Abstract
Bakgrunn
Kreft er forårsaket av somatiske DNA-forandringer som genet punktmutasjoner, DNA kopi nummer avvik (CNA) og strukturelle varianter (SVS). Genom-wide analyser av SVs i stort utvalg serie med veldokumentert klinisk informasjon er fortsatt mangelvare. Dermed forblir effekten av SVs om kreftutvikling og pasient utfall dårlig forstått. Denne studien hadde som mål å utføre en systematisk analyse av gener som påvirkes av CNA-forbundet kromosom pauser i tykk- og endetarmskreft (CRC) og for å bestemme den kliniske relevansen av tilbakevendende stoppunkt gener.
Metoder
Primær CRC prøver av pasienter med metastatisk sykdom fra Kairo og CAIRO2 kliniske studier ble tidligere preget av matrise-komparativ genomisk hybridisering. Disse data ble nå anvendt for å bestemme forekomsten av CNA-tilknyttede leiligheter kromosomale gener innenfor tvers 352 CRC prøver. I tillegg mutasjon status for ofte påvirket
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF Hotell og
NRAS
gener ble bestemt for 204 CRC prøver av målrettet massiv parallell sekvensering. Klinisk relevans ble vurdert ved stratifisering av pasienter basert på genmutasjoner og gen stoppunkter som ble observert i . 3% av CRC tilfeller
Resultater
I alt 748 gener ble identifisert som var recurrently påvirket av kromosom pauser (FDR 0,1).
MACROD2
ble påvirket i 41% av CRC prøver og en annen 169 gener viste svake punktene i 3% av tilfellene, noe som indikerer at forekomsten av genet stoppunkter er sammenlignbar med forekomsten av kjente genet punktmutasjoner. Pasientutvelgelse basert på genet stoppunkter og punktmutasjoner avslørte en CRC subtype med svært dårlig prognose.
Konklusjoner
Vi konkluderer med at CNA-forbundet kromosomale pauser i genene representerer en svært utbredt og klinisk relevant undergruppe av SVs i CRC
Citation. van den Broek E, Dijkstra MJJ, Krijgsman O, Sie D, Haan JC, Traets JJH, et al. (2015) Høy utbredelse og klinisk relevans av gener påvirket av Kromosom Brudd i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (9): e0138141. doi: 10,1371 /journal.pone.0138141
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN
mottatt: 5 mars 2015; Godkjent: 25 august 2015; Publisert: 16.09.2015
Copyright: © 2015 van den Broek et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Array-CGH data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO tiltredelse antall GSE63216; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)
Finansiering:. Denne studien ble finansiert med tilskudd fra VUmc -Cancer Center Amsterdam (E. van den Broek) og den nederlandske Cancer Society (KWF-2007-3832), og utføres innenfor rammen av Senter for translasjonell molekylærmedisin, dekode prosjekt (tilskudd 03O-101) og den nederlandske tykktarmskreft Group (DCCG). Disse organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, dataanalyse, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Kreft er forårsaket av genomiske avvik som driver tumor initiering og progresjon. Onkogen aktivering og tumor suppressor genet inaktivering kan være forårsaket av flere klasser av somatiske DNA avvik, inkludert ikke-synonyme (punkt) mutasjoner, kromosom kopi nummer avvik (CNAS) og strukturelle varianter (SVS) [1]. SVs representerer slettinger, innsettinger, inversjoner, og intra- og inter-translokasjon, som alle involverer kromosom pauser [2]. Interessant, mens punktmutasjoner og DNA kopinummerendringer er kontrollert omfattende, effekten av gener med kromosom pauser er dårlig karakterisert. Tar kolorektalcancer (CRC) som et eksempel, for å date flere i-frame fusion gener har blitt rapportert inkludert
VTI1A-TCF7L2
,
NAV2-TCF7L1 Hotell og R-spondin fusjoner
PTPRK-RSPO3 Hotell og
EIF3E-RSPO2 product: [3-5]. R-spondin fusjoner aktivere Wnt signalveien og er gjensidig utelukkende med
APC
mutasjoner, noe som indikerer at disse trans forårsake gain-of-funksjon protein endringer. Alternativt kan SVs også føre til tap-av-funksjon endringer. For eksempel sletting av stoppkodonet av
EpCAM
genet resulterer i en transkripsjonen gjennomlesning som forårsaker hypermethylation og dermed stanse av tilstøtende misparringssystemet
MSH2 product: [6]. Men til tross for disse spennende eksemplene grundig undersøkelse av SVs i CRC har vært hemmet av mangel på hele genomet dyp sekvense informasjon om store serier av prøver. Følgelig er den antatte virkningen av SVs i (kolorektal) svulst utvikling trolig sterkt undervurdert.
