formalin-fikserte kolon vev ble innleiret i parafin og tynne snitt (2 mikrometer). Etter rehydratisering, ble vevssnitt varmes i mikrobølgeovn i citratbuffer pH 6,0 (Dako, Glostrup, Danmark) for å hente antigener. Den endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert ved inkubering i 3% H
2o
2 og prøver ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Den primære antistoffer og deres fortynninger var: anti-β-catenin (# 610153, BD Transduksjon Laboratories ™, Lexington, KY, USA; 1:8.000), anti-ki-67 (M7249, Dako, 1:60), anti- prolifererende cell nuclear antigen (PCNA, # 2714-1, Epitomics, Burlingame, CA, USA, 1:20.000), anti-p53 (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle Upon Tyne, Storbritannia, 1:1.600), anti-GPx2 serum [23] (1:12.000), og anti-F4 /80 (MCA497, Serotec, Kidlington (Oxford), Storbritannia, 1:8.000). Sekundære antistoffer eller moduler (N-Histofine® Mousestain Kit, N-Histofine® Simple Stain mus MAX PO for musevev, anti-rotte eller anti-kanin, alt fra Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan), ble påført i 30 minutter ved værelses temperatur. Antistoff binding ble visualisert med diaminobenzidin (Dako). Immunoreaktivitets ble scoret i en blindet mote. Lengden på PCNA-positive sonen og total krypten lengde ble målt ved hjelp av Mirax Viewer programvare (versjon 1.12.22.0, Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland) fra 100 krypter per dyr. F4 /80-positive celler i lamina propria langs tverr seksjonert krypter ble scoret på 10 krypter pr dyr.
Kvantifisering av apoptotiske celler ble utført ved hjelp av morfologiske kriterier i Hematoxylin farget deler av den distale colon i 200 i lengderetningen åpnet krypter pr dyr som beskrevet [20]. For å identifisere MDF i vevssnitt, ble slimstoffer visualisert ved sekvensiell farging med 1% AB, pH 2,5 og Periodisk Acid-Schiff (PAS) og kontra med hematoksylin. Seriesnitt ble farget med PAS /AB, H E, β-catenin, ki-67, og GPx2 individuelt. β-catenin og GPx2 immunoreaktivitets ble scoret med hensyn til subcellulære lokalisering og posisjon i krypten. En forbedret immunoreaktivitet ble definert som enten en forbedret maksimal fargeintensitet i forhold til tilstøtende normalt vev eller en forstørrelse av det positive område i celler eller kryptene eller begge deler.
Total GPX aktivitet
GPX aktivitet var målt i en glutation reduktase-kombinert test [24] som ble endret for 96-brønners mikrotiterplater som beskrevet [20] med en plate absorbans leser (Synergy2 mikroplateleser, BioTek, Bad Friedrichs, Tyskland) ved 340 nm. Total GPX aktivitet ble beregnet ut fra mikromol NADPH forbruk per minutt i henhold til Lambert-Beer lov og uttrykt som mU /mg protein.
Statistical Analysis
Sammenligning av to grupper, signifikante forskjeller ble beregnet ved uparet Student t-test. For å sammenligne mer enn to grupper, to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-test ble brukt (GraphPad Prism® versjon 5.0, San Diego, CA, USA). Tumor forekomsten ble analysert med krysstabeller ved hjelp av Fishers eksakte test (SPSS, versjon 16, IBM). Å vurdere krefttall, ble krysstabeller beregnet for svulst forekomst vektet med svulst nummer. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
GPx2-KO mus utvikler Færre AOM-indusert svulster enn WT mus under begge, en Selen fattig og -supplemented. Diet
Etter å ha matet mus den -se og ++ Se-dietter, jejunal og lever GPX aktiviteten ble betydelig redusert og økt, henholdsvis i forhold til + Se-grupper (fig. 1B). Høyere GPX-aktivitet ble funnet i jejunum av GPx2-KO sammenlignet med WT mus for ++ Se diett (fig. 1B), antagelig forårsaket av en kompenserende oppregulering av GPx1 som vi tidligere beskrevet for ileum og colon [20]. Tarm lokalisering av GPx2 ble analysert ved IHC i kolon av WT mus (Fig. S1A). GPx2 var høyest på krypten baser og umulig å oppdage i den øvre tredjedel av krypter. Tilsvarende nivåer av GPx2-protein ble påvist i kolon av WT mus på + Se og ++ Se-dietter, mens GPx2 ekspresjon ble nedregulert på -se dietter.
