Abstract
Til tross for utallige forsøk, narkotika baserte behandlinger for pasienter som lider av lungekreft er fortsatt dårlig. Som et lovende alternativ, undersøkte vi det terapeutiske potensialet av BC-819 for behandling av lungekreft i musetumormodeller. BC-819 er en ny plasmid-DNA som koder for A-fragmentet av difteri-toksin og har tidligere blitt vist å kunne inhibere tumorvekst in human klinisk studie av blærekarsinom. I et første sett av eksperimenter, undersøkte vi
in vitro
effekt av BC-819 i humane lungekreft-cellelinjer NCI-H460, NCI-H358 og A549, som avslørte 90% reduksjon av cellevekst.
In vivo
effekt ble undersøkt i en orthotopic mus xenograft lungekreft modell og i en lungemetastase modell ved hjelp av selvlysende A549-C8-Luc adenokarcinomceller. Disse cellene resulterte i peri- og intra-bronchiolar svulster ved intrabronkial søknad og parenkymceller svulster ved intravenøs injeksjon, henholdsvis. Mus som lider av disse lungetumorer ble behandlet med BC-819, kompleksdannet for å forgrenet polyetylenimin (PEI) og aerosolisert til musene en gang per uke i en periode på 10 uker. Denne doseringen veksten av intrabronkialt induserte lungesvulster ble signifikant inhibert (p = 0,01), mens ingen effekt kunne observeres i mus som lider av lungemetastaser. I sammendraget, foreslår vi at aero PEI /BC-819 er i stand til å redusere veksten bare i svulster som oppstår ved luminal del av luftveiene og er derfor direkte tilgjengelig for innånding BC-819
Citation. Hasenpusch G, Pfeifer C, Aneja MK, Wagner K, Reinhardt D, Gilon M, et al. (2011) aero BC-819 Hemmer Primær men ikke Sekundær Lung Cancer Vekst. PLoS ONE seks (6): e20760. doi: 10,1371 /journal.pone.0020760
Redaktør: Dominik Hartl, Ludwig-Maximilians-Universität München, Tyskland
mottatt: 1 februar 2011; Godkjent: 09.05.2011; Publisert: 08.06.2011
Copyright: © 2011 Hasenpusch et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av BMBF BioFuture program (FKZ0311898), programmet 13N9182, LMUexcellent (Investitionsfonds), DFG RU 911 /9-1 og Emma Thaler Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ifølge epidemiologiske studier, forblir lungekreft den ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden med bare 15 prosent av alle pasientene i USA og 10 prosent av alle pasienter i Europa overlever mer enn fem år etter diagnose av sykdommen [ ,,,0],1]. Denne situasjonen skyldes i hovedsak sen diagnostisering av lungekreft og manglende terapeutisk effekt av tilgjengelige kreft narkotika, særlig i avanserte stadier av sykdommen når kirurgisk ablasjon er ikke gjennomførbart eller svulster oppstår på nytt etter operasjonen.
For å lukke denne terapeutiske gap, ble genterapi foreslått som lovende mulighet for å forstyrre kritiske molekylære stier kreftceller [2]. Nylige strategier forsøkt i kliniske studier, inkludert induksjon av tumorcelle-apoptose gjennom utskifting av mutert p53 tumor suppressor-gen, tumorcelle selvmord gjennom induksjon av gener som koder for spesifikke enzymer som er følsomme for ellers gunstige midler og aktivering av immunsystemet med gener som koder for cytokiner [3]. Størstedelen av genet terapeutiske metoder er basert på virusvektorer som er svært effektive, men på grunn av utvikling av nøytraliserende antistoffer, ugunstige for gjentatt anvendelse. Ikke-virale vektorer, men egnet for gjentatt søknad er relativt mindre effektive, spesielt i luftveiene [4].