Vi har tidligere utført matrise-komparativ genomisk hybridisering (matrise-CGH) analyse høy oppløsning på en serie på ca 350 primær CRC prøver fra pasienter som hadde utviklet metastatisk sykdom og deltok i Kairo og CAIRO2 fase III kliniske studier [7-9]. I denne studien har vi brukt disse dataene for å avgjøre de genomiske posisjonene kromosomstoppunkter, basert på antagelsen om at intra-kromosomforandringer i CNA-status kan bare forklares med mekanismer som involverer kromosom pauser. Selv om en slik analyse ikke gir en helhetlig oversikt over SVs i kreftgenomet, hypotese vi at denne analysen vil identifisere en betydelig undergruppe av SVs i tilstrekkelig oppløsning til å bevilge kromosom pauser for å genet stillinger. Videre forventet vi at ikke-tilfeldige tilbakevendende hendelser blant CRC prøvene vil avsløre gener som øker kreftutvikling. Her viser vi at denne tilnærmingen viste 748 tilbakevendende stoppunkt gener og demonstrere deres innvirkning på CRC klassifisering.
Materialer og metoder
Kopier nummer aberrasjon-forbundet kromosomstoppunkt deteksjon
Pasienter valgt for denne studien deltok i en av de to multisenter fase III studier av den nederlandske Colorectal Cancer Gruppe (DCCG), nemlig KAIRO (CKTO 2002-07, ClinicalTrials.gov, NCT00312000) og CAIRO2 (CKTO 2005-02, ClinicalTrials.gov ; NCT00208546). De to randomiserte kliniske studier ble godkjent av komiteen for Human-relatert forskning Arnhem-Nijmegen og ved de lokale institusjonelle gjennomgang boards. Den skriftlig informert samtykke er nødvendig for alle pasienter før studiestart også inkludert translasjonsforskning på svulstvev. CNA-forbundet kromosomstoppunkt deteksjon ble utført over 352 CRC prøver. Array-CGH data ble tidligere innhentet ved hjelp av DNA isolert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) primære svulster og pasient matchet normale par vev [9]. De 4548 sonder som hadde blitt lagt til berike til dekning av 238 Cancer Census gener ble nå ekskludert for kromosomstoppunkt analyse, forlater 168823 sonder som ble jevnt fordelt over hele genomet på ca 17kb intervaller (S1 Table). Genomiske probe stillinger var basert på menneskelige genom NCBI Build36 /hg18. Array-CGH data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO tiltredelse antall GSE63216). DNA-kopitall segmenter ble definert ved R-pakken «DNAcopy» (versjon 1.36.0) og ble avgrenset av den første og siste sonde av segmentet [10]. Kromosomstoppunkter ble definert av de genomiske start- posisjoner av DNA-kopi antall segmenter (fig 1B) med unntak av den første DNA-segment av hvert kromosom og av brytningspunkt mellom to kopitall nøytrale regionene som definert ved R-pakken «CGHcall» (versjon 2.17.6) [11]. For å oppdage gener som ble berørt av CNA-forbundet kromosomale pauser, ble stoppunkter tilordnet genet merknader basert på menneskelig referanse genom hg18 /Ensembl54.
