Abstract
Formålet med denne studien var å fastslå den cytotoksiske og apoptotiske virkninger av erythrocarpine E (CEB4), en limonoid hentet fra
chisocheton erythrocarpus
på menneskelig muntlig plateepitelkarsinom. Basert på foreløpige dimetyl-2-tiazolyl-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) analyser, CEB4 behandlet HSC-4-celler viste en cytotoksisk effekt og hemmet celleproliferasjon i en tid og doseavhengig måte med en IC
50 verdi på 4,0 ± 1,9 uM innen 24 timer etter behandling. CEB4 ble også funnet å ha minimal cytotoksiske virkninger på den normale cellelinje, NHBE med cellelevedyktighetsnivået opprettholdes over 80% etter behandling. Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC), poly-ADP-ribose polymerase (PARP) spaltningsseter og DNA-fragmentering analyseresultatene viste at CEB4 induserer apoptose mediert celledød. Western blotting resultater viste at induksjon av apoptose ved CEB4 ut til å være formidlet gjennom regulering av p53 signalveien som det var en økning i p53 fosforylering nivåer. CEB4 ble også funnet å opp-regulerer den pro-apoptotiske protein, Bax, mens nedregulering av anti-apoptotiske protein, Bcl-2, noe som tyder på involvering av den indre mitokondrie reaksjonsvei. Reduserte nivåer av initiativtaker procaspase-9 og bøddel caspase-3 zymogen ble også observert etter CEB4 eksponering, derav indikerer involvering av cytokrom c mediert apoptose. Disse resultatene viser den cytotoksiske og apoptotisk evne erythrocarpine E, og foreslå sitt potensial utvikling som en kreft chemopreventive middel
Citation. Nagoor NH, Shah Jehan Muttiah N, Soon Lim C, I LLA, Mohammad K, Awang K (2011) Regulering av apoptotisk Effekter av Erythrocarpine E, en cytotoksisk Limonoid fra
chisocheton erythrocarpus
i HSC-4 menneske~~POS=TRUNC Oral kreftceller. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10,1371 /journal.pone.0023661
Redaktør: Paul C. Driscoll, MRC National Institute for Medical Research, USA
mottatt: 5 mai 2011; Godkjent: 22 juli 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Nagoor et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Universitetet i Malaya Graduate stipend (PPP) (PS166-2008B), departementet for vitenskap, teknologi og innovasjon (Mosti) eVitenskap Fund (12-02-03-2022), University of Malaya stipend (UMRG ) (RG0008 /09BIO), og Senter for Natural Product Forskning and Drug Discovery (Cenar) Grant (4.911.274). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ulike naturlige phytocompounds har blitt vist og undersøkt grundig som potensielle anti-kreft agenter. Omtrent 74% av narkotika som ble godkjent for kreftbehandling er hentet fra naturlige kilder, enten skapt av strukturelle endringer eller syntetisert og designet basert på naturlige forbindelser som modell [1]. De fleste av naturlig antikreftmidler som er tilgjengelige til nå er avledet fra planter, dyr, marine organismer og mikroorganismer. Noen tiden anvendte eksempler på plante-avledede forbindelser med potensielle anti-kreft-aktivitet er 1’S-1’acetoxyeugenol acetat og 1’S-1′-acetoxychavicol acetat [2], vinkristin, irinotecan, etoposid og paclitaxel, mens bleomycin og doxorubicin er mikrobielle-avledet forbindelser, og citarabine, avledet fra marine kilder [3].
