Abstract
Systemisk behandling av pasienter med tidlig stadium kreft forsøk på å utrydde okkult metastatisk sykdom for å hindre gjentakelse og økt sykelighet. Imidlertid er prediksjon for tilbakefall fra en analyse av primærtumor begrenset på grunn disseminerte kreftceller bare representere en liten del av den primære lesjonen. Her analyserer vi uttrykk for sirkulerende microRNAs (Mirs) i serum oppnås pre-kirurgisk fra pasienter med tidlig stadium kolorektal kreft. Grupper på fem pasienter med og uten tilbakefall av sykdommen ble brukt til å identifisere en informativ panel av sirkulerende Mirs ved hjelp av kvantitativ PCR av genom-wide MIR ekspresjon, så vel som et sett av publiserte kandidat Mirs. Et panel av seks informative Mirs (MIR-15a, mir-103, MIR-148a, MIR-320A, MIR-451, MIR-596) ble hentet fra denne analysen og evaluert i en egen kontroll sett tretti pasienter. Hierarkisk gruppering av uttrykket nivåer av disse seks sirkulerende Mirs og Kaplan-Meier-analysen viste at risikoen for tilbakefall av sykdommen fra tidlig stadium kreft i tykktarmen kan forutsies ved dette panelet av Mirs som er målbare i sirkulasjonen på diagnosetidspunktet (P = . 0,0026; Hazard Ratio 5,4; 95% CI 1,9 til 15)
Citation: Shivapurkar N, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays A, Juhl H, et al. (2014) Tilbakefall av Early Stage Colon Cancer Forut av Expression Pattern of Sirkulasjons microRNAs. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10,1371 /journal.pone.0084686
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 18 november 2013; Publisert: 06.01.2014
Copyright: © 2014 Shivapurkar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av NIH tilskudd CA108440 (AW), P30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), Lombardi Cancer Center (NS) og Ruesch Senter (NS, JLM, SM, og AW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. En av forfatterne (Dr. Juhl) er affiliatiated Indivumed, GmbH. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, og gir ikke en interessekonflikt.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje ledende årsaken til kreftdødelighet som rammer menn og kvinner likt. Worldwide det står for rundt én million nye kreft og en halv million dødsfall som representerer 10 prosent av kreftdødsfall [1]. Utfall for pasienter med tidlig stadium CRC er heterogene, med sykdomsspesifikke 5-års overlevelse for pasienter med stadium II av 72-88% og 40-71% for stadium III [2]. De fleste pasienter med stadium II sykdommen er kurert ved kirurgi alene mens ytterligere kjemoterapi kan gi overlevelse fordeler til pasienter med senere stadium sykdommen. Likevel vil omtrent 1 av 4 pasienter med tidlig stadium sykdommen lider av tilbakefall og biomarkører som identifiserer pasienter med høy risiko ved første gangs diagnose og operasjon ville tillate å velge disse pasientene for tettere oppfølging og muligens systemiske behandlinger ([3], [ ,,,0],4], [5];. anmeldt nylig i [6])
microRNAs (mirnas eller Mirs) er små, ikke-kodende RNA som spiller en betydelig rolle i å kontrollere aktivitetene til mobilnettet veier både i fysiologi og patologi (se for eksempel [7]). Den distinkte funksjon av Mirs i forskjellige kreftformer er blitt mer tydelig i løpet av de siste årene [8], [9], og mange studier viser at MIR signaturer kan brukes til å skille mellom forskjellige typer kreft [10], [11], [12], [13], prognoser [14], [15], avslører potensielle mål [16], endrede signalveier [17], eller ondartet progresjon fra in situ karsinom til invasiv sykdom [18]. Mest overraskende, en sammenligning av MIR og mRNA profiler av primære og metastatiske kreft lesjoner viste at Mirs gi en mer pålitelig og karakteristiske signatur enn mRNA og funnet ut at Mir signaturer var overlegne til mRNA identifisere orgelet kilde til metastaser av ukjent opprinnelse [19] , [20]. En tidligere studie [21] med uttrykk profilering av 315 Mirs i vev fra scenen II tykktarm kreft viste forskjeller i mønstre for tilbakevendende sykdom. Uttrykket nivåer av spesifikke Mirs i vevene korrelert med sannsynligheten for tilbakefall overlevelse ved multivariat analyse. Disse resultatene tyder på at ekspresjon av perturbed Mirs i tykktarmskreft kan ha en prognostisk potensial.