(A) Array-CGH DNA kopier antall profilen til en CRC prøven. X-aksen viser kromosomer 1-22 og X (nummerert 23) med kromosom grenser som er angitt ved hjelp av vertikale stiplede linjer. Y-aksen viser log2 forholdet mellom mengden av svulst DNA
versus
pasient-matchet normal DNA. Svarte prikker representerer individuelle matrise-CGH probe datapunkter. De blå horisontale linjene representerer DNA-segmenter, veiledende for svulst DNA kopi nummer avvik når som avviker fra 0. Den grønne pilen og bar indikerer regionen av kromosom 6 som er markert i figur 1B. (B) Forstørrelse av figur 1A (grønn strek). Vertikal prikkete røde linjene indikerer genomiske steder av CNA-forbundet kromosomale brytningspunkt,
i
.
e
. de genomiske posisjoner hvor log2 prosenter av DNA-segmenter endring. (C) Frekvens plott av CNA-assosierte kromosomale brytningspunkt på q-armen av kromosom 13. X-aksen viser den genomiske posisjon i Mb. Y-aksen viser de kromosomstoppunkt frekvenser over kohort av 352 CRC prøver. Stoppunkt frekvenser er angitt på rekke-CGH probe-nivå (vertikale svarte striper) og på gen-nivå (horisontale røde søyler). Tilbakevendende stoppunkt gener (FDR 0,1) er navngitt. Den grønne pilen og bar indikere
PIBF1
region av kromosom 13q som er markert i figur 1D. (D) Forstørrelse av figur 1C (grønn strek), som illustrerer at
PIBF1
gen stoppunkter er konsentrert i den distale delen av genet. Nabo gener som ikke havna betydelige stoppunkt gjentakelse priser er angitt i blått.
Statistisk analyse av kromosomstoppunkt deteksjon
En dedikert statistisk signifikans analyse ble utviklet for genet baserte kromosomstoppunkt analyse, som består av tre trinn. Først per array-CGH profil referanse sannsynligheten for et stoppunkt forekommer i et gen som tilfeldig ble bestemt, og står for antall knekkpunkter i en profil, gen lengde av gen-assosierte sonde dekning og antallet gen-assosierte prober ved anvendelse av en logistisk regresjon. For det andre, ble teststatistikken er definert som antall profiler med minst en stoppunkt i et gitt gen. Deretter en
P
-verdi ble beregnet fra null-fordeling av testobservatoren. Denne null-fordelingen var en konvolusjon (i løpet av uavhengige profiler) av Bernoulli tilfeldige variabler med gen- og profilspesifikk «suksess (= knekkpunkt) sannsynlighet «. Tredje, til alle
P
-verdier på søkerstoppunkt gener, multippel testing ble brukt av en dedikert Benjamini-Hochberg-type FDR korreksjon [12]. Denne korreksjonen står for discreteness av null-distribusjon. Sonden baserte kromosomstoppunkt statistisk analyse ble utført under forutsetning av at per array-CGH profil sannsynligheten for å være en CNA-forbundet stoppunkt sonde er lik på tvers av sonder. I dette tilfellet er den dedikerte Benjamini-Hochberg-type FDR korreksjon er ekvivalent med den standard Benjamini-Hochberg FDR korreksjon, fordi, i motsetning til genene, alle probene samsvarer med den samme null-fordeling. FDR mindre enn 0,1 ble betraktet som signifikant.
genmutasjon analyse
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF Hotell og
NRAS
er gener med en publisert mutasjon utbredelsen i CRC på ca 3% eller mer [4]. FFPE DNA-prøver ble analysert ved neste generasjons sekvensering ved hjelp av TruSeq Amplicon Cancer Panel (TSACP, Illumina Inc, San Diego, CA USA). Genmutasjon status ble bestemt ved å bruke den varianten som ringer rørledningen «Falco» [13]. Leser ble justert til den menneskelige referansen genom (NCBI Build37 /hg19) og varianter ble kommentert til dbSNP oppføringer (bygge 137). Mutasjoner ble kalt da den kommenterte varianten ble observert i minst 20% av den leser og ble utpekt som en ikke-synonymt aberrasjon.