En undergruppe av naturlige forbindelser kjent som limonoids er svært oksygenrikt tetrasykliske triterpene derivater og har blitt anerkjent for å ha interessante biologiske aktiviteter. Hittil har mange limonoids blitt isolert med et bredt spekter av biologiske virkninger inkludert insekt anti-feedant, veksthemmende egenskaper og anti-inflammatoriske midler [4]. Flere sitrus limonoid aglycones som limonin, nomilin, obacunone, isoobacunoic syre og ichangin har nylig blitt utsatt for anti-kreft screening prosedyrer, og ble funnet å indusere betydelig glutation-S-transferase (GST) og kinin reduktase (QR) aktivitet i lever og tarmslimhinnen hos mus og rotter henholdsvis [5] – [6]. Andre rapporter har indikasjoner på at blandinger av limonoid aglycones med limonoid glucosides ble like potente tamoxifen for å hemme spredning av ER positiv brystkreft celler, og et enda høyere potens mot østrogen uavhengig brystkreft celler [7]. Limonoids fra etanol ekstrakt av
Azadirachta indica
(neem bark, løv og kjerneolje) ble også funnet å forårsake celledød av prostatakreftceller (PC-3) ved å indusere apoptose gjennom en reduksjon i BCL-2 uttrykk nivåer tilsvar med en økning i nivåene Bax [8].
for tiden, er prosessen med apoptose og dens relevans i kreft som den foretrukne modus for død på grunn av den effektive klaring av apoptotiske celler uten å utløse betennelse har blitt en av de prioriterte felt i kreftforskningen [9]. Nyere studier utført på limonoids hentet fra
Citrus aurantifolia
viste at forekomsten av apoptose ble formidlet gjennom induksjon av caspase-3, drevet av den indre vei og frigjøring av cytokrom-c i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler [10 ]. Den naturlige limonoid, erythrocarpine E (CEB4) som ble benyttet i denne studien, er en A, B, D-seco heptacyclic limonoid med en cinnamovl gruppe som sidekjeden ved C-3 utvunnet fra barken på
chisocheton erythrocarpus
Hiern fra mahognifamilien familien, kjent som «Rongga» i Malaysia. Det er nylig blitt demonstrert at CEB4 induserer cytotoksisk aktivitet mot P-388 murin leukemiceller ved IC
50 av 16,0 ug /ml [11]. I denne studien ble CEB4 undersøkt for dens potensial til å indusere apoptose i HSC-fire menneskelige munn plateepitelkarsinom (SCC).
Materialer og metoder
Plantemateriale
chisocheton erythrocarpus
Hiern ble samlet inn fra Hutan Simpan Terenas, Kedah, Malaysia. Prøven ble identifisert av Mr. Teoh Leng Eng fra Institutt for kjemi, Fakultet for naturvitenskap, Universitetet i Malaya. En kupong prøven (KL 4863) ble avsatt ved Institutt for kjemi Herbarium, University of Malaya.
Reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI- 1640) med 4,5 g glukose /l, 300 mg /l L-glutamin, 2,5% (volum /volum) trypsin i modifisert Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) uten kalsium eller magnesium, føtalt bovint serum (FBS) og alle antibiotika ble anskaffet fra Lonza Inc., USA. Dimetyl-2-tiazolyl-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) reagens, annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) apoptose deteksjon kit, propidiumjodid (PI), RNase og SuicideTrack ™ DNA Stige Isolering sett ble kjøpt fra Calbiochem (CA, USA).
Utvinning og isolasjon Natural forbindelse
Tørket bakken bark (1,3 kg) av
chisocheton erythrocarpus
ble ekstrahert suksessivt med heksan, diklormetan og metanol. Hver ekstrakt ble deretter tørket
i vakuum
. Det tørkede diklormetan-ekstrakt (4,0 g) ble underkastet fraksjonering ved silikagel-kolonnekromatografi under anvendelse av en løsningsmiddelblanding av heksan-etylacetat. Polariteten av den mobile fase ble øket gradvis til 100% etylacetat. Fraksjonen eluert fra 30% etylacetat, som inneholdt målforbindelsen, ble separert ved preparativ tynnsjiktskromatografi (TLC) med heksan-etylacetat (7: 3). For å gi erythrocarpine E (4,7 mg)
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og dyrkningsbetingelser
Et sett av fem humane tumorcellelinjer ble anvendt i denne studien, omfattende HSC-4, HSC-2 p-tumorcellelinjer og Ca Ski cervikal tumorcellelinje oppnådd fra Cancer Research Initiative Foundation (CARIF, Malaysia), MCF-7 bryst adenokarsinom og HepG2 hepatokarsinom som ble hentet fra University of Malaya Medical Center (UMMC), og normale menneskelige bronkiale epitelceller (NHBE) (Lonza Inc., USA) brukes som en normal cellekontroll. For rutinemessig vedlikehold HSC-4, HSC-2, Ca Ski- og HepG2-celler ble dyrket i DMEM og MCF-7-celler ble dyrket i RPMI-1640, med begge medietyper supplementert med 10% (v /v) FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. NHBE celler ble dyrket med bronkiale epitel basal medium (BEBM) med 10% (v /v) FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble dyrket som monolag ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO
2/95% luft.