For å teste effekten av en GPx2- KO på tumorutvikling, ble mus utfordret seks ganger med AOM og analysert 16 uker etter den siste applikasjonen AOM. Selv om svulsten forekomsten var ikke signifikant forskjellig mellom de eksperimentelle grupper, -se og ++ Se GPx2-KO mus hadde signifikant lavere kreft tall enn WT mus på de samme dietter (Fig. 2A). Mens tumor-tallene var tilsvarende lav i GPx2-KO mus uavhengig av selen status (-se: 5, + Se: 5, ++ Se: 3), tumor tall i WT mus var høyere i den -se og ++ Se-grupper enn i + Se gruppen (-se: 14 og ++ Se: 13 vs + Se: 7). Den selen status påvirket ikke svulst forekomst eller total svulst nummer. Alle tumorer ble ikke-invasive adenomer plassert fra den tverrgående kolon til rektum [25].
16 uker etter den siste injeksjonen AOM WT og GPx2-KO mus ble analysert for tumorforekomst og total tumor antall pr gruppe ( A) og for ACF består av 4 krypter (B) eller ≥4 krypter (C) av metylenblått farging. MDF (D) ble talt i HID /AB farget kolon. ACF og MDF tall vises som scatter dot tomter med gjennomsnittet. Tumor diameter er avbildet som boksen og whiskers fra minutter til maks (E). P-verdier for (A) ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test. For å teste betydning for total svulst antall, ble tumortilfeller vektet med svulst nummer. P-verdier for (B-E) ble beregnet ved anvendelse uparet t-test. * P≤0.05 og ** P≤0.01 vs. WT,
# P≤0.05 vs. -se. Ingen ACF, MDF eller svulster ble observert i saltvann behandlede kontroller (n = 10).
Vi kvantifisert ACF og MDF, som begge regnes som preneoplastiske markører [26]. Vi differensiert mellom ACF med en lav ( 4) og en høy (≥4) krypten mangfold fordi sistnevnte er ment å være en bedre biomarkør for kreftutvikling enn tidligere [26]. Tall fra ACF ble ikke påvirket av selen dietter (Fig. 2B og C). Mens -se WT mus tendens (p = 0,06) for å ha færre ACF med lav krypten mangfold enn respektive GPx2-KO mus (Fig. 2B), -se WT mus hadde betydelig mer ACF med høy krypten mangfold enn GPx2-KO mus (Fig . 2C). Vi har også kvantifisert MDF, som er kjennetegnet ved forandringer i den cellulære sammensetning av krypten inkludert tap av slimceller. I motsetning til ACF, MDF består alltid av dysplastiske krypter sannsynlig utvikle seg til svulster [26], [27]. Bare + Se WT mus hadde signifikant mer MDF i forhold til GPx2-KO-mus (fig. 2D) mens -se og ++ Se WT mus hadde flere svulster enn GPx2-KO-mus (fig. 2A). Derfor, i selen-dekningen forskjellen mellom genotypene ble bare detektert ved MDF nivå. Tumor tallene var like lav i begge genotyper henhold + Se som kan implisere at vilkårene for svulst utvikling var mer hensiktsmessig i -se og ++ Se WT grupper.
Tumor diameter ble målt som et parameter for tumorvekst. GPx2-KO og WT mus på -se og ++ Se-dietter hadde lignende tumorstørrelse, mens svulster var betydelig større i + Se GPx2-KO enn i + Se WT mus (Fig. 2E). ++ Se GPx2-KO mus hadde mindre svulster enn -se GPx2-KO mus. I WT grupper, gjorde kosten selen ikke signifikant påvirke størrelsen på svulsten.
