Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en svært aggressiv sykdom med få behandlingsalternativer. I denne studien undersøker vi hvilken rolle protein kinase C zeta (PKCζ) i kreft i bukspyttkjertelen celler. PKCζ har vist seg å virke som enten en tumor suppressor eller svulst promoter avhengig av cellulær kontekst. Vi finner at PKCζ uttrykk enten opprettholdt eller forhøyet i primære humane pankreastumorer, men er aldri tapt, i samsvar med PKCζ spiller en fremmende rolle i kreft i bukspyttkjertelen fenotype. Genetisk inhibering av PKCζ redusert vedheftende vekst, celleoverlevelse og forankrings-uavhengig vekst av humane kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro. Videre PKCζ hemning redusert ortotopisk tumorstørrelse in vivo ved inhibering av tumorcellevekst og øke tumor nekrose. I tillegg PKCζ hemming redusert tumormetastaser in vivo, og forårsaket en tilsvarende reduksjon i kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon
in vitro
. Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er ofte konstitutivt aktiv i kreft i bukspyttkjertelen, og spiller en viktig rolle i kreft i bukspyttkjertelen celle overlevelse og metastasering. Interessant, hemming av PKCζ betydelig redusert konstituerende STAT3 aktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Farmakologisk inhibering av STAT3 lignet fenotypen av PKCζ inhibering, og ekspresjon av en konstitutivt aktiv STAT3 konstrukt reddet den transformerte fenotype i PKCζ-manglende celler. Vi konkluderer med at PKCζ er nødvendig for kreft i bukspyttkjertelen celle transformert vekst og invasjon in vitro og tumorigenesis in vivo, og at STAT3 er en viktig nedstrøms formidler av de pro-kreftfremkallende effekter av PKCζ i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation.: Butler AM, Scotti Buzhardt ML, Li S, Smith KE, Fields AP, Murray NR (2013) Protein Kinase C Zeta Regulerer menneskelig kreft i bukspyttkjertelen Cell forvandlet Vekst og Invasion gjennom en STAT3 avhengige mekanismen. PLoS ONE åtte (8): e72061. doi: 10,1371 /journal.pone.0072061
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: May 16, 2013; Godkjent: 05.07.2013; Publisert: 28 august 2013
Copyright: © 2013 Butler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av: NIH /NCI R03 CA143164, NIH /NCI R01CA140290 (NRM), Daniel Foundation of Alabama postdoktorstipend (MLS), NIH /NCI F31 CA168117 (AMB), NIH /NCI R01 CA081436-16 (APF), The Mayo Clinic Foundation (NRM, APF). APF er Monica Flynn Jacoby Velsignet Professor of Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: En foreløpig patent knyttet til denne forskningen har blitt arkivert (MSB, APF, NRM, Metoder og materialer for behandling av kreft i bukspyttkjertelen, US patentsøknad # 20110190390). Co-forfatter Alan Fields er en akademisk redaktør for PLoS ONE. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er den tiende vanligste diagnosen kreft i USA, og en fjerdeplass i letalitet [1]. Den samlede fem års overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen er mindre enn 5% og har ikke vesentlig forbedret i løpet av de siste 30 årene. Dødeligheten av kreft i bukspyttkjertelen tilskrives delvis til resistens mot eksisterende kjemoterapier [2]. Karakterisering av nye onkogene signalveier i bukspyttkjertelkreft kan føre til identifisering av mer effektive terapeutiske mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling.