På grunn av sikkerhetsproblemer, Gene terapeutiske midler fortrinnsvis lokalt administrert i aktuelle kliniske studier. Faktisk lokal påføring av legemidler har vist seg å være fordelaktig ved forskjellige lungesykdommer, slik som astma, KOLS og nylig i lungekreft [5]. Ved lungekreft for eksempel, anvendelse av kjemoterapeutiske medikamenter gitt høyere pulmonal legemiddelnivåer og dessuten reduserte systemiske bivirkninger [6]. På grunn av disse fordelaktige fordelingsegenskapene, har aerosoler vært vurdert for anvendelse av genet terapeutiske midler. Plasmid-DNA, kompleksbundet med kationiske polymerer, førte til vellykket transfeksjon av bronkial og alveolar epitel med rapportørgener [7], [8] og redusert tumorvekst når en terapeutisk plasmid som koder for p53 ble påført på lungetumorbærende mus [9].
Videre ville det være ønskelig å begrense aktiviteten av den anvendte plasmid-DNA til de eneste lunge tumorceller, således at det friske vevet upåvirket. I denne sammenheng kan plasmid BC-819 (også kjent som DTA-H19) være en ideell kandidat. Plasmid BC-819 koder for difteri-toksin A-fragment under kontroll av H19-promoteren. Ekspresjon av difteri-toksin fragment A ødelegger uunngåelig celler ved umiddelbar forstyrrelse av proteinsyntese og H19 promoter begrenser dens ekspresjon i tumorceller [10]. H19 er en paternell trykt, maternalt uttrykt, onkoføtal-genet som ikke har noen proteinprodukt [11]. Det uttrykkes ved betydelige nivåer i flere forskjellige humane tumortyper, men er bare marginalt uttrykkes eller fullstendig fraværende i normalt voksent vev [12]. Nyere data foreslått en rolle for H19 i å fremme kreft progresjon, angiogenese og metastase [13].
Selv om aero genterapi har vist seg å være effektiv i musemodeller for lungekreft, har vi spørsmål ved om lokalisering av tumorer kan ha en effekt på effektiviteten av tumorspesifikke BC-819-plasmidet. Av denne grunn ble plasmid BC-819 anvendt som en aerosol i to grupper av mus som lider av lungesvulster, enten indusert ved intrabronkial eller intravenøs injeksjon av humane lungekreftceller. For å kvalifisere og kvantifisere tumorutvikling
in vivo
, ble selvlysende celler brukes til å generere lungesvulster.
Materialer og metoder
Kjemi
forgrenet polyetylenimin (PEI , gjennomsnittlig molekylvekt 25 kDa) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Tyskland). PEI ble fortynnet i destillert vann (vann for injeksjon, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Tyskland) og justert til pH 7 med HCl. D-Luciferin ble hentet fra SYNCHEM (Felsberg /Altenburg, Tyskland).
Plasmider
De plasmider pCluc og pUC21 ble hentet fra Plasmid Factory (Bielefeld, Tyskland). De plasmid pCluc koder for reporteren enzymet luciferase avledet fra
Photinus pyralis
. Plasmidet pUC21 ble anvendt som negativ kontroll. Plasmidet BC-819 koder for et fragment av difteri-toksin (DT-A) under kontroll av H19 promoter, og har allerede blitt beskrevet andre steder [10].
Cellelinjer
Cellen linje A549 ble avledet fra en human lungetumor og histologisk klassifisert som en adenocarcinoma [14]. Cellelinjene NCI-H460 og NCI-H358 ble isolert fra humane prøven så vel og histologisk klassifisert som storcelle udifferensiert karsinom (NCI-H460) og bronchioloalveolar karsinom (NCI-H358). A549-C8-luc celler er A549-celler, stabilt transfektert med genet som koder for enzymet luciferase reporter. Alle cellelinjer ble hentet fra DSMZ (tysk Samling av mikroorganismer og cellekulturer, Braunschweig, Tyskland) med unntak av A549-C8-luc som ble kjøpt fra Caliper Life Sciences (Alameda, California).