I tillegg til disse analyser av normale og syke vev, mer nylige rapporter har vist at kan påvises MIR arter i omløp [22] og til og med foreslått at analyser av serumprøver for definerte Mirs kan brukes til å identifisere pasienter med kreft [23], [24], [25], [26]. Studier av blodbårne mirome viste også anvendbarhet til andre enn kreft sykdommer ([27]; omgås i [28], [29]). Mirs i sirkulasjon synes å være bemerkelsesverdig stabil [30], [31] og det ble foreslått at stabiliteten skyldes Mirs blir inkludert i lipoprotein-vesikler, såkalte exosomes [32]. Her studerte vi Mirs i blodprøver tatt før-kirurgisk fra pasienter med tidlig stadium kreft i tykktarmen som forble tilbakefall-fri eller fikk tilbakefall av sykdommen. Vi antok at endrede mønstre av sirkulerende Mirs kan tyde på en økt risiko for tilbakefall av sykdom på grunn av okkulte metastatiske frø på tidspunktet for første diagnosen. Vi rapporterer at et sett med seks Mirs kan være nyttig i å forutsi risikoen tilbakefall av sykdommen for tidlig stadium tykktarm kreft.
Resultater
Sirkulasjons mikroRNA Expression Sammenligning Ved hjelp av en kandidat Gene tilnærming
å måle Mirs i sirkulasjon, etablerte vi kvantitativ RT-PCR [33] som et påvisningsmetoden med en dynamisk rekkevidde på inntil 10
6 ganger for Mirs i serumprøver [18]. Som en første tilnærming, plukket et panel av seksten Mirs som hadde blitt vist å være uttrykt forskjellig mellom kreft i tykktarmen og tykktarmen normale vev [21], [34], [35]. Vi først kjørte en pilotstudie og analysert et sett av serumprøver fra tidlig stadium kolon kreftpasienter som forble sykdomsfri (n = 5) eller hadde tilbakefall av sykdommen (n = 5) innenfor et gjennomsnitt på 26 måneder ( 0,05 vs. ingen tilbakefall fig. 1A, B). Fig. 2A viser omtrent 100 000 ganger konsentrasjonsområde av de seksten sirkulerer Mirs analysert i pilotstudien. Vi observerte de forventede utviklingen av den respektive opp- eller nedregulering i noen av de utvalgte Mirs (dvs. MIR-20, MIR-135B, MIR-195, MIR-320, MIR-615). Imidlertid forskjellene var ikke statistisk signifikante (Fig. 2B). Det er bemerkelsesverdig at MIR-320 var en av to Mirs som viste en nedregulering i vev som ble korrelert med dårlig tilbakefall overlevelse [21]. Her, MIR-320 i sirkulasjonen var omtrent to ganger lavere hos pasienter med tilbakefall av sykdommen, selv om det nedregulering var ikke statistisk signifikant (fig. 2B). Uttrykket av MIR-498, den andre MIR fra studien i Ref. [21], ble påvist kun ved svært lave nivåer i omløp og dermed ikke egnet for analyse.
A, fra en pilotstudie med 10 pasienter kandidat Mirs prediktiv for tilbakefall av sykdommen ble identifisert og testet for sin prediksjon tilbakefall av sykdommen i en valideringsstudie. B, Kaplan-Meier plott for tilbakefall av sykdom hos pasienter i pilotstudien. Pasienter med tilbakefall av sykdommen (n = 5) vs ingen tilbakefall (n = 5): Chi kvadrat 5,47, p = 0,0193; median tid til tilbakefall = 26 måneder. De Gehan-Breslow-Wilcoxon algoritmer ble brukt.
Kandidat MIR tilnærming. Sirkulerende nivåer av 16 Mirs angitt på x-aksen som hadde blitt publisert som uttrykt forskjellig mellom tykktarmskreft og ikke-maligne kolon vev ble analysert [21], [34], [35]. Pre-kirurgi serumprøver var fra pasienter i pilotstudien. Pasientene hadde vært fulgt for tilbakefall av sykdommen og de respektive data er i fig. 1B. A, Konsentrasjon av sirkulerende Mirs (i forhold til U6). Merk log-skala som dekker et område på 100 000 ganger. B, forholdet mellom uttrykk mellom pasientgrupper. Alhough MIR-20, MIR-195 og MIR-320 viste en ≥2-fold downregulation, og MIR-135b og MIR-615 en ≥2 ganger oppregulering i serum fra pasienter med tilbakefall av sykdommen, verken av sammenligninger nådde statistisk signifikans ved ANOVA (p 0,05).