MTT celleviabilitet analysen
De cytotoksiske effektene av CEB4 på alle cellelinjer ble bestemt ved anvendelse av MTT analysemetoden. CEB4 ble løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO) til en sluttkonsentrasjon på 10 mM. I korthet 1,0 x 10
4 celler pr 100 ul media ble sådd i hver brønn i en 96-brønners plate i nærvær eller fravær av CEB4 ved sluttkonsentrasjoner på 5 uM til 40 uM i opp til 24 timer. MTT (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn (10 ul /brønn) og platene ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Etter inkubering ble mediet erstattet med 200 ul DMSO og absorbansen ble målt ved 570 nm for hver brønn ved anvendelse av en mikroplateleser (Tecan Sunrise®, Sveits).
Annexin V-FITC /PI Analyse
påvisning av apoptose ble utført under anvendelse av Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit ifølge produsentens protokoll. I korte trekk, både CEB4 behandlede og ubehandlede HSC-4 og NHBE celler ble høstet ved trypsinering, vasket i 1 x PBS og farget med annexin V-FITC-konjugat og PI. Cellene ble deretter analysert ved flowcytometri (BD FACSCalibur ™, USA) ved hjelp av BD Cellquest innsamling og analyse programvare.
DNA Fragmentering Analyse
Totalt DNA ble ekstrahert fra både ubehandlet og behandlet celler med CEB4 for 12 og 24 timer ved hjelp av SuicideTrack ™ DNA Isolation Kit i henhold til produsentens protokoll. Isolert DNA ble analysert på en 1% (w /v) agarose gelelektroforese og farget med etidiumbromid. Fragmentering av DNA ble observert under UV-belysning ved bruk av en gel dokumentasjonssystem (Alpha INOTECH, USA).
Western blotting
CEB4 behandlet HSC-4-celler ble dyrket til en celletetthet på 80-90 % konfluens, vasket med iskald 1x PBS og proteiner hentet ved hjelp av NE-PER® Kjerne- og Cytoplasmatiske Extraction Kit (Pierce, USA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad DC-proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, USA). Like mengder protein ble underlagt 12% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Membranene ble deretter inkubert med ni primære antistoffer mot β-aktin, poly-ADP-ribose polymerase (PARP), p53, fosfo-p53, murin dobbelt minutt 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, procaspase-3 og procaspase-9 . Etter vasking i Tris-bufret saltvann og Tween-20 (TBST) buffer, pepperrot peroksidase (HRP) -bundne sekundære antistoffer ble tilsatt, og bundete proteiner ble påvist gjennom forbedret Chemiluminescence signaler ved hjelp av røntgenfilmer. Relative intensiteter av alle bandene ble kvantifisert ved hjelp av bildeanalyse programvare (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA).
Statistical Analysis
Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± s.d. av data oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans mellom ulike grupper ble bestemt ved hjelp av enveis ANOVA. Signifikante forskjeller ble ansett som p≤0.05.