Dyr
på grunn av forskjeller i dyrenes tumor mottakelighet, forskjellige musestammer måtte brukes for induksjon av primære og sekundære lungetumorer, avhengig av applikasjonen ruteplan av tumorcellene. T-celle-manglende nakne mus ble beskrevet som gode givere for intrabronkialt anvendt tumorceller nylig [15] og derfor valgt for induksjon av primær lungesvulster. Vellykket generering av lungesvulster gjennom systemisk administrering av tumorceller var imidlertid rapportert å kreve donordyrene med en høy grad av immunsvikt. Av denne grunn T-, B- og natural killer cell mangel CB17.Cg-
Prkdc
SCID
Lyst
bg-mus ble brukt for sekundærtumormodell, bare som beskrevet av tidligere forfattere [16].
Før forsøkene fikk dyrene akklimatisert i minst 7 dager. Alle ytterligere prosedyrer ble godkjent og kontrollert av lokale etisk komité (Regierung von Oberbayern) under godkjenningsnummer 16-08, og ble gjennomført i henhold til retningslinjene i den tyske loven om beskyttelse av dyreliv.
ortotopiske svulst implantasjon prosedyren
intrabronkial søknad.
NMRI-
Foxn1
nu
mus ble bedøvet gjennom intraperitoneal injeksjon av medetomidin (11,5 mikrogram /kg), midazolam (115 mikrogram /kg ) og fentanyl (1,15 ug /kg), og deretter plassert på en vinkelformet bord for å visualisere glottis ved hjelp av en lyskilde, en otoskop og en modifisert spatel (Hallowell, USA). 1 x 10
6 A549-luc-C8-celler fortynnet i 100 ul PBS ble påført orotracheally med en buttendede, bøyd 27 G nål av rustfritt stål som var tilpasset en 1 ml
Injekt-F
plastsprøyte (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Tyskland). Etterfølgende til implantasjon fremgangsmåte, anestesi ble motvirket ved subkutan injeksjon av en motvekt som består av atipamezol (50 ug /kg), flumazenil (10 ug /kg) og naloxon (24 ug /kg). Mus utvinnes fra anestesi innen 15 min.
intravenøs bruk.
Bevisst CB17.Cg-
Prkdc
SCID
Lyst
bg -mice ble plassert i en mus-rainer (Braintree Scientific Inc, USA) og 1 x 10
6 A549-C8-Luc-celler fortynnet i 100 ul PBS ble injisert direkte inn i dorsal halevene ved hjelp av en 29g U-100 insulin sprøyte (BD Consumer Healthcare, Le Pont de Claix, Frankrike).
in vivo avbildning
Dyrene ble bedøvet akkurat som beskrevet før. D-luciferin substrat (3 mg /100 pl PBS pr mus) ble påført ved intraperitoneal injeksjon i gruppen av mus som lider av lungesvulster som ble fremkalt ved intravenøs injeksjon av A549-C8-luc-celler. Mus som lider av tumorer som ble indusert ved intrabronkial anvendelse av A549-C8-luc mottatt den samme mengde av D-Luciferin fortynnet i 50 ul PBS via den intranasale rute [17]. Bioluminesens ble målt 10 minutter senere, ved hjelp av en IVIS 100 Imaging System (Xenogen, Alameda, USA) og kamerainnstillingene: synsfelt 10, f1 f-stop, høy oppløsning binning og eksponeringstiden for 5 min. Signalet ble kvantifisert og analysert ved hjelp av levende bilde Software versjon 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)
Utarbeidelse av PEI-pDNA polyplexes
forgrenet polyetylenimin. (PEI; gjennomsnittlig MW = 25 kDa) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Tyskland), oppløst i vann, og justert til pH 7 ved bruk av HCl. Polyplexes for aerosol-anvendelse ble formulert som beskrevet tidligere [7]. I korthet: BC-819-plasmidet og forgrenede PEI ble separat fortynnet i destillert vann til 4 ml, noe som resulterer i konsentrasjoner på 0,25 mg /ml BC-819 og 0,33 mg /ml forgrenet henholdsvis PEI, (tilsvarende et N /P-forholdet 10) . Den pDNA oppløsningen ble pipettert over i PEI-løsning og blandet ved å pipettere opp og ned for å gi en endelig pDNA konsentrasjon på 0,125 mg /ml. Kompleksene ble inkubert i 20 minutter ved omgivelsestemperatur før bruk.