Protein kinase C (PKC) har vært innblandet i tumorigenesis i over 30 år, siden det var første karakterisert som en reseptor for tumorfremmende forbolestere [3]. PKC er nå kjent for å være en familie av relaterte isoformer, og nylige studier har karakterisert de spesifikke roller til individuelle isoformer i mottakelighet for, og utvikling av, kreft [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], [10]. Selv medlemmer av atypisk PKC (aPKC) sub-familie av PKC isoformer er i stand til å binde og aktiveres av forbolestere har deres potensielle rolle i kreft fenotype også blitt undersøkt. De to aPKCs, PKC iota (PKCι) og PKC zeta (PKCζ), er strukturelt lik; Men embryonale knockout av hver aPKC avslører unike fenotyper, noe som tyder på ikke-redundante funksjoner i utvikling og kreft [11], [12]. PKCι fremmer kreftutvikling i musemodeller av lunge og tykktarmskreft, og er et onkogen i kreft [5] lunge og ovarie, [6], [13], [14], [15]. Tilsvarende har vi demonstrert en pro-kreftfremkallende rolle for PKCι i kreft i bukspyttkjertelen celler [16]. Derimot har både svulst PROMOTIVE og tumor suppressor roller blitt tilskrevet PKCζ [4], [17], [18], men dens rolle i kreft i bukspyttkjertelen er ikke evaluert. I denne studien, viser vi at PKCζ er forhøyet i en undergruppe av menneskelige bukspyttkjertelen tumorvev i forhold til tilpasset normal bukspyttkjertelen epitel. Videre viser vi at hemming av PKCζ i kreft i bukspyttkjertelen celler hemmer kreft fenotype betydelig. Våre data også identifisere STAT3 som en viktig formidler av PKCζ i den transform vekst og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Biospecimens ble hentet fra Mayo Clinic Tissue registret under en godkjent Mayo Clinic Institutional Review Board protokollen. Alle dyreforsøk ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Animal Care og bruk komité.
Pasientprøver
RNA ble isolert fra et sett av bukspyttkjertelen adenokarsinom pasientprøver som frossen, sammen svulst og ikke- svulst bukspyttkjertelen vev var tilgjengelig som beskrevet [16]. Hematoxylin og eosin (H E) -stained deler av matchet svulsten og tilstøtende, ikke-tumor bukspyttkjertelen vev ble analysert for å bekrefte den aktuelle histologi
Reagenser og cellekultur
Menneskelig bukspyttkjertelkreft celle. linjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection og alle eksperimenter ble utført med celler som passeres mindre enn 6 måneder. Humane pankreas cancer-cellelinjer ble holdt i en 5% CO
2 fuktet vevskulturinkubator i DMEM med 10% FBS som anbefalt av American Type Culture Collection. Antistoffer ble hentet fra følgende kilder: PKCζ, β-actin, fosfor-Stat3 (Y705), Stat3, fosfor-ERK1 /2, ERK1 /2 og kløyvet caspase-3 (cellesignalisering Technologies), PKCι (BD Transduction Laboratories), 5-brom-2′-deoxyuridine (BrdUrd) (DakoCytomation) og FLAG (Sigma Life Sciences).
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp RNAqueous Isolation Kit (Ambion) i henhold til produsentens protokoller. TaqMan® Gene Expression analyse primer og probe sett (Applied Biosystems) ble brukt for sanntids, kvantitativ PCR (qPCR) analyse av hGAPDH (Hs99999905_m1), hPKCζ (Hs00177051_m1) og 18S (Hs99999901_s1). qPCR-analyser ble utført ved anvendelse av 10 ng av cDNA (GAPDH og hPKCζ) eller 2 ng cDNA (18S) på en Applied Biosystems 7900 thermal cycler. Data ble evaluert ved bruk av SDS 2,3 programvarepakken. Genuttrykk i pankreastumorer og i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble normalisert til 18S og GAPDH hhv. Alle data er uttrykt som 2
– (
CT product: (mål) –
CT plakater (endogen referanse)).
Immunohistochemistry og uttrykk analyse
Vevene ble behandlet for immunhistokjemisk analyse (IHC) som tidligere beskrevet [19]. PKCζ og fosfor-STAT3 farging ble visualisert ved hjelp av Envision Plus Anti-Rabbit Merket Polymer-HRP (Dako). Bilder ble tatt med Aperio ImageScope og analysert med Aperio Spectrum programvare.
Hemming av PKCζ uttrykk
lentiviral vektorer som uttrykker kort hårnål RNA interferens (RNAi) konstruerer rettet mot menneske PKCζ ble generert og brukes til å oppnå stabil transfektanter som tidligere beskrevet [20]. PKCζ RNAi # 1 konstruere rettet mot en sekvens i kodingen regionen PKCζ (GTTGTTCCTGGTCATTGAGTA) og PKCζ RNAi # 2 konstruere rettet mot en sekvens i tre utranslaterte område av PKCζ (GACAGACGCTTGCGCCGAGAC). Cellepopulasjoner bærer lentiviral konstruksjoner ble valgt og vedlikeholdt av inkludering av puromycin i kulturmedier.