GPx2 og β-catenin ble forhøyet i preneoplastiske lesjoner
GPx2 uttrykk øker spesielt i tidlige stadier av neoplastisk transformasjon i den menneskelige tarmen [6] som kan være mediert av β-catenin [7]. For å teste om GPx2 uttrykk er også økt i preneoplastiske lesjoner av AOM-behandlede mus, ble GPx2 analysert ved IHC i + Se WT mus 16 uker etter siste AOM søknaden. PAS /AB farging identifisert 67 MDF i fem mus. Seriesnitt ble farget for β-catenin, GPx2, og ki-67. p-catenin immunoreaktivitet ble øket i 85% (57/67) av MDF i forhold til det omgivende normalt vev i overensstemmelse med publiserte data [27]. GPx2 immunoreaktivitets ble økt i 67% (45/67) av MDF i forhold til normale krypter.
MDF ble videre karakterisert basert på deres grad av dysplasi og krypten mangfold for å avgjøre om GPx2 og β-catenin co-Localize . MDF med en mindre grad av dysplasi hadde en nesten normal krypt morfologi, en lav multiplisitet, det gjenstår noen slimceller (Fig. 3A-I), og en normal fordeling av ki-67-positive celler (Fig. 3A-IV). Disse MDF oppviste mer membran-lokaliserte β-catenin, noe som er hovedsakelig detektert i luminal del (Fig. 3A-II blå pil) av krypten eller i hele kryptene sammenlignet med normale krypter. GPx2 immunoreaktivitets ble noe økt i krypten base av de MDF i forhold til normale krypter og utvidet mot luminal side (Fig. 3A-III svart pil). Derfor, i MDF med mindre dysplasi GPx2 og β-catenin er forhøyet i ulike epitelceller.
Serie IHC farging av kolon sveitsiske ruller ble utført for PAS /AB, β-catenin, GPx2, og ki-67 i fem + Se WT mus 16 uker etter den siste AOM-behandling (A-C). Representative stainings av en MDF preget av en mindre grad av dysplasi og lav krypten mangfold (A), en MDF med avansert dysplasi og høyere mangfold (B), og en microadenoma (C). Blomstrende betennelse i AOM-behandlede, -se GPx2-KO mus ble identifisert ved PAS /AB, F4 /80, og H & Co. E farging (D). Miltvekt ble normalisert til kroppsvekt (E). Middel + SD, n = 10 i saltvann-behandlede og n = 20 i AOM-behandlede grupper. Betydning ble bestemt ved bruk av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test. * P≤0.05 vs. WT,
xP≤0.05 vs. saltvann.
MDF med avansert dysplasi ble preget av høyere mangfold, fortykket epitelceller, nesten fullstendig tap av slimceller, og forbedret ki-67-farging (fig. 3B-i og IV), og utviste både mer β-catenin og GPx2 immunoreaktivitet på hele krypten (fig. 3B-II og III). På cellenivå, GPx2 og β-catenin samlokalisert i midten av MDF med avansert dysplasi, noe som tyder på at høye nivåer av både proteiner var bare påvises i et bestemt område i krypten under en bestemt tid av dysplastiske transformasjon.
Videre er en microadenoma ble karakterisert ved kompslimcelle tap, forstyrret krypt-arkitektur (fig. 3C-i), massiv oppregulering av kjernefysiske og cytoplasmisk β-catenin (fig. 3C-II), og et høyt antall ki-67-positive celler (fig. 3C-IV). I denne konstruksjonen, ble GPx2 ekspresjon helt borte i området med forhøyet β-catenin, mens den forble oppregulert i mindre dedifferensierte liggende krypter (fig. 3C-II og III, pilhoder) med liknende egenskaper som MDF med fremskreden dysplasi.