Aerosol anvendelse av PEI-pDNA polyplexes
Aerosol søknad ble utført som beskrevet tidligere [18]. I korthet, en LC STAR forstøver (Pari, Starnberg, Tyskland), drevet av høyt trykk, som ble generert fra en BOY®SX kompressor (Pari, Starnberg, Tyskland) ble forbundet med et avstandsstykke, som er fylt med 500 g Tørke perler Orange (Sigma -Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Avstandsstykket på sin side ble forbundet med en plastboks med fire små hull på motsatt side, for å tillate strømning aerosol. For å lette høyere aerosol deponering i lungene, ble dyrene oppmuntret for akselerert puste ved å drive kompressoren med syntetisk luft, beriket med 5% CO
2.
Histologi
Dyr var avlives ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital. Deretter lungene ble fjernet, oppblåst med 4% paraformaldehyde gjennom luftrøret og videre behandlet for haematoxylin-eosin farging i henhold til en standard protokoll.
In-situ hybridisering
I-situ hybridisering (ISH ) ble utført som beskrevet av Ariel et al [16], ved bruk av digoxigenin merkede H19 RNA-probe, eller ved en modifikasjon av denne metode under anvendelse av H19-LNA (låst nukleinsyre) Dig-merket probe syntetisert ved Exiqon.
statistikker
Resultatene er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik. Statistisk signifikans mellom to grupper ble bestemt med en Mann-Whitney-U-Test for
in-vitro
resultater og med en Logrank-test for
in vivo
resultater. Sannsynlighet (P) 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av programmet Statview 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).
Resultater
Plasmid PBC-819 hemmer
in vitro
celle proliferasjon av humane lungekreftceller
in vitro
transfeksjon eksperimenter ble utført i forskjellige humane lungekreft avledede cellelinjer. Økende mengder av PBC-819 (0, 350 og 700 ng) ble ko-transfektert med 100 ng av luciferase koding plasmid. Den totale mengden av pDNA ble fylt opp til 800 ng for alle de sammenlignede prøver ved hjelp pUC21 plasmid som fyllstoff pDNA. Følgelig er effekten av PBC-819 ble indirekte bestemt ved en reduksjon av luciferase-aktivitet, noe som indikerer ødeleggelse av transfekterte tumorceller.
Ved hjelp av Lipofectamine 2000 som transfeksjon reagens, en tid og doseavhengig nedgang i luciferase-aktivitet ble observert i hver av cellelinjene som ble brukt. Effekten av PBC-819 ble tydelig så tidlig som 24 timer etter transfeksjon med en reduksjon i luciferase-aktivitet på mer enn 90% når 350 ng (fig. 1A), og mer enn 95% (fig. 1B) ved 700 ng av BC- 819 ble anvendt. Mer enn 98% av luciferaseaktiviteten ble inhibert 48 timer etter transfeksjon ved 700 ng BC-819 ble anvendt. Lignende resultat ble også oppnådd med 350 ng, med unntak av cellelinje NCI-H358.
NCI-H460, NCI-H358 og A549-celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000, med BC-819 og ko-transfektert med et plasmid, som koder for enzymet luciferase reporter. Så tidlig som 24 timer etter transfeksjon, luciferase-aktivitet (indirekte indikerer cellevekst) ble redusert med minst 90% når 350 ng BC-819 ble anvendt (A). 48 timer senere luciferaseaktivitet ble redusert med mer enn 98%, bortsett fra cellelinje NCI-H358. Imidlertid ble en luciferase-reduksjon på mer enn 98% observert i alle cellelinjene når mengden av BC-819 ble øket til 700 ng (B). Påvirkningen av BC-819 på bioluminescent A549-C8-luc ble undersøkt, så vel og avslørte redusert luciferase og derfor redusert cellevekst (mer enn 50%) så tidlig som etter 24 timer (C). Maksimal hemming av cellevekst ble nådd ved 48 timer etter transfeksjon, blir tydelig gjennom mer enn 75% reduksjon av luciferase aktivitet.