Cell kvantifisering analyse
Celleviabilitet ble vurdert ved MTT-analyse (CellTiter 96 vandige løsning, Promega) , som anbefalt av produsenten. Kreft i bukspyttkjertelen celler, Panc-1 (1 × 10
3 celler /brønn) og MiaPaCa-2 (1 × 10
2 celler /brønn) ble dyrket i en 96-brønns plate for 1, 3, 5 og 7 dager før analysen.
Celledød analysen
Celledød ble analysert ved hjelp av celledød Detection ELISA Plus-analysen (Roche) i henhold til produsentens protokoll.
Anchorage- uavhengige vekstanalyser
Panc-1 og MiaPaCa-2 celler (5 × 10
3) ble belagt i myk agar og vurderes for forankringsuavhengig vekst som beskrevet tidligere [21].
ortotopiske tumormodell
Panc-en menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler (1 x 10
6) bærer en retroviral vektor koding ildflue luciferase pSIN-Fluc [22] og uttrykker enten NT [16] eller PKCζ RNAi var blandet med vekstfaktor redusert Matrigel (Becton Dickinson) og injisert i den proksimale bukspyttkjertel fra 4-6 uker gamle atymiske nakne mus (
n
= 16). Alle operasjoner ble utført under isofluran anestesi, og mus ble administrert buprenorfin som et smertestillende umiddelbart før og ~18 timer etter kirurgi for å minimalisere dyr ubehag. Tumorbærende mus ble overvåket daglig for tegn på stress og to ganger i uken for vekttap. Tumorvekst ble overvåket ukentlig av fluorescens bildebehandling. I korte trekk ble mus injisert intraperitonealt med D-Luciferin oppløsning (Xenogen) ved en dose på 150 mg /kg kroppsvekt, bedøvet med isofluran og avbildes med et biolumine-avbildningssystem (Sylinder biovitenskap-Xenogen, Hopkinton, MA). En time før avlivning, ble musene injisert intraperitonealt med 100 mg /kg BrdUrd.
ortotopisk tumor analyse
tumorer fra mus injisert med PKCζ RNAi-celler ble formalin-fiksert og analysert for proliferasjon (BrdUrd inkorporering) ved immunhistokjemi (IHC), som tidligere beskrevet for NT RNAi tumorer [16]. Apoptose ble bestemt ved påvisning av caspase-3-spalting som beskrevet tidligere [19], [23]. Tumor nekrose ble identifisert i H E farget vev. Spektrum programvare ble anvendt for å beregne prosent nekrotisk tumorområdet ved å dividere nekrotiske tumorområdet av total tumor område. Tumormetastaser ble identifisert ved grov anatomisk evaluering av buk og bryst organer ved gjennomføring av studiet, og verifisert av H E farging av metastatiske lesjoner som beskrevet for NT RNAi svulster [16]
Cellular invasjon analysen
Cellular invasjonen ble analysert ved hjelp av Matrigel-belagte invasjons kamre (BD Biosciences) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, 5 x 10
4 humane kreft i bukspyttkjertelen celler ble sådd ut i serumfritt media i den øverste kammer, og DMEM inneholdende 2,5% FBS ble anvendt som kjemoattraktant i bunnkammeret. Celler ble tillatt å invadere i 24 timer ved 37 ° C og cellene ble deretter fiksert, farget og kvantifisert som tidligere beskrevet [20].
Ekspresjon av konstitutivt aktiv STAT3 (STAT3-C)
celler ble infisert med Adeno-Null eller FLAG tagget-Adeno-STAT3-C [24]. Proteinekspresjon ble bestemt ved immunoblotanalyse av totale cellelysater. Immunoblot analyse ble utført på celler isolert på 60-80% samløpet.
Statistisk analyse
To-veis ANOVA og Student
t
-test ble brukt for å vurdere statistisk signifikans av resultatene.