AOM-behandlet Selen-fattige GPx2-KO mus utviklet en Florid betennelse i Colon
AOM-behandlet -se GPx2-KO mus utviklet en klar betennelse som strekker seg fra en moderat til en blomstrende tilstand , som ikke ble observert i andre grupper (fig. 3D). I den distale colon, betennelse var moderat som kjennetegnes av krypten degenerasjon, infiltrasjon av immunceller (vist med F4 /80-positive myeloide celler), og en økning i bindevevet. Ved begynnelsen av den tverrgående kolon en overlesset betennelse (Fig. 3D) med massiv immun celleinfiltrasjon ble observert. Crypt arkitektur ble forvrengt i de berørte områdene sannsynligvis på grunn av svikt i epiteliale cellefornyelse.
Et veletablert indikator for systemisk inflammasjon er milt vekt. Spleen vekt tendens til å bli økt i alle AOM-behandlede grupper (Fig. 3E) og var betydelig høyere i AOM-behandlede -se GPx2-KO mus enn i respektive WT mus. Dette samsvarer med colonic betennelse. På grunn av den massive forvrengning i epitelial morfologi, β-catenin og GPx2 samlokalisering i -se GPx2-KO mus kan ikke sammenlignes med de andre gruppene. Det ble ikke observert utilslørt forskjeller i dysplastiske strukturer eller tilsvarende β-catenin nivåer mellom + Se og ++ Se GPx2-KO og WT mus (data ikke vist).
AOM-behandling Økt celledød ved apoptose i epitelceller GPx2-KO mus
AOM er kjent for å indusere DNA alkylerings addukter som topp 8 timer etter sin søknad [28]. Evnen til å fjerne DNA-addukter av DNA-reparasjon eller p53-avhengig apoptose av de skadede celler er kritisk for forebygging av kreftutvikling [29]. Som tidligere rapportert, er antallet av apoptotiske celler ved krypten basen signifikant høyere i GPx2-KO lignet med WT mus og er doseavhengig redusert ved å øke selentilførsel [20]. Det er godt etablert at korttids AOM-behandling øker apoptose [28]. Vi telles apoptotiske celletall (Fig. 4A-D) og analysert nukleær lokalisering av p53 (fig. S1B og C) 8 timer etter injeksjonen AOM. Som forventet, ble nukleær farging av p53 ved krypten basen økte i alle AOM-behandlede mus (Fig. S1B og C), mens det var umulig å oppdage i mus uten AOM-behandling (fig. S1C). AOM modifiserte ikke GPX-aktivitet (data ikke vist) eller GPx2 ekspresjon i WT mus (Fig. S1A).
(A-D) til 8 timer etter AOM eller saltvann injeksjon, apoptotiske epitelceller ble tellet i 200 krypter per dyr ved hjelp av H-farget deler av den distale colon. Krypter ble delt inn i 4 kvartaler. Den første viser den øvre del av krypten og den fjerde krypten basen. Data er vist som middel + SD, n = 5. Betydningen ble bestemt ved bruk av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test. * P≤0.05, *** P≤0.001 vs. WT,
# P≤0.05,
## P≤0.01,
### P≤0.001 som angitt,
xxP≤0.05
xxxP≤0.001 vs. saltvann.
AOM-behandling påvirket ikke apoptotiske celle tall i luminal en
st krypten kvartal (fig. 4A) uavhengig av genotype eller selen status. GPx2-KO mus hadde signifikant flere AOM-induserte apoptotiske celler i -se og + Se-grupper av to
nd krypt fjerdedel (fig. 4B) og i den -se-gruppen i 3
rd krypt fjerdedel (Fig . 4C) enn respektive WT mus. I 4
th krypt kvartal, antall AOM-induserte apoptotiske celler var like høyt i begge genotyper (fig. 4D). Det økte antall apoptotiske celler ved krypten bunnen av ubehandlede GPx2-KO mus kan bli bekreftet (fig. 4D, saltløsning). I sammendraget, GPx2-KO mus hadde flere AOM-indusert apoptotiske celler enn WT mus som er spesielt plassert i midten av krypten, 2
nd og 3
rd krypten kvartal. Dermed AOM-initierte celler kan ha blitt eliminert mer effektivt i GPx2-KO mus som resulterer i utvikling av færre svulster.