Disse studiene inspirert oss til å screene dette plasmid med cellelinjen A549-C8- luc, som var blitt stabilt transfektert med luciferase. Måling av luciferase ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon viste at BC-819 var effektiv i A549-C8-luc-celler så tidlig som 24 timer etter transfeksjon (fig. 1C). Den lavere konsentrasjon (400 ng) av BC-819 viste å være i stand til å redusere luciferase-aktivitet med mer enn 50%. Ved hjelp av 800 ng BC-819, var det mulig å redusere den luciferase-aktivitet med mer enn 75%. Til sammen disse studiene viste en klar effekt av plasmid BC-819 på celleviabilitet av humane lungekreftceller
in vitro
.
Vekst av lungesvulster avhenger av programmet stedet av tumorceller
for å vurdere effektiviteten av PBC-819 aerosol terapi
in vivo
, ortotopiske lungesvulster ble generert i immunmangelfull mus ved intrabronkial eller intravenøs bruk av A549-C8-Luc celler. Vi har funnet at valget av applikasjonen ruteplan påvirkes i stor grad av vekstmønstrene for de resulterende lungesvulster og påvirket dyr overlevelse. Intrabronkial anvendelse av A549-C8-Luc-celler ga opphav til selvlysende tumorer, først lokalisert i hals region, ved 10 dager etter transplantasjonen, og deretter å spre caudally til venstre eller høyre lunge innen 66 dager (fig. 2A). Imidlertid tumorer som ble indusert ved intravenøs injeksjon av A549-C8-Luc tumorceller, ble karakterisert ved spres Bioluminescens signaler i begge lungene etter 10 dager som deretter kontinuerlig økning (fig. 2B).
Vekst av ortotopisk lunge svulster ble målt ved definerte tidspunkter bruker bioluminesens imaging. Intrabronkialt induserte tumorer (A) dukket opp først i vena regionen og formidlet til de dypere lungene på senere tidspunkter, mens intravenøst indusert svulster (B) var begrenset til lungene regionen bare.
Histopatologisk post mortem undersøkelse av intrabronkialt induserte lungesvulster viste første bevis på tumorvevet i peribronchiolar regionen etter 10 dager (fig. 3A). Eksamener ved senere tidspunkter avslørte flere tumorknuter, lokalisert i parenchyma, den peribronchiolar region, og inne i bronkier (fig. 3 B-C). Lunger, som påvirkes fra intravenøst induserte tumorer ble imidlertid karakterisert ved spres tumorvev bare i parenchyma av organet (fig. 3 D).
tumorer var påvisbar så tidlig som 10 dager etter implantasjon i intrabronkial peribronchiolar region av lungene (A). End stadier av intrabronkialt indusert lungesvulster ble preget av flere, peribronchiolar og parenkymceller lokaliserte svulster (B) og ved tumor vev i luminal lungeområder samt (C). Intravenøs injeksjon av A549-C8-luc imidlertid ført i tumorer hovedsakelig vokser i parenchyma av lungene, men ikke peribronchiolar eller innenfor bronkiene (D). Fig D viser parenchymal tumorvev nær en bronkie, men ikke peribronchiolar. Alveolar vev lokalisert mellom svulsten og bronkie men kondenseres ved den tilstøtende svulst nodule.
A549-C8-Luc baserte lungesvulster er sterkt positivt for H19 onkogen
Fordi nærværet av den ikke-kodende RNA H19 er avgjørende for effekten av BC-819, undersøkte vi tumorvev for tilstedeværelse av ikke-kodende H19 RNA. In-situ-hybridisering viste en sterk ekspresjon av H19 i A549-C8-Luc baserte lungesvulster, angitt med brunaktig fargelegging av de undersøkte vev (Fig. 4).
An intrabronkialt indusert lungetumor var farget for H.E. (A) og screenet for H19-aktivitet ved anvendelse ISH (B). I gitt prøve et sterkt uttrykk for H19 ble funnet, angitt med en brunlig fargelegging av undersøkte vev.