Sirkulasjons mikroRNA Expression sammenligning bruker en Objektive, Genome-wide Analyse
fra ovennevnte pilotstudien har vi valgt to pasientprøver fra tilbakefall-free ( NRec) og tilbakefall (Rec) gruppe for en objektiv genom-wide MIR analyse. Vi plukket pasienter fra ovenstående pilotstudie som hadde vist den mest differensial uttrykk for kandidat Mirs. Vi tenkte at en sammenligning innenfor en slik prøve pair kan tilby en større sjanse for å plukke opp tilbakefall spesifikke Mirs. Vi analyserte dette paret av pasientprøver ved hjelp SYBR Grønn qPCR basert på genom MIR uttrykk arrays for 760 Mirs satt opp i vårt laboratorium, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser (SBI, Mountain view CA). Den aktuelle resultatet for de beste 70 Mirs er vist i fig. 3 som en heatmap. For en uavhengig valideringsstudie vi valgt fra dette panelet seks Mirs som møtte to kriterier: (1) tilstrekkelige nivåer av uttrykk i serumprøver, verdier dvs. RT-PCR Ct ≤32 og (2) differensielle uttrykk ( 3 ganger opp- eller nedregulering) av en gitt MIR sammenligne Rec og NRec prøver.
Heat kartet genom-wide mikroRNA uttrykk analyse ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. To pasienter ble valgt ut fra pilotstudien (se fig. 1 og 2). Den miRNA uttrykket Analysen ble utført for 760 mirnas bruker qPCR baserte uttrykk analyse. Data filtrering og analyse ble gjennomført og de 70 Mirs som viser den største differensial uttrykk er representert i kart varmen.
Validering av Sirkulasjons mikroRNA uttrykk mønstre som en prediktor for tilbakefall av sykdommen
for å vurdere om de sirkulerende Mirs identifisert i ovennevnte pilotstudien kan forutsi tilbakefall av sykdommen i lav-risiko pasienter, brukte vi en egen, uavhengig gruppe på tretti pasienter med tidlig stadium tykktarmskreft med kjente utfall. Femten av disse pasientene hadde sykdommen tilbakefall innen et gjennomsnitt på 25 måneder, mens den andre femten forble tilbakefall fritt. De kliniske karakteristika for pasienter i denne valideringssettet ved tidspunktet for deres første diagnosen er gitt i tabell 1. På tidspunktet for diagnose de to grupper av pasienter uten og med tilbakefall av sykdommen viste ingen betydelige forskjeller med hensyn til alder, kjønn, tumorstørrelse , tumorstadium, plassering av deres primære lesjon eller histopatologi (tabell 1). Alle pasientene hadde node negativ sykdom og mer enn tolv lymfeknuter undersøkt. Kun en pasient (i den ikke-tilbakefall gruppen) var en T4, alle andre var T1 til T3 tumorer og således med en lav kjent risiko for tilbakefall.
Ekspresjon av de seks Mirs utledet identifisert i pilotstudie ble målt ved QRT-PCR, og de resulterende data er vist som rå Ct-verdier så vel som et konsentrasjonsområde på fig. 4A (henholdsvis venstre og høyre akser). Konsentrasjonen av de seks utvalgte Mirs i kretsløpet dekker et område på tilnærmet 1000 ganger, og således en 100-ganger snevrere område enn de Mirs overvåkes i pilotstudien (sammenlign fig. 4A og 2A). En korrelasjonsanalyse av dataene viste en sterk korrelasjon av uttrykket nivåer av MIR-15a, MIR-148a, MIR-320a og MIR-451 (r = 0,746 til 0,897; p 0,0001), mens nivåene av MIR-103 og speil 596 ble ikke korrelert med nivåene av de andre Mirs. En Principal Component Analysis (PCA) av datasettet viste en distinkt gruppe av pasienter med og uten tilbakefall (Fig. 4B) som tyder på at panel av Mirs kan skille de forskjellige gjentagelses risikoen for pasientene.