Resultater
Isolering og karakterisering av Erythrocarpine E (CEB4)
CEB4 (erythrocarpin E) ble isolert som hvitt amorft pulver. Molekylformelen var C
36H
40o
10, som ble bestemt fra [M + H]
+ topp ved m /z 633,2703 på høy oppløsning fast atom bombardement massespektrometri (HRFABMS) . De infrarøde absorptions på 3413 cm
-1 og 1700-1730 cm
-1 indikerte tilstedeværelsen av hydroksyl og ulike karbonylgrupper. I
1 H NMR-spekteret, ble typiske topper assosiert med limonoid skjelett identifisert. Den furan sidekjeden ved δ 7,64 (
s
), δ 6,29 (
br s
), og δ 7,30 (
d
, J = 1,5 Hz) ble tilskrevet H-21, H-22 og H-23, respektivt. Signaler som følge av oksygen metin protoner av H-3 på δ 4,91 (
d
, J = 10,2 Hz) og H-17 ved δ 5,46 (
s
) var lett differensiert og tildelt basert på signalet mangfold. På den annen side, ble forekomsten av en oksygen bro som forbinder C-1 til C-29 ansett som sjelden [11]. De isolerte diasterotopic metylenprotoner fra H
2-29 ble påvist som et par av dubletter ved 3,46 og δ δ 3,88, med en koblingskonstant på 9,3 Hz. På den allyliske alkohol konstruksjonen, ble det olefiniske signal finnes på δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). Den cinnamat sidekjeden ved C-3 ble bekreftet ved nærværet av fem aromatiske protoner i regionen δ 7,10-S 7,20 og den karakteristiske dublett signaler med H-2 «og H-3» ved δ 6,25 (
d
, J = 16,0 Hz) og δ 7,58 (
d
, J = 15,7 Hz). Den relative stereostructure av erythrocarpin E ble etablert gjennom atomHauser effekt spektroskopi (NOESY). Den kjemiske strukturen til CEB4 er vist i Figur 1.
CEB4 Hemmer spredning av HSC-4 Celler
MTT-analyser ble gjennomført for å vurdere cytotoksiske egenskaper og hemmende konsentrasjon (IC
50) verdiene av CEB4 på fem humane tumor og NHBE normal cellelinjer. Resultatene indikerte at CEB4 induserer cytotoksisitet i en dose- og tidsavhengig måte over en 40,0 uM behandlingsregimet, og 24 timer med eksponering (fig. 2A og 2B). Minimal cytotoksiske effekter ble observert på NHBE celler, hvor ca. 20,0% dreping ble observert under liknende behandlingsbetingelser, i motsetning til 95% dreping i HSC-4-celler med det laveste IC
50-verdien registreres på 4,0 ± 1,9 uM blant alle celle linjer testet (tabell 1). Levedyktighet av celler behandlet med DMSO uten CEB4 ble ubetydelig påvirket ( 1,0%) (Fig. 2A og 2B) og dermed utelukker involvering av løsemiddel-indusert cytotoksisitet. Både tids- og doseavhengige forsøk understøttet behovet for å ytterligere undersøke apoptotiske effekter av CEB4 og dens potensial som en anti-tumor medikament for behandling av kreft i munnhulen. Alle de følgende forsøk ble utført basert på IC
50-verdier som oppnås fra vår nåværende MTT-data, og er oppsummert i tabell 1.
(A) doseavhengig MTT-analysen grafen på 24 h CEB4 utsettelse. (B) Tidsavhengig MTT-analysen graf ved behandling med 40,0 uM CEB4. Alle resultater ble uttrykt som total prosentandel av levedyktige celler med gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige bestemmelser. Solvent kontroller ved hjelp av DMSO ble utført på HSC-4-celler som en representant for alle andre cellelinjer.
CEB4 induserer apoptose Mediert celledød i HSC-4 Celler
neste fastslått om CEB4 cytotoksiske effektene ble formidlet gjennom apoptose. En økning i cellulær farging med FITC-konjugert annexin-V tjener som en tidlig markør for apoptose. Celler ble samtidig farget med PI å undersøke tap av cellemembranen integritet. Denne doble fargeprosedyre skiller tidlig stadium apoptotiske celler (annexin V-positive) fra sent stadium apoptotiske celler (annexin V-positive, PI positive). Behandling av HSC-4-celler ved IC
50 konsentrasjoner av CEB4 ble funnet å indusere apoptotisk celledød gjennom observasjon av en forskyvning i levedyktig cellepopulasjon fra tidlig til sent stadium av apoptose, etterfulgt av sekundær nekrose (Fig. 3B). Prosenten av levedyktige celler ble redusert fra 99% til 51%, mens tidlig og sent stadium apoptotiske celler øket til 21% og 45% henholdsvis. Den samlede andelen av apoptotiske HSC-4-celler var 63% etter 12 timer. Det ble ikke observert befolkningsendring i NHBE celler etter lignende CEB4 behandling (Fig. 3A).