Innånding av PEI /PBC-819 aerosol hemmer primære, men ikke sekundær tumorvekst
Basert på resultatene fra
in vitro
eksperimenter, effekten av PBC-819 ble undersøkt
in vivo
gjennom anvendelse av aero PBC-819 plasmid til lunge svulst bærende mus. Disse eksperimentene ble utført på mus som lider av enten intrabronkialt eller intravenøst indusert lungesvulster for å etterligne PBC-819 påvirkning på primære og sekundære lungesvulster.
For påfølgende aerosol søknad PBC-819 ble kompleks å forgrenet PEI og administreres i en modifisert hel-legeme inhaleringskammeret. Behandling av lunge svulst bærende mus ble startet på 21 dager etter tumorcelletransplantasjon, så snart bevis på lungesvulster ble verifisert ved hjelp av
in vivo
bioluminescent imaging. Behandlingsprotokollen inkluderte en inhalasjon prosedyre i uken for en total periode på 10 uker.
Disse eksperimentene avslørt enten fullstendig avskaffet eller severly svekket tumorprogresjon hos mus som lider av intrabronkialt indusert lungesvulster ved behandling med PEI /pBC- 819 aerosol (fig. 5A-B). En bioluminesens aktivitet på mer enn 2 × 10
5 fotoner per sekund var assosiert med en rask nedgang av dyrets allmenntilstand (indikert av raske vekttap og dyspné) og derfor definert som endepunkt-kriterier. Basert på denne prosedyre metode ble en median overlevelsestid på 66 dager beregnet for dyrene i den ubehandlede kontrollgruppe. I motsetning til dette,-behandlede mus overlevde mer enn 200 dager, selv om aerosol anvendelse av PEI /PBC-819 aerosol ble terminert mer enn 100 dager tidligere, på dag 91. Bortsett fra en mus, alle behandlede mus (n = 5) overlevde mer enn 200 dager, som er enten gratis av lungesvulster eller viser reduksjon av tumorvekst og ingen svekkelse av allmenntilstanden. En mus hadde ingen tegn til tumor bevis i lungene på dag 200, men faktisk en fjernmetastaser i hjernen (data ikke vist).
Vekst av lungesvulster i ubehandlede mus ble karakterisert ved innledende tumor utseende i halsområdet og deretter kontinuerlig spredning inn i lungene (A). Denne vekstmønster skilte seg i mus som ble behandlet med BC-819 hvor svulster enten redusert i størrelse eller i helt forsvunnet i løpet av behandlingen.
Til slutt, dag 200 ble valgt til å være den endepunktet i studien. Statistisk analyse av resultatene viste en meget statistisk signifikant forskjell (p = 0,01) mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen med hensyn til tiden som var nødvendig for å nå endepunktet av studien (Fig. 6A).
mus som bærer intrabronkialt indusert lungetumorer viste en betydelig overlevelsesfordel (p = 0,01) når de behandles med BC-819 sammenlignet med dyr som mottok ingen behandling (A). Ingen overlevelsesgevinst ble observert hos mus som lider av intravenøst indusert lungesvulster, uavhengig av behandling med BC-819 (B).
Behandling med PEI /PBC-819-aerosol viste å være mindre effektiv hos mus lider av lungesvulster, som ble generert ved intravenøs injeksjon av A549-C8-luc tumorceller. Som nevnt tidligere, tumorceller kommet i lungene gjennom blodsirkulasjonen, og følgelig påvirke lokaliserings og vekstmønster av lungesvulster, noe som resulterer i tumorer som vokser i parenchyma, men ikke i bronkiene. Under denne tilstanden, behandling med PEI /PBC-819-aerosol medførte ingen statistisk signifikant forskjell mellom behandlede og ubehandlede dyr. Selv om intravenøst induserte svulster vokste raskere, ble nedsatt allmenntilstand anerkjent så snart en luciferase aktivitet oversteg 1 × 10
6 fotoner per sekund, som ble derfor valgt som et endepunkt for mus som lider av intravenøst indusert lungesvulster. Median tid for å nå dette endepunktet var 43 dager for de ubehandlede dyr og 36 dager for de behandlede dyrene. Videre er statistisk analyse av disse resultatene viste ingen signifikant forskjell (p = 0,3) mellom behandlede og ubehandlede mus (Fig. 6B).