Nettverk Basert Stratifisering
NBS ble brukt til å klynge CRC prøver, mens blant annet informasjon fra genet stoppunkt og genmutasjon molekylære interaksjoner [14]. Grunnlags clinicopathological karakteristikker av CRC prøver (n = 203, se S5 tabell) var lik serien analyseres ved Haan et al. [9].
SMAD4
genet kjøpt både stoppunkter og mutasjoner, som ble slått sammen for NBS analyse. For nettforplantningstrinnet det forhåndsdefinerte STRING humane protein interaksjon nettverk ble anvendt som fulgte med NBS fordeling. NBS parametre ble satt til standardverdier med unntak av
k Hotell som ble satt til 4. Bruk av sample-likhetsmatrise fra NBS ble prøver tildelt CRC undergrupper av gjennomsnittlig kobling hierarkisk clustering. CRC pasienter ble gruppert i fire CRC subtyper og OS priser ble visualisert ved Kaplan-Meier-kurver og tilsvarende
P
-verdier ble beregnet ved log-rank test.
CRC subtype-forbundet gener
NBS gir ikke nettverksbaserte genet aberrasjon poenger som standard ut. Derfor, for å finne ut hva gener var signifikant assosiert med en bestemt CRC subtype, nettverksbaserte genet aberrasjon score for hvert gen per prøve ble trukket ut som følger. Først, for hver NBS køyring
i
av totalt
n
gjentakelser (n = 1000) inngangs matriser
V
i
var rekonstruert fra faktor matriser
W
i
og
H
i
som ble oppnådd i løpet av ikke-negative matrise faktorisering Fremgangsmåte:
de matriser,
V
i
, representerer de data som brukes av NBS å bestemme prøven clustering for hver iterasjon. Et gjennomsnitt vektor av nettverksbaserte genet aberrasjon score,
R
s
ble nå oppnådd for hver prøve
s
av gjennomsnitt over inngangs matriser
V
i
over alt
n
gjentakelser:
Her
V
er
er raden fra
V
s Hotell som tilsvarer prøve
s
i iterasjon
i
.
C
s
er en normaliseringsfaktor, definert som antall gjentakelser der en prøve
s
ble valgt for clustering. Merk at dersom en prøve ikke ble valgt under clustering alle
V
er
verdiene er satt til null. Mann-Whitney U tester ble utført i løpet av de gjennomsnittlige nettverksbaserte gen-aberrasjon score for å teste om et bestemt gen bidro til dannelsen av en CRC subtype. For hvert gen disse
R
s
score ble gruppert i henhold til Barnekonvensjonen subtype å bestemme
P
-verdier, som indikerer om et gen bidratt vesentlig til dannelsen av en bestemt CRC subtype.
Multi Dendrix
data~~POS=TRUNC inngang for Multi-Dendrix analysen var identisk med data input som brukes for NBS analyse, med unntak av gener som delte de samme stoppunkter, som ble nå samlet i «bassenger» (S8 Table). Multi-Dendrix parametre ble satt til k7t7s11 [15].
Resultater
Påvisning av tilbakevendende stoppunkt gener
kromosom CNA status på 352 primær avanserte CRC prøvene ble bestemt ved hjelp av 180k Agilent arrays som dekker genomet med en gjennomsnittlig sondeavstand på omtrent 17kb, som tidligere beskrevet [9]. Etter DNA-kopi antall segmentering, ble de genomiske plasseringen av forandringer i DNA-kopi antall status nå brukes til å estimere posisjonen av CNA-assosierte kromosomale brytningspunkt (figur 1A og 1B). Statistisk evaluering ga 1605 genomiske stoppunkt steder med tilbakefall i flere CRC prøver (FDR 0,1; S1 Table), noe som indikerer at plasseringen av CNA-assosiert pauser er ofte ikke-tilfeldig. Når gruppering stoppunkter av genet påvirket, ble totalt 748 tilbakevendende stoppunkt gener identifisert (FDR 0,1; S2 tabell). Genomet fordeling og forekomst av kromosomstoppunkter på q-arm av kromosom 13 er gitt i figur 1C og for alle andre kromosomer i S1 Fig.