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
PKCζ er forhøyet i en undergruppe av menneskelige pankreastumorer
Vi startet vår studie ved å evaluere PKCζ uttrykk i primære humane pankreastumorer og omkringliggende ikke-svulstvev (figur 1). Klinisk og demografisk informasjon for denne pasientpopulasjonen er publisert [16]. Immunohistokjemisk påvisning av protein i PKCζ representative pankreas tumorvev avslørte en variabel grad av PKCζ uttrykk som lokalisert til både kjernen og cytoplasma (figur 1A). PKCζ ekspresjon ble også påvist ved en variabel, men lavere nivå i ikke-tumor, pankreatiske celletyper (figur 1B). Holmen og akinærceller av ikke-tumor bukspyttkjertelen viste lav PKCζ uttrykk (figur 1B, venstre panel). Uttrykket av PKCζ i duktale cellene var lik, eller litt høyere enn, uttrykket i holmen og akinærceller (figur 1B, høyre panel). Vi evaluerte neste PKCζ mRNA uttrykk i et panel av 28 paret menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom og tilstøtende, ikke-tumor bukspyttkjertelen. PKCζ mRNA-ekspresjon ble påvist i alle 28 primære pankreastumorer analysert (data ikke vist). Analyse av parede prøver viste at PKCζ ekspresjon var signifikant høyere i tumorer enn i sammenkoblet, ikke-tumorvev (figur 1C). PKCζ mRNA-ekspresjon ble betydelig forhøyet i 25% av pankreatiske tumorer, sammenlignet med gjennomsnittet PKCζ mRNA-ekspresjon i ikke-tumor bukspyttkjertelen, og ingen tumorer oppviste en signifikant reduksjon i PKCζ mRNA-ekspresjon (Fig 1 D). Analyse av forholdet mellom PKCζ mRNA-ekspresjon og pasientoverlevelse ble utført, men i dette lille kohort ble ikke observert noen korrelasjon
A og B) IHC påvisning av PKCζ ekspresjon i representative humane pankreatiske tumorer (A;. Tumor) og tilstøtende ikke-svulstvev (B; Normal). B) seriesnitt farget med H E er gitt for å skille acinar, holme (øverst til venstre bildet, bukspyttkjertelen holmen skissert) og duktale celler (øverst til høyre bilde). Alle bilder i samme panel er de samme forstørrelse. Barer = 100 mikrometer. C) Kvantitativ PCR analyse av PKCζ mRNA-ekspresjon ble utført på 28 pasienter passet pankreatisk adenokarsinom og ikke-tumorprøver. PKCζ uttrykk var normalisert til 18S overflod; * P = 0,001 beregnes ved å sammenkoblet
t
-test. D) PKCζ uttrykk er signifikant forhøyet i en undergruppe av bukspyttkjertelsvulster. PKCζ ble overexpressed i 25% av pankreastumorer analysert, som definert av svulst mRNA overflod større enn 2 standardavvik over gjennomsnittet av PKCζ mRNA overflod i alle tilstøtende ikke-tumor bukspyttkjertelen prøver.
PKCζ regulerer transformert fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro
for å vurdere hvilken rolle PKCζ i bukspyttkjertelkreft fenotype, brukte vi to forskjellige RNAi konstruerer å hemme PKCζ uttrykk i to veldefinerte menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, Panc- direkte 1 (figur 2A) og MiaPaCa-2 (figur S1A). Stabilt utvalgte cellepopulasjoner gående oppviste 70% eller større inhibering av PKCζ mRNA-ekspresjon, med en tilsvarende reduksjon i PKCζ proteinekspresjon (figur 2A og S1A). Selektivitet av den PKCζ målrettede RNAi-konstruksjoner som er bekreftet av den manglende effekt av disse konstruksjoner for ekspresjonen av det nært beslektede atypisk PKCι isozym (figur 2A og S1A). Inhibering av PKCζ ekspresjon resulterte i en liten, men signifikant reduksjon i log-fase, adherente cellevekst (figur 2B og S1B) og en økning i basal celledød (figur 2C). Videre PKCζ slå ned (KD) betydelig redusert kreft i bukspyttkjertelen celle forankringsuavhengig vekst (soft agar-kolonidannelse) (figur 2D og S1C), noe som indikerer at PKCζ er avgjørende for kreft i bukspyttkjertelen celle overlevelse og transformert fenotype.