Validering studie for seks Mirs identifisert i pilotstudien. Pasientkarakteristika er gitt i Tabell 1. Seks Mirs ble avledet fra pilotstudien. A, Expression nivåer basert på syklusen terskel (Ct) verdier av QRT-PCR (venstre akse) og Mir konsentrasjonen beregnet (høyre akse). B, Principal Component Analyse av data med de to gruppene som er vist i svarte og røde symboler hhv.
En blindet hierarkisk clustering analyse [18] (Fig. 5A) viste en signifikant underinnstillingen i to grupper . Tretten av femten pasienter med tilbakefall av sykdommen og elleve av femten pasienter som var tilbakefall-free ble riktig klassifisert av Mirs i blodprøver tatt før deres første operasjonen (p = 0,0025, odds ratio = 17,9;. Rel risiko = 5.5, 95% KI = 1,5 til 20,7). En Kaplan-Meier analyse av tid til tilbakefall av sykdommen i de pasientene som høy eller lav risiko ved hierarchival clustering viste en signifikant forskjellig utfall mellom de to gruppene (p = 0,0026, Fig. 5B). Således kan de seks Mirs er valgt her, brukes for å forutsi risikoen for tilbakefall av sykdommen i tidlig stadium, med lav risiko tykktarmskreft ved analyse av en blodprøve oppsamlet på tidspunktet for den innledende diagnose.
, hierarkisk clustering av pasienter fra valideringsstudien i lave og høye risikogrupper basert på serum MIR nivåer. Analysen ga en separering i to grupper. B, Kaplan-Meier plot av pasienter spådd å ha høy og lav risiko for tilbakefall av sykdommen. Sammenligningen resulterte i P = 0,0026, Hazard Ratio 5,4 (1,9 til 15,0 95% KI). I panel A pasienter med tilbakefall av sykdommen er # 1 til # 15 og uten tilbakefall. # 16 til # 30
Diskusjoner
Den aktuelle studien evaluerer mulig bruk av sirkulerende microRNAs ( Mirs) for å identifisere tykktarmskreft pasienter med høy risiko for tilbakefall av sykdommen til tross for diagnosen tidlig stadium, lav-risiko sykdom angitt med etablert svulst staging. Dette kan bidra til å identifisere de personer som vil dra nytte av et tettere overvåking og /eller systemisk behandling, og vil unngå over behandlingen av pasienter som ikke vil være til nytte på grunn av deres lave risiko (anmeldt nylig i [6]). Analysen kan gjøres med en liten mengde ( 1 ml). Serum
Opprinnelsen av sirkulerende Mirs har vært gjenstand for debatt. Tumorassosierte Mirs detektert i sirkulasjonen kan selvsagt resultere fra tumor celledød, så vel som fra aktiv frigjøring av tumorceller. Videre kan Mirs pakket i beskyttende operatører som exosomes bli levert til mottaker cellene der de utøver genet Slå gjennom den samme mekanismen som cellulære Mirs [36] eller kan kaste inn i sirkulasjon. Videre er det utskilte Mirs blitt antatt å være involvert i mediering av celle-celle-kommunikasjon. Også utvalgte sett av Mirs er utgitt av kreftceller og sammensetningen av disse settene med Mirs har vært knyttet til kreft [37]. Selv om kreft-assosiert sirkulerende Mirs som kan være avledet fra kreftcellene, immun eller andre stromale celler i svulsten mikromiljøet, samt andre organer som reagerer på signaler fra tumoren er mulige kilder [38]. Således kan immunceller utskiller cancerassosierte Mirs, for derved å fremme eller hemme proliferasjon, invasjon og apoptose [38], [39] og feilregulering av disse Mirs kan være en viktig forbindelse mellom immunitet og kreft. Selv om noen studier funnet parallelle trender mellom sirkulerende Mirs og vev Mirs (f.eks [18], [24]) andre foreslår at ikke alle de frigitte Mirs reflektere Mir overflod i tumorceller (f.eks [37], [40]). Generelt er Mirs oppdaget i sirkulasjon levert av ulike organer og fysiologiske reguleringen eller patologiske forandringer vil endre uttrykk mønstre av sirkulerende Mirs (for nyere eksempler og vurderinger se Refs. [29], [41], [42], [43 ]).