Crypt Lengde og proliferativ Zone er Forstørret i Colon av GPx2-KO mus
for å analysere hvorvidt endringen i apoptotiske celler kan ytterligere påvirke morfologi av krypten, dens lengde og høyden av den proliferative PCNA-positive sone ble målt. Begge var signifikant økt i GPx2-KO mus uavhengig av selen status eller AOM-behandling (fig. 5). Utvidelsen av PCNA-positive sone vedvarte etter normalisering for krypt lengde (data ikke vist), noe som betyr at i GPx2-KO mus den proliferative sonen dekket ~ 10% mer av den totale krypten lengde enn i WT. Siden AOM bare induserer apoptose i prolifererende celler [28], AOM-indusert apoptotiske celler bør samlokalisert med proliferativ PCNA-positive celler. IHC for PCNA av GPx2-KO mus viste at de prolifererende celler ikke bare ligge i 4
th og 3
rd krypten kvart som observert i WT mus, men også i to
nd krypt fjerdedel (fig. 5B). Dette korrelert med flere apoptotiske celler i to
nd krypten kvartal i -se og + Se GPx2-KO mus (Fig. 4B).
Lengden krypter og PCNA-positive sone i distal kolon av GPx2-KO og WT mus matet de ulike selen dietter ble bestemt 8 timer etter en enkelt dose av AOM eller saltvann. (A) Lengden av PCNA-positive sone (grå farge) og PCNA fri sone (hvit farge) ble målt i den distale colon. Hele barer representerer total krypten lengde. Verdier er gjennomsnitt + SD, n = 5. Betydningen ble beregnet ved hjelp av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001 vs. WT. Symboler over de grå linjene viser forskjeller i PCNA-positive sonen. Symboler over de hvite linjene viser forskjeller i total krypten lengde. (B) Representant PCNA farging av saltvann behandlet, -se WT og GPx2-KO mus.
GPx2-KO mus er preget av en lav grad av tarmbetennelse
Tidligere analyser har vist at en dobbel knockout av GPx1 og GPx2 resulterer i spontan ileocolitis [11]. For å karakterisere den basale tarmbetennelse status hos ubehandlede GPx2-KO mus, F4 /80-positive myeloide celler invaderer lamina propria av kolonepitelet ble tellet. Genotype forskjellene var igjen høyest i -se grupper, redusert i + Se og forsvant i ++ Se grupper (Fig. 6A). I tillegg, -se GPx2-KO mus hadde flere CD3-positive T-celler i lamina propria enn WT mus (data ikke vist). Mens AOM-behandlet -se GPx2-KO mus utviklet et blomstrende betennelse med forstyrret krypten arkitektur (Fig. 3D), ubehandlet -se GPx2-KO mus viste mindre alvorlig betennelse og beholdt en intakt krypten morfologi (fig. 6B). I sammendraget, GPx2-KO mus utviklet en basal lavgradig betennelse, som var høyest i -se.
F4 /80-positive myeloide celler ble analysert i ubehandlede GPx2-KO og WT mus etter 7 uker på selen dietter. F4 /80-positive celler i lamina propria i tilknytning til en krypt ble tellet i tykktarmen (A). Midler + SD, n = 4. Representant F4 /80 farging av -se WT og GPx2-KO kolon (B). Betydning ble bestemt ved bruk av to-veis ANOVA med Bonferroni post-test. * P≤0.05, ** P≤0.01 vs. WT,