PANC-1-celler som stabilt bærer lentivirus uttrykker enten kontroll, ikke-målsøkende (NT) eller PKCζ-målretting RNAi (z1 og z2) ble vurdert for A) PKCζ og PKCι protein ekspresjon ved immunoblotanalyse (øverst), og PKCζ mRNA overflod av qPCR-analyse (nederst); B) celleviabilitet (MTT kolo assay); C) cellulær død (påvist ved celledød Detection ELISA) og D) krings-uavhengig vekst (kolonidannelse i bløt agar). For hver panel Bars = gjennomsnitt på 3 eller flere gjentak ± SD og grafen er representativ for 3 eller flere uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 vs NT
PKCζ spiller en avgjørende rolle i bukspyttkjertelen tumorigenesis
Vi undersøkte neste effekten av PKCζ KD på bukspyttkjerteltumordannelse og vekst ved hjelp av en tidligere beskrevet Panc- 1 orthotopic tumor modell [16]. Panc-1-celler som uttrykker ildflue luciferase genet (pSIN-Fluc) og enten NT eller PKCζ RNAi ble injisert i bukspyttkjertelen på nakne mus for å danne ortotopiske svulster. Tumorveksten ble overvåket ved bioluminescens deteksjon (figur 3A), og musene ble høstet 5 uker etter inokulering. Tumordannelse ble observert i alle mus injisert med PANC-1-celler som uttrykker enten RNAi konstruere; Men endelig bukspyttkjertelen vekt var signifikant lavere hos mus med PKCζ RNAi svulster, på grunn av redusert tumorstørrelse (figur 3B og 3C). Vi antok at, i likhet med virkningen av PKCζ KD in vitro (figur 2B-D), den reduserte tumorstørrelse av PKCζ KD Panc-1-celler in vivo var redusert tumorcelle-proliferasjon og forbedrede tumor celledød. Nivået av BrdUrd innlemmelse, er et mål på tumor proliferasjon, ble evaluert i Panc-1 PKCζ RNAi tumorer og i forhold til nivået av BrdUrd inkorporering i Panc-1 NT RNAi tumorer [16]. Som spådd, ble tumor spredning betydelig redusert i PKCζ RNAi svulster i forhold til NT RNAi svulster (Figur 4A). Interessant, vi ikke observerer en signifikant effekt av PKCζ KD på tumor apoptose, oppdaget av kløyvde caspase-3 (figur 4B). Men PKCζ RNAi svulster hadde signifikant høyere nivå av nekrose enn NT RNAi tumorer (figur 4C og 4D). Tumor nekrose resultater fra en opphopning av tumor celledød, som kan oppstå når en svulst vokser fra sin blodforsyning. Selv PKCζ RNAi svulster er drastisk mindre enn NT RNAi svulster, har de ikke en reduksjon i tumorblodårer tetthet som kvantifisert ved CD31 flekker (figur 4E). Disse data tyder på at den reduserte tumorvolum av PKCζ RNAi pankreastumorer er et resultat av den kumulative effekten av redusert celleproliferasjon og overlevelse over tidsforløpet for in vivo-forsøket.
A) Representative bioluminescent avbildning av mus med ortotopiske Panc-1 NT og PKCζ RNAi pankreastumorer. B) Representant H E farget deler av ortotopiske Panc-1 NT og PKCζ RNAi pankreastumorer. De resterende normal mus bukspyttkjertelen er innringet i blått. C) Inhibering av PKCζ betydelig redusert bukspyttkjertelen og ortotopisk tumorvekt; n = 16; * P. 0,001
A) Kvantitativ analyse av tumor spredning oppdaget av BrdUrd innlemmelse; * P 0,003. B) Kvantitativ analyse av tumor apoptose detekteres av spaltede caspase-3-farging. C) Representant H E farget ortotopiske Panc-1 NT og PKCζ RNAi bukspyttkjertelsvulster med områder med nekrose identifisert (gul omriss) (bar = 1 mm). Grønn linje markerer svulstvev. D) Kvantitativ analyse av tumor nekrose plottet som prosent av det totale tumorområdet; * P 0,0002. E) Kvantitativ analyse av tumor vaskularitet, som bestemt ved prosent område CD31-farging. A-E)
n