Genet med høyest forekomst av kromosomstoppunkter var
MACROD2
, som ble rammet i 40,9% av CRC prøver. En annen 169 tilbakevendende stoppunkt gener ble påvirket i . 3% av avanserte CRC prøver, tilsvarende mutasjon frekvenser av vanlige berørte onkogener og tumorsuppressorgener (fig 2)
Gene stoppunkt frekvenser (røde søyler) var basert på analyse av 352 CRC prøver og genmutasjon frekvenser (blå søyler) på analyse av 204 prøver. Gener merket med «*» indikerer en pool av gener som deler probe (er) forbundet med kromosomstoppunkter:
PCMTD2 *
bassenget inkluderer også
LINC00266-1; PARK2 *
inkluderer også
PACRG
;
ZNF337 *
inkluderer også
NCOR1P1
,
FAM182A
,
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
CD99 *
inkluderer også
XG
;
PARP8 *
inkluderer også
EMB
.
Klinisk relevans av tilbakevendende stoppunkt gener
Tilbakevendende stoppunkt gener kan representere genomiske regioner som er utsatt for kromosomale pauser,
i
.
e
. en epiphenomenon forbundet med CNAs. Alternativt kan tilbakevendende stoppunkt gener drive kreft og gjennomgå positiv seleksjon under tumorgenese, og følgelig påvirke klinisk resultat for eksempel pasient total overlevelse (OS). Derfor, for hver av de tilbakevendende stoppunkt gener som ble identifisert, ble operativsystemet til undergruppen av pasienter med den aktuelle genet stoppunkt i forhold til undergruppen av pasienter uten at stoppunkt. Ingen av de enkelte tilbakevendende stoppunkt gener ble signifikant assosiert med OS (log-rank
P
-verdier fulgt av Bonferroni korreksjon for multippel testing, data ikke vist).
Kreft-relatert biologiske prosesser er kompleks og styres av den felles virkning av multiple gener. Av den grunn vi utført en kombinert analyse av de 170 mest utbredte ( 3%) tilbakevendende stoppunkt gener som er beskrevet ovenfor, og genmutasjon status for viktige kreftgener. Ved hjelp av DNA isolert fra formalinfiksert parafin-embedded arkiv vev, mutasjonsstatus av
TP53
,
APC
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF Hotell og
NRAS
ble bestemt av målrettet neste generasjons sekvensering, som lyktes for 204 CRC prøver (figur 2, S3 og S4 tabeller). Som ett tilfelle manglet stoppunkter og mutasjoner for utvalgte gener, 203 tilfellene var tilgjengelig for å gi både gen stoppunkt og genmutasjon data som input for nettverksbasert Stratifisering (NBS) [14]. NBS ble brukt til å forplante sparsom genet stoppunkt og genmutasjon hendelser til den forhåndsdefinerte protein interaksjon nettverk STRING fulgt av gruppering av pasienter i CRC subtyper basert på de aktuelle under nettverk [14]. Denne analysen viste fire CRC-undertyper (figur 3A og S6 Table). Baseline clinicopathological pasientkarakteristika var svært sammenlignbare på tvers av de fire CRC undergrupper (en-side Fisher Exact test; S5 Table). OS analyse viste signifikante forskjeller mellom disse subtypene (log-rank
P
= 0,001; figur 3B), med CRC subtype 3 har en vesentlig dårligere OS enn de andre tre CRC undergrupper (HR = 2,17, log-rank
P
= 0,0002; figur 3C), med 218 dager forskjell i median total overlevelse
(A) Co-clustering matrise av CRC prøver generert av NBS analyse.. Matrisen fargeintensitet representerer likheten poengsum. Fargen bar på toppen indikerer pasientgrupper knyttet til de fire CRC undergrupper (k = 4) som bestemmes av hierarkisk clustering etter NBS analyse. (B) Kaplan-Meier plott for total overlevelse (i dager) av CRC subtype 1 (n = 80 pasienter), subtype 2 (n = 45 pasienter), subtype 3 (n = 27 pasienter) og subtype 4 (n = 51 pasienter ). Det er betydelige forskjeller i OS blant de fire CRC undergrupper (log-rank
P
= 0,001), med dårligst OS for subtype 3 CRC pasienter. (C) Kaplan-Meier plott for OS av CRC subtype 3 pasienter
versus
pasienter i andre CRC subtyper, viser en hazard ratio (HR) på 2,17 og en median OS av 392 dager
versus
610 dager, henholdsvis (log-rank
P
= 0,0002).