## P≤0.01 vs. -se.
Diskusjoner
Tumor Utvikling og Initiation
GPx2-KO mus utviklet færre svulster på -se eller ++ Se-dietter og færre MDF på + Se kosthold enn respektive WT mus (fig. 2A og D). Dette indikerer at GPx2-KO mus er mer motstandsdyktig mot AOM-indusert kreft. I kontrast, GPx2-KO mus utviklet flere svulster i et AOM /DSS-indusert tykktarmskreft modell [10], som korrelert med en mer alvorlig DSS-kolitt på GPx2 sletting. Således er anti-kreftfremkallende aktivitet av GPx2 i betennelse-utløste tykktarmskreft hovedsakelig forårsaket av sin anti-inflammatorisk rolle. Den pro-kreftfremkallende aktivitet av GPx2 etter AOM-behandling alene streker den avgjørende betydningen av DSS-kolitt som en svulst-pådriver i AOM /DSS modell. AOM induserer G /A basen konverteringer som i hovedsak fører til aktivering av mutasjoner i β-catenin. Disse mutasjonene er motvirket av forsvarsmekanismer inkludert DNA basen reparasjon eller apoptose. Derfor spiller apoptose en dominerende rolle i forebygging av AOM-indusert kreft. Ved 6-8 timer etter behandling AOM, krypten epitelceller gjennomgå apoptose i en p53-avhengig måte, [30], [31] (fig. S1B og C). Hvis skadede stamceller unngå apoptose, kan de produsere avvikende krypter, som kan utvikle seg til svulster [32]. Mus mangelfull i pro-apoptotiske gener som
p53 product: [33],
Bak product: [34], og
Puma product: [35] har høyere antall ACF eller svulster og en lavere rate av AOM-indusert apoptose.
Vi har vist her, og tidligere som GPx2 mangel øker basal apoptose rate i krypten baser av tarmepitelet uavhengig av selen status, selv om de fleste tydeligvis i -se tilstand (fig . 4D, saltløsning) [20]. Et annet trekk ved den GPx2-KO tarmepitelet er et forstørret spredningssone (fig. 5), som antagelig er et forsøk på å motvirke apoptotisk celle tap. 8 timer etter AOM-behandling, ble flere AOM-indusert apoptotiske celler telles i midten av krypten region (2
nd og 3
rd krypten kvartal, Fig. 4B og C) av -se og + Se GPx2- KO sammenlignet med WT mus. Bare GPx2-KO mus har et høyere antall prolifererende celler i denne regionen. Høyere nivåer av basal og AOM-indusert apoptose i GPx2-KO mus er ment å effektivt eliminere AOM-initierte celler. I WT mus, er dysplastiske krypter preget av økte GPx2 nivåer (Fig. 3A og B) som antagelig undertrykker apoptose. I GPx2-KO dysplastiske krypter en økt hastighet på apoptose kan motvirke ondartet progresjon. Basert på disse resultatene, GPx2 åpenbart er i stand til å forbedre kreftutvikling ved å undertrykke apoptose som ellers eliminerer skadet eller transformerte celler.
tumorstørrelse og Promotion
Uventet, svulster var større i + Se GPx2- KO enn i WT mus (fig. 2E). Dette passer ikke med pro-proliferative funksjon av GPx2 som postulerte fra en xenograft modell med siRNA-mediert knockdown av GPx2 [14] og AOM /DSS-behandlet GPx2-KO mus [10], noe som ville ha resultert i større svulster i WT i stedet for i den GPx2-KO. I denne studien, tumorstørrelse var like i -se og + Se-GPx2-KO mus og betydelig redusert med ++ Se (Fig. 2E). Dette korrelert med mengden av infiltrerte inflammatoriske celler (fig. 6) i det ubehandlede GPx2-KO colon, som bare ble økt i -se og + Se, men ikke i ++ Se GPx2-KO sammenlignet med WT mus. Mus som mangler både GPx1 og GPx2 spontant utvikle ileocolitis [11] og DSS-indusert kolitt er mer alvorlig hos mus som mangler GPx2 [10]. Her viser vi at ubestridt GPx2-KO mus har en lav grad av kolitt, karakterisert ved øket miltvekt (fig. 3E), infiltrering av inflammatoriske celler (fig. 6), og krypt forlengelse (Fig. 5A). I tillegg ble plasma TNFa nivåene økt i + Se GPx2-KO mus (upublisert observasjon).