= 16 NT RNAi svulster og 15 PKCζ RNAi svulster. F) Panc-1 NT og PKCζ RNAi celler (Z1 og Z2) ble vurdert for cellulær invasjon gjennom Matrigel-belagte kamre. Bars = gjennomsnitt på 3 eller flere paralleller +/- SD og grafen er representativ for 2 eller flere uavhengige forsøk. * P. 0,05 vs NT
PKCζ spiller en viktig rolle i kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon
I bukspyttkjertelen orthotopic tumormodell, Panc-1 cellene danner både primære svulster og metastatiske lesjoner [16]. Metastaser nyre, lever, pessar, og mesenteriet ble observert i mer enn 50% av musene som bærer NT RNAi tumorer (tabell 1, [16]). I motsetning til dette ble ingen tumormetastase til mesenteriet eller membranen er identifisert i mus som bærer PKCζ RNAi tumorer; bare 2 av 15 PKCζ RNAi tumor-bærende mus (13%) hadde metastaser til sine nyrer, og bare 1 av 15 PKCζ RNAi tumor-bærende mus (6%) hadde en levermetastaser (tabell 1). Disse dataene er konsistent med en hemmende effekt av PKCζ KD på bukspyttkjerteltumormetastaser. Men vi kan ikke utelukke muligheten for at redusert metastase observert i PKCζ RNAi svulster kan være sekundært til betydelig redusert størrelsen på svulster. Hvis PKCζ regulerer tumormetastaser in vivo, er det sannsynlig at også regulere aspekter av metastatiske fenotype, slik som cellulær invasjon, in vitro. Faktisk, cellular invasjon ble betydelig redusert i PKCζ RNAi celler, sammenlignet med NT RNAi kreft i bukspyttkjertelen celler (Figur 4F og S2). Disse resultatene viser en rolle for PKCζ i bukspyttkjertelkreft celle invasjon, og er i samsvar med en rolle for PKCζ i metastatisk fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler in vivo.
PKCζ regulerer STAT3 aktivering
Signal svinger og aktivator av transkripsjon-3 (STAT3) er en transkripsjonsfaktor som integrerer mange ekstracellulære signaler å regulere kreftfremmende cellulære prosesser [25], [26]. Konstitutiv STAT3 aktivering er et kjennetegn på mange humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [27]. STAT3 aktivering fremmer onkogene fenotypen av kreft i bukspyttkjertelen, og tap av STAT3 hindrer kreft i bukspyttkjertelen utvikling og progresjon i en musemodell av
Kras
-mediert bukspyttkjertelkreft [27], [28]. Videre inhibering av STAT3 aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler reduserer også celleoverlevelse, invasjon og tumorvekst [28], [29]. Gitt den slående likheten mellom rapporterte fenotype av STAT3 hemming og fenotype vi observert med hemming av PKCζ, spurte vi om PKCζ uttrykk regulerer STAT3 aktivitet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. En betydelig reduksjon i STAT3 aktivering, oppdages som fosforylering av STAT3 på Tyr705, ble observert i kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker PKCζ RNAi (5A og S3A). Videre STAT3 aktivering var signifikant redusert i PKCζ RNAi tumorer sammenlignet med NT RNAi tumorer (figur 5B), noe som indikerer at PKCζ regulerer STAT3 aktivering i bukspyttkjertelcancerceller både in vitro og in vivo. Siden PKCζ har også vært implisert i regulering av ERK1 /2-aktivering i kreft og ikke-kreftcelletyper [30], [31], [32], [33], analyserte vi effekten av PKCζ RNAi på ERK1 /2 fosforylering i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. I motsetning til STAT3 fosforylering, ble ERK1 /2 fosforylering ikke endret ved en betydelig reduksjon i PKCζ uttrykket (figurene 5A og S3A) som tyder på at PKCζ uttrykk ikke regulerer signalisering gjennom de ERK1 /to signalveien.