Når analysere Mirs i den aktuelle studien én etter én i stedet for i en multivariat analyse ble to Mirs funnet forskjellig uttrykt i sirkulasjon, dvs. MIR-103 (nedregulert) og MIR-596 (oppregulert). MIR-103 var signifikant nedregulert (p = 0,038) i blodprøver fra pasienter med tilbakefall av sykdommen i forhold til tilbakefall frie pasienter (fig. 4A). I tarm krypten cellene MIR-103 er en del av G1 /S overgang regulatoriske nettverk i løpet av IGF-1 stimulert spredning og dette peker på en betydelig rolle i cellevekst og overlevelse [44]. I kontrast, MIR-596 var signifikant oppregulert (p = 0,0012) i blodprøver fra pasienter med tilbakefall av sykdommen. Uttrykk av MIR-596 ble korrelert med dårlig overlevelse av pasienter med ependymoma [45], men ble inaktivert i HCC [46] og nedregulert i bukspyttkjertelen adenokarsinom [47]. Dermed er det ingen klare bevis ennå å knytte vev uttrykk for dette MIR til en distinkt funksjon som vil koble den til sykdomsprogresjon. Mirs med bare små generelle endringer mellom pasientgruppene var MIR-148a som er en del av en gruppe med negative regulatorer av proinflammatoriske gener i myeloide celler [48], men er redusert i bukspyttkjertelkreft vev [18], uttrykt ved høye nivåer i leveren vev [49] og forbundet med leverskade [50]. MIR-320a ble rapportert tidligere som en lovende indikator på ondartet progresjon i tykktarmskreft [25] selv om vi ikke ser en klar indikasjon på virkningen av MIR-320 endringer på egen hånd i denne studien. MIR-15a kan føre apotosis [51] og er blitt rapportert å delta i kontrollen av tumor-stromal krysstale i prostatakreft [52], så vel som medierer proangiogenic baner i iskemi-forbundet patologi [53]. Interessant nok var MIR-451 karakteriseres som en sirkulerende indikator på tilstedeværelse av brystkreft [54] og er vist å bli selektivt frigjort fra transformerte bryst epitel og for å bidra til endret sensitivitet overfor kjemoterapeutiske eller endokrine målrettede medikamenter i brystkreft (gjennomgått i [ ,,,0],55]). Det er fristende å spekulere i at de sirkulerende Mirs identifisert her som indikatorer på risikoen for tilbakefall av sykdommen kan bidra til prosessen ved å påvirke svulst celle overlevelse, stromale tumor interaksjoner, angiogenese eller betennelses celle responser til de okkulte metastaser.
i Konklusjon
risikoen for tilbakefall av tidlig stadium tykktarmskreft kan forutsies ved å overvåke Mirs i pasientblodprøver samlet inn ved tidspunktet for den første diagnosen.
Materialer og metoder
MIR Deteksjon og kvantifisering i blodprøver
innsamling og bruk av biospecimen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) fra Georgetown University i henhold til protokoll # 2007-345 sist på 10/24/2012. Alle pasienter signere en samtykkeerklæring som tillater bruk av donert vev og kroppsvæskeprøver. De samtykkeerklæringer og deres innhold ble gjennomgått og godkjent av IRB. Serumprøver ( 1 ml) ble behandlet etter fjerning av personlige identifikatorer. MIR isolasjon ble beskrevet tidligere [18]. I korte trekk, ble serumprøver blandet i et forhold på 1:10 med Qiazol lysereagensen og virvles. Lysatet ble ekstrahert med CHCI3, og den vandige fasen ble videre behandlet for total-RNA ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og anriket for MIR hjelp av RT2 qPCR-Grade MIR Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).
data Analysis
PCA og hierarkisk clustering ble utført basert på gjennomsnittet sentrert og skalert Mir uttrykk nivåer. Clustering metoder som brukes XLSTAT (Addinsoft Inc.) innen Excel (Microsoft Inc.) på OSX 10.7.5. Disse metodene gir mulighet for beregning av betydning mellom de hierarkiske klynger og utlede p-verdier ved hjelp av Fishers eksakte test. Prism 5.0 (Graphpad) programvare ble brukt til andre tester og visning av data.
Takk
Vi ønsker å erkjenne Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet og Ryan Navarro (alle ved Georgetown University) for teknisk assistanse. Drs. Daniel F. Hayes (U Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (National Cancer Institute, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers og Beppe Giaccone (alle ved Georgetown University) lese utkast til manus og alle kommentarer og forslag til dataanalyser og tolkning.