Når videre utforsking av nettverk knyttet til denne CRC klassifisering, de fleste av de medvirkende genene viste seg å være tilbakevendende stoppunkt gener supplert med noen av de vanlige muterte CRC-onkogener og tumorsuppressorgener (S7 Table). På et individuelt gen nivå innenfor de identifiserte CRC subtype knyttet gener, dårlig prognostisk CRC subtype 3 var
en
.
o
. beriket for genet punktmutasjoner i
BRAF plakater (tosidig Fisher Exact test:
P
0,0001) og
FBXW7 product: (
P
= 0.01 ), og for genet svake punktene i
WWOX product: (
P
0,0001),
FHIT product: (
P
0,0001), og
PIBF1 product: (
P
= 0,03). Fordi mutasjoner i
BRAF
er ofte forbundet med mikro ustabil (MSI) svulster [16] undersøkte vi fordelingen av MSI prøver på tvers av de fire CRC subtyper. Interessant, åtte av ti MSI prøver i denne gruppen av 203 CRC var i subtype 3 (tosidig Fisher Exact test:
P
0,0001, S5 tabell). Samlet utgjør disse dataene indikerer at CNA-forbundet tilbakevendende stoppunkt gener er klinisk relevante som de bidrar til CRC klassifisering av undergrupper med prognostisk verdi.
Biologisk relevansen av tilbakevendende stoppunkt gener
For ytterligere å undersøke om tilbakevendende stoppunkt gener kan drive CRC utvikling, ble Multi-Dendrix algoritme brukes til å identifisere onkogene veier eller genet moduler basert på to kriterier, nemlig: 1) hendelsene i en modul må være gjensidig utelukkende, og 2) disse hendelsene skal dekke nesten alle kreftprøver undersøkt [15]. Inngangsdata for denne analysen var identisk med den for NBS,
i
.
e
. den genmutasjon status åtte vanligvis berørt CRC gener og stoppunkt status av de 170 mest utbredte ( 3%) tilbakevendende stoppunkt gener fra 203 CRC prøver. Denne analysen avslørte fire forskjellige gen moduler, tre moduler som inneholder både genmutasjoner og gen stoppunkter og en modul som blir helt består av tilbakevendende stoppunkt gener (figur 4). Det ble ikke observert den sterkeste gjensidig eksklusivitet mellom
TP53
mutasjoner og
PIBF1
stoppunkter, et gen som stoppunkter var mest utbredt i CRC subtype 3 som viste dårligst prognose. Den genomisk plasseringen av
PIBF1
på q-arm av kromosom 13 er markert i figur 1D, illustrerer anrikning av genet stoppunkter i den distale del av dette genet. Videre også
MACROD2
,
PPP1R12B
,
AKAP13
,
ERGIC1
,
PTPRT
,
SLC22A5
HIST1H1A
,
bilsportforbund
, og
ROCK1
stoppunkt gener ble representert i en av genet moduler, og bidro til CRC subtype klassifisering (fig 4 og S7 tabell). Disse dataene antyder at flere tilbakevendende stoppunkt gener spiller en viktig biologisk rolle i CRC utvikling.
Nodene omfatter både gene stoppunkter (rød kontur) og genmutasjoner (blått omriss). Kanter (grå linjer) koble gener som er gjensidig utelukkende rammet. Tykkelsen av de grå linjer, og det tilsvarende tall reflektere robusthet stillingen. Den sterkeste gjensidig eksklusivitet er observert mellom
PIBF1 Hotell og
TP53
. Gener merket med «*» indikerer en pool av gener som deler probe (er) forbundet med kromosomstoppunkter:
ZNF337 *
bassenget inkluderer også
NCOR1P1
,
FAM182A
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
ZNF519 *
inkluderer også
ANKRD20A5P
,
ANKRD30B
.