A) Inhibering av PKCζ uttrykket avtar konstitutiv aktivering STAT3 (detektert som fosfo-STAT3 Y705), men ikke ERK1 /2-aktivering (påvist som fosfo-ERK1 /2). Immunoblot analyse ble utført på totale cellelysater fra Panc-1 NT og PKCζ RNAi celler (til venstre) og uttrykk analyse av immunoblot påvisning ble utført (til høyre)
n
= 3. B) Representant IHC påvisning av p-STAT3 i ortotopiske Panc-1 NT og PKCζ RNAi bukspyttkjertelsvulster (til venstre), bar = 50 mikrometer. Kvantitativ analyse av pSTAT3 IHC-farging (til høyre). C-E) Virkningen av STAT3 inhibitor (S3I-201) på C) STAT3 fosforylering, D) krings-uavhengig vekst i myk agar og E) cellulær invasjon gjennom Matrigel-belagte kamre. I alle analyser, ble S3I-201 ble brukt ved 100 um og et like stort volum DMSO anvendt som kontroll fortynningsmiddel. For invasjon analysen ble cellene forbehandlet med S3I-201 eller DMSO i 48 timer før oppstart av analysen. Bars = gjennomsnitt på 3 eller flere paralleller +/- SD, og grafen er representativ for 2 eller flere uavhengige forsøk. * P. 0,05
STAT3 hemming reduserer transformert fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler
For å avgjøre om redusert STAT3 aktivisering kan være ansvarlig for noen av virkningene av PKCζ KD, vi vurdert virkningen av en farmakologisk inhibitor av STAT3 på den transformerte fenotypen til kreft i bukspyttkjertelen celler. Behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med S3I-201, et lite molekyl som forstyrrer STAT3 SH2-phospho-tyrosin interaksjoner [34], redusert STAT3 aktivering (figur 5C og S3b) og betydelig redusert forankringsuavhengig vekst (figur 5D) og cellulær invasjon ( Figur 5E og S3C), tilsvarende effekten av PKCζ inhibering. Samlet utgjør disse dataene viser at hemming av PKCζ uttrykk reduserer STAT3 aktivitet i bukspyttkjertelen kreftceller, og at PKCζ uttrykk og STAT3 aktivitet positivt regulere bukspyttkjertelkreft celle forvandlet vekst og invasjon.
konstitutivt aktiv STAT3 kan rekonstituere forvandlet fenotype i PKCζ RNAi bukspyttkjertelen kreftceller
for å teste hypotesen om at STAT3 er en kritisk nedstrøms effektor av PKCζ i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi vurdert om uttrykk for en konstitutivt aktiv STAT3 konstruksjon (STAT3-C) kan redde effekten av PKCζ hemming i Panc-1 celler. Panc-1 NT og PKCζ RNAi celler ble infisert med adenovirus uttrykker flagg-merket, STAT3-C eller kontroll (null) adenovirus (Figur 6A). Uttrykk for STAT3-C betydelig gjenvunnet forankringsuavhengig vekst av Panc-1 PKCζ RNAi celler, uten vesentlig påvirker forankringsuavhengig vekst av NT RNAi celler (Figur 6b). I tillegg ble den reduserte cellulære fenotype invasjon av PKCζ RNAi-celler i betydelig grad utvunnet ved ekspresjon av STAT3-C (figur 6C). Samlet utgjør disse data viser at økt cellulær STAT3 aktivitet kan redde anti-onkogen fenotypen til PKCζ RNAi-celler, og viser at PKCζ medierer bukspyttkjertelkreft celletransformasjon, i hvert fall delvis, gjennom regulering av STAT3 aktivitet.
Panc-1 celler uttrykker NT eller PKCζ RNAi ble infisert med adenovirus konstruksjoner som uttrykker enten null (kontroll), eller konstitutivt aktiv, FLAG-merket STAT3 (STAT3-C). A) Immun analyse av p-STAT3, STAT3, FLAG, PKCζ og β-aktin uttrykk. Celler ble undersøkt med hensyn B) krings-uavhengig vekst i myk agar og C) cellulær invasjon gjennom Matrigel-belagte kamre. For hver graf: Barer = gjennomsnitt på 3 eller flere gjentak ± SD og grafen er representativ for 2 eller flere uavhengige forsøk. * Betydelig redusert i forhold til NT /null, p 0,05; ** Signifikant økt i forhold til null-behandlet, p. 0,05
Diskusjoner
Funksjonelle studier har vist at rollen PKCζ i regulering av kreft fenotype varierer avhengig av tumortype, modell system og stadium av sykdommen. For eksempel, hemming av PKCζ ekspresjon i en tykktarmskreft cellelinje reduserer proliferasjon in vitro og in vivo tumorstørrelse; men betyr genetisk hemming av PKCζ i mus tarmepitelet ikke påvirke tumorgenese i APCmin /+ mus modell av intestinal cancer initiering og progresjon [7], [35]. I kontrast, genetisk hemming av PKCζ i en musemodell for
Kras
G12D
indusert lunge tumorigenesis avslører en tumor suppressor rolle [4], mens hemming av PKCζ uttrykk i lungekreftceller har ingen effekt på forvandlet vekst in vitro [20]. I denne studien, vurderte vi den spesifikke rollen PKCζ i biologi kreft i bukspyttkjertelen celler, ved hjelp av PKC isotype-spesifikke RNAi å hemme PKCζ uttrykk. Vi viser at PKCζ KD redusert kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og celleoverlevelse in vitro. Vi viser videre at PKCζ KD i kreft i bukspyttkjertelen celler transformert vesentlig redusert vekst in vitro, som svarer til en betydelig reduksjon i tumorstørrelse in vivo. Disse dataene antyder sterkt at PKCζ er nødvendig for vedlikehold av transformert fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler.