I sammendrag, er resultatene av disse forsøk viser, at aerosoliseres PEI /PBC-819 er stand til å inhibere tumorvekst lunge hos mus som lider av intrabronkialt induserte lungesvulster. Videre er de foreliggende resultater viser at en tilsvarende effekt ikke kunne observeres i mus som led av parenkymal lungesvulster, etter intravenøs applikasjon av tumorceller.
diskusjon
Genterapi er ansett for å lette behandlingsmuligheter for uhelbredelige lungesykdommer inkludert monogenetic defekter som cystisk fibrose, alfa
1-antitrypsinmangel og kompleks sykdom som astma og lungekreft [19]. I denne forbindelse har lokal påføring av genet terapeutiske legemidler som aerosoler vært ansett for å være fordelaktig for målretting av lungene fordi i) det ønskede stoffet kan administreres i en stor mengde direkte på stedet av sykdommen, og ii) alvorlige bivirkninger, som kunne fremkalles ved systemisk anvendelse av nukleinsyrer og /eller terapeutiske gen vektorer vil bli minimalisert. Konseptet med aerosol-basert genterapi ble ytterligere undersøkt i dette arbeidet gjennom anvendelse av plasmidet BC-819 i en ortotopisk xenograft modell for human lungekreft. I denne forbindelse har vi undersøkt om tumorcellespesifikke plasmider var i stand til å ødelegge bare primære tumorer i luminal luftveiene, eller hvis de var også i stand til å vise en effekt mot sekundære tumorer som ligger i parenchymalvevet. For å løse dette spørsmålet, ble lungesvulster indusert ved hjelp av to ulike program veier lungekreftceller. Tumorer som vokser fra den luminale side av lungene ble oppnådd når cellene ble påført intrabronkialt og tumorer som vokser fra blodkar «side ble oppnådd ved å anvende cellene intravenøst. Histologi av intrabronkialt induserte tumorer viste tegn til tumor i parenchyma av organet og i bronkial veggene. Disse funnene samsvarer med resultatene, som ble rapportert av andre forfattere [15]. Intravenøs injeksjon av tumorceller, imidlertid ført til karsinomer bare vokser i parenchyma av lungene, men ikke i bronkial veggene. Tumorvekst overvåking ved hjelp av selvlysende avbildning fremmet oppnådde resultater fra histologi, avslører ulike vekstmønstre svulster, som ble indusert intrabronkialt og intravenøst. Interessant, fant vi at intrabronkialt indusert lungesvulster oppstår fra peribronchiolar region som tyder på at intrabronkialt gjaldt celler må være i stand til å invadere og erobre bronkial epitel for å kolonisere peribronchiolar vev. Dette funnet er oppmuntrende med hensyn til resultatene av andre grupper som demonstrerte kolonisering av lunge epitel med merket genetisk konstruerte stamceller når det påføres gjennom intrabronkial rute [20]. Basert på den forutsetning at intrabronkialt brukt kreftceller i utgangspunktet invadere epiteliale lag i bronkial regionen til senere å spre peribronchiolar, foreslo vi at behandling med aero BC-819 skal være effektiv i å ødelegge kreftceller som vi og andre har tidligere vist at forstøvet luciferase koding plasmid DNA hovedsakelig transfects bronchial og alveolar epithelia når kompleks å forgrenet PEI [7], [8].