Diskusjoner
Molekylær karakterisering av somatiske DNA avvik er et nyttig strategi for å hjelpe prognose og terapi prediksjon av enkeltpasienter. Mens analysen av ikke-synonyme punktmutasjoner i vanlig muterte kreftgener og bestemmelse av kromosom CNAs har blitt standard praksis for å karakterisere tumorprøver, er storskala genom-wide detaljert analyse av SVs fortsatt i sin barndom. Vi her vist at CNA profiler tillater å påvise gener hvis funksjon kan påvirkes av CNA-forbundet kromosom pauser. Totalt 748 tilbakevendende stoppunkt gener ble identifisert basert på analyse av en stor serie (n = 352) av høy oppløsning matrise-CGH prøver av primære svulster fra pasienter som deltok i to fase III kliniske studier av metastatisk CRC. I tillegg til sin overflod også utbredelsen av tilbakevendende stoppunkt gener var relativt høy, med 170 gener blir påvirket av kromosomale pauser i mer enn 3% av krefttilfellene. Som sådan, er utbredelsen av gener som påvirkes av CNA-forbundet kromosom pauser kan sammenlignes med utbredelsen av punktmutasjoner i velkjent og ofte påvirket CRC onkogener og tumorsuppressorgener (fig 2).
En av de viktigste spørsmål vi som mål å ta opp er om kromosom pauser i genene er bare en epiphenomenon assosiert med kromosom ustabilitet eller om tilbakevendende stoppunkt genene representerer kreft drivere med biologisk og klinisk relevans. Mens ingen av de enkelte tilbakevendende stoppunkt gener viste signifikante effekter på OS, forplantning av de 170 mest utbredte stoppunkt gener i kombinasjon med åtte vanlige muterte gener på en forhåndsdefinert nettverk lov til å klassifisere CRC inn i fire undergrupper av NBS. En av de CRC-subtyper, CRC subtype 3, hadde en betydelig dårligere prognose enn de andre (fig 3), noe som indikerer at klinisk distinkte subtyper kunne identifiseres. I en multivariat analyse (data ikke vist) faktorene «WHO performance status», «LDH ved randomisering», «før adjuvant terapi», «tumor stadium primærtumor», «antall berørte organer «og» MSI status» ble beholdt. Fordi genomiske mutasjoner er årsaks for tumordannelse og diktere tumor atferd, er det veldig godt mulig at fenotypiske faktorer, som til slutt er et resultat av underliggende biologi, maskere den prognostiske effekten av genomisk CRC subtyper. En slik avhengighet mellom clinicopathological prognostiske parametere og CRC undertyper som er beskrevet her derfor ikke tilbakevise univariate prognostisk verdi av denne klassifiseringen.
CRC subtype 3 viste seg å bli beriket for svulster med
BRAF
mutasjoner (33% av tilfellene
versus
5% i de andre CRC prøvene; S7 Table) og MSI svulster (30% av tilfellene
versus
1% i de andre CRC prøver).
BRAF
er mutert på mye høyere frekvenser i MSI svulster enn i kromosom ustabil svulster, og i løpet av MSI svulster,
BRAF
mutasjonen er kjent for å være assosiert med dårlig prognose [16]. Selv om MSI svulster har en forholdsvis god prognose i tidlig fase sykdom, er de også er assosiert med dårlig prognose eksplisitt i metastatisk CRC [17]. MSI svulster har ofte en lavere frekvens av CNA avvik enn svulster som er mikro stabil (MSS), og derfor har mindre CNA-forbundet kromosombrytningspunkt enn MSS svulster. Dette tyder på at MSI svulster kan bli gruppert i en distinkt CRC subtype uansett (endringer i) funksjon av tilbakevendende stoppunkt gener. Etter dette resonnementet, ville man spår at dårlig prognose CRC subtype 3 mangler tilbakevendende stoppunkt gener med økt mutasjons frekvenser i forhold til de andre CRC subtyper. Men våre data viste ellers (S7 tabell), med betydelig berikelse av stoppunkt frekvenser i CRC subtype 3
versus
de andre CRC prøver for
WWOX plakater (33%
versus
5%),
FHIT plakater (59%
versus
13%), og
PIBF1 plakater (15%
versus
3%). Disse dataene understreker at tilbakevendende stoppunkt gener bidrar vesentlig til klinisk relevant CRC klassifisering.