PKCζ har vært innblandet i invasiv fenotype av kreft hos mennesker [36], [37], [38]. RNAi-mediert, spesifikk hemming av PKCζ reduserer brystkreft og glioblastom celle invasjon in vitro [37], [38] og reduserer prostatakreft celle invasjon in vitro og in vivo [36]. Interessant, attributter hver av disse rapportene PKCζ til en tydelig invasiv signalveien, noe som antyder en rolle for bred PKCζ i kreftcellen invasjon [36], [37], [38]. I samsvar med den fenotype observert i andre kreftformer, bestemte vi at hemming av PKCζ uttrykk ikke bare hemmet forvandlet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler, men også undertrykt sitt invasiv potensial in vitro. Videre PKCζ KD betydelig redusert pankreatisk tumor-metastaser, og indikerer at PKCζ regulerer bukspyttkjerteltumorcelle-invasjon in vivo, så vel som in vitro.
prognostisk verdi av PKCζ uttrykk i kreft er ikke godt dokumentert. Imidlertid har flere nylige rapporter innblandet PKCζ som en prediktor for dårlig resultat for kreftpasienter. Høy PKCζ spår dårlig sykdomsspesifikk overlevelse av pasienter med bløtvevssarkom [39]. Likeledes er PKCζ forhøyet i prostatakreft, og høy PKCζ uttrykk spår dårlig overlevelse av prostatakreftpasienter [36]. Vi evaluerte uttrykk for PKCζ i kreft i bukspyttkjertelen, og funnet ut at PKCζ var tydelig forhøyet i et sub-sett av bukspyttkjertel kreft. Men vår lille utvalgsstørrelse kombinert med dårlig generelle prognose av kreft i bukspyttkjertelen pasienter utelukket fastsettelse av en potensiell prognostisk rolle PKCζ uttrykk. Løpende vev samlingene vil lette fremtidig etterforskning av evne til PKCζ uttrykk for å forutsi utfallet i en større kohort av bukspyttkjertelen kreftpasienter.
Mens PKCζ uttrykket har nylig blitt karakterisert til å være forhøyet og forutsi dårlig overlevelse i flere krefttyper [36 ], [39], er lite kjent om regulering av PKCζ uttrykk. Imidlertid PKCζ er blitt vist å bli aktivert av flere signalveier som er kjent for å fremme onkogene signalisering i bukspyttkjertelkreft. Fosfatidylinositol-3,4-5-trisphosphate (ptdins-3,4,5-P3), produktet av fosfoinositid 3-kinase, kan direkte binde og aktivere PKCζ, og aktiverer også ptdins-3,4,5-P3-aktivert phosphoinositide-avhengig kinase 1-mediert fosforylering og aktivering av PKCζ [40], [41], [42]. I hodet og nakke plateepitel karsinom celler, er PKCζ tyrosin fosforylert og aktivert av epidermal vekstfaktor reseptor [31]. Fremtidige studier vil undersøke om noen av disse banene, både ofte dysregulerte i kreft i bukspyttkjertelen, modulerer PKCζ signalering i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer.
I motsetning til vår observasjon at hemming av PKCζ trykt bukspyttkjerteltumorvekst og metastasering, genetisk hemming av PKCζ i
Kras
G12D
indusert lungesvulster fremmer tumorvekst og progresjon [4]. Svulsten undertrykkende rolle PKCζ i K-ras-mediert lunge tumorigenesis medieres ved undertrykkelse av STAT3 aktivering i tumorcellene [4].