for å underbygge vår antagelse, vi behandlet tumor-bærende mus med plasmidet BC-819 som har nylig blitt vist å være terapeutisk effektiv i BCG-resistente blære karsinom hos pasienter [21]. Plasmid-BC-819 koder for et fragment av difteri-toksin og er drevet av H19 promoter. Som H19 promoter er bare aktiv i maligne celler under embryogenese, er svulstvev ødelagt, mens friske vevet forblir uskadd [10]. Før
in vivo
eksperimenter effekten av BC-819 ble bestemt i lungekreft cellelinjer NCI-H460, NCI-H358 og A549
in vitro
, avslører en betydelig hemmende effekt på cellen vekst. Det er tidligere blitt vist at den ikke-kodende H19 mRNA uttrykkes sterkt, noe som indikerer aktiv H19 promoter, i lungecancercellelinjer, spesielt i A549 [22]. Følgelig ble lungekreft hos mus indusert ved hjelp av luciferase-uttrykkende cellelinje A549-C8-luc som også hadde blitt vist å være mottagelig for plasmidet BC-819. Videre ble lungene undersøkt post mortem for H19-uttrykk av In-situ-hybridisering som viste sterke bevis på H19 uttrykk i A549-C8-Luc lungesvulster.
Dette eksperimentet viste at ukentlig aerosol behandling med PEI /BC-819 gir en signifikant (p = 0,01) overlevelsesfordel for mus som lider av intrabronkialt induserte lungesvulster, men ikke til mus som lider av intravenøst induserte lungesvulster (p = 0,36). Basert på disse resultatene, spekulerer vi at PEI /BC-819 aerosol behandling er bare effektive i primær lungesvulster som er tilgjengelige ved innånding fordi ondartet vekst hovedsakelig oppstår fra luminal del av luftveiene. I motsetning til dette, tumorvekst av intravenøst induserte lungesvulster utvikler seg først og fremst fra blodkar, deretter invaderer parenchyma av lungen. Som nevnt tidligere, er basert aerosol genoverføring hovedsakelig begrenset til den bronkial epitel. Gjerne dette ikke betyr at terapeutisk effekt ikke kunne oppnås for hele organet. Faktisk flere studier demonstrert effekten av forstøvet pDNA i videregående modeller av lungekreft [23]. Men andre plasmidkonstruksjoner ble anvendt i disse studiene, uten cancercellespesifikke promotere og herunder gener for mindre celle-toksiske proteiner, f.eks tumor suppressor protein p53. Videre vil en apoptotisk protein slik som p53 mest sannsynlig ikke umiddelbart føre til ødeleggelse av den transfekterte celle derfor øke muligheten for at overdreven p53 kan bli frigitt fra den transfekterte celle eller mer sannsynlig, parakrin eller interleukin-mediert signalisering kan bli aktivert i det omgivende vev.
Selv om aerosol søknad virker lovende for fremtidig behandling av alvorlige lungesykdommer, bør det tas i betraktning at denne type terapi virker også mye som en stram line tur. Faktisk vil sannsynligheten for alvorlige bivirkninger, som for eksempel inflammasjon eller allergiske reaksjoner, øker med toksisitet og irritabilitet av de anvendte stoffer, som dermed begrenser fordelen ved inhalasjon. Bekymringer som disse kan ha blitt ansett særlig for aerosol-anvendelse av cytotoksiske stoffer som for eksempel paclitaxel [6] eller doksorubicin [5], men kan også være relevant for anvendelse av nukleinsyrer. Faktisk en potent immunsystem virker ikke bare på fremmede patogener, men også på ikke-virale vektorer og nukleinsyrer. Imidlertid har bare en svak økning av cytokiner blitt beskrevet for aerosol-anvendelse av forgrenede PEI til lungene [24], [25], [26]. Dessuten inflammasjon på grunn av immunreaksjoner, kan alvorlige bivirkninger som utvikles fra ødelagt vev. I denne forbindelse den spesielle arkitekturen av lungene bør vurderes. Den høye forekomst av blodårene øker følsomheten for livstruende blødninger lunge (hemoptysis), som kan bli indusert av celle giftige stoffer [27]. Under denne betraktning er det sannsynlig at tumorcellespesifikke plasmider som BC-819 som bare ødelegger svulsten, men ikke friskt vev kunne bringe lovende fordeler for aerosol behandlingen av lunge cancer.