Som våre data støtter kliniske relevansen av tilbakevendende stoppunkt gener, er det forventet at kromosom pauser innenfor disse genene eller annen måte føre til positiv utvelgelse av kreftceller og stimulere tumorutvikling. Funksjonell analyse av tilbakevendende stoppunkt gener å forstå deres biologiske effekter var utenfor rammen av denne studien. Men for mange av disse en rolle i tumorgenese har blitt beskrevet i litteraturen.
WWOX Hotell og
FHIT
har lenge vært kjent for å ligge på vanlige skjøre områder og har vist seg å fungere som undertrykkere av svulst utvikling av genet knockout musemodeller [18]. Videre
WWOX
overekspresjon ble vist seg å fremme immunresponsen i en glioma modell [19] mens
FHIT
positivt regulerer uttrykk av MHC klasse I molekyler på kreftceller [20]. Disse data tyder på at tap av funksjon av
WWOX Hotell og
FHIT
hjelp til å flykte immunosurveillance. Likeledes progesteron immunmoduler bindende faktor
PIBF1
ble identifisert som en utskilt faktor som kan hindre graviditet tap ved å dempe immunresponsen. Tatt i betraktning at
PIBF1
stoppunkter ble hovedsakelig observert i den distale delen av genet (fig 1D) det er fristende å spekulere i at
PIBF1
genet stoppunkter forstyrre dens kjernefysiske lokalisering signal hvorpå det blir en utskilt protein med anti-tumor immundempende egenskapene [21]. MSI tumorer er tenkt å fremkalle en anti-tumor immunrespons som forhindrer metastatisk spredning, men når omgås disse tumorene blir meget aggressiv [16]. I denne sammenheng er det av interesse å merke seg at knekkpunkts gener som bidro mest til klassifiseringen av dårlig prognose CRC subtype 3,
i
.
e
.
WWOX
,
FHIT
, og
PIBF1
, alle har vært innblandet å modulere immunresponser.
MACROD2
var den mest utbredt tilbakevendende stoppunkt genet i vår årsklasse, blir påvirket i 41% av CRC tilfeller. Dette genet var også en av de hyppigst observerte omorganisert gener gjennom et fokus sletting i andre studier [3,22].
MACROD2
er i stand til å hydrolysere endogene mono-ADP-ribosyl grupper, en reversibel post-translasjonell modifikasjon del, fra target proteiner som
GSK3B
. Dette gjenoppretter funksjonen til
GSK3B
, som er et nøkkel hemmer av Wnt signalveien. Derfor fravær av funksjonell
MACROD2
kan redusere kinase aktiviteten til
GSK3B Hotell og dermed fremme Wnt signale [23-25]. Videre
MACROD2
kan spille en rolle i modulerende funksjon av histonproteinene og er rekruttert i tilfelle av DNA skade respons [23,25].
For ytterligere å møte den biologiske betydningen av tilbakevendende stoppunkt gener vi prøvde å konstruere moduler av mulige kreft kjøring gener, ved hjelp av Multi-Dendrix. På den ene side kan denne analysen avslører onkogene trasé ved å se etter gjensidig utelukkende gen mutasjonsmønster som dekker nesten hele CRC prøver. På den annen side, hvis en tilsynelatende homogen gruppe av tumorer består av forskjellige tumor-subtyper, gjensidig eksklusivitet mellom gener kan også reflektere tilstedeværelse av (tidligere ikke kreft) subtyper. Det ble ikke observert den sterkeste gjensidig eksklusivitet mellom
TP53
mutasjoner og
PIBF1
brytningspunkt (figur 4).