Ubehandlede celler (øvre panel) og behandlet celler (nedre panel) etter CEB4 behandling på IC
50 konsentrasjoner for 12 h. Kvadrantene ble utformet som følger, jeg: ikke-farget celler indikerer levedyktige celler; II: annexin V-FITC beiset celler som indikerer tidlig apoptose; III: annexin V-FITC og PI fargede celler indikerer sent apoptose; og IV: PI fargede celler indikerer sekundær nekrose. Alle prikkplotter er en representasjon av like celle populasjoner (n = 10 000).
CEB4 Induserer Endonuclease- og caspase-mediert Spalting av DNA og PARP Henholdsvis
På grunn av den varierte måte og kjennetegnene på hvilken fremgangsmåten apoptose kan manifesteres, vi også undersøkt induksjon av apoptose i HSC-4-celler ved forekomst av DNA-fragmentering og spaltning av PARP-proteiner. Vi har observert at DNA ekstrahert fra ubehandlede HSC-4-celler viste ingen fragmentering, mens DNA fra CEB4-behandlede HSC-4-celler (12 og 24 timer) viste DNA rakner med omtrent 200 bp intervaller antagelig som et resultat av endonuklease aksjon på steder mellom nukleosomer (fig. 4A). Den mistenkte involvering av caspase-3-aktivering i CEB4-indusert apoptose ble også validert gjennom uttrykket og nedbrytning av en kjernefysisk protein, PARP. Proteolytisk spaltning av full lengde PARP fra et 116-kDa polypeptid til et 85-kDa-fragmentet er et typisk markør for angrep av apoptose, og ble observert i en tidsavhengig måte i HSC-4-celler behandlet med CEB4 (Fig. 4B). Derfor ble de apoptose-induserende virkninger av CEB4 for HSC-4-celler bekreftet.
imidlertid ikke distinkte fragmentations ble observert i felt 1 indikerer fravær av apoptose i motsetning til sporene 2 (12 h) og 3 ( 24 h). (B) PARP degradering ble observert ved forskjellige CEB4 inkubasjonsperioder. Like mengder av cellulære proteiner ble underkastet SDS-PAGE, og PARP degradering fra sin opprinnelige form (116 kDa) til den spaltede form (89 kDa) ble påvist ved Western blot-analyse.
Ekspresjon av p53- og andre p53-Related Proteins apoptotiske
Western blotting-analyse av CEB4 behandlet HSC-4-celler ble utført for å undersøke status for p53 og p53-relaterte apoptotiske proteiner. Resultatene viste at ved CEB4 behandling, ble fosforylert p53 forhøyet, mens nivået av p53-inhibitor, MDM2, falt i løpet av 12 timer (fig. 5A). Den totale p53 nivå var konsekvent i HSC-4-celler og forble uendret på CEB4 eksponering. Protein ekspresjonsnivåer av de pro-apoptotiske Bax protein øket etter 12 timer med CEB4 behandling. På den annen side, var nivået av anti-apoptotiske Bcl-2-protein funnet å avta samtidig med endringen i Bax (Fig. 5B). Vi undersøkte også nedstrøms kaspaser, og fant at mengden av initiator procaspase-9 og skarp caspase-3-zymogen reduseres samtidig ved CEB4 eksponering, noe som indikerer den aktiverte spalting av procaspase-9 og caspase-3-zymogen (fig. 5C).
Celler ble inkubert med CEB4 i 6 og 12 timer, høstet i lyseringsbuffer og utsatt for SDS-PAGE. Protein uttrykk nivåer ble undersøkt med Western blot analyse og kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare ansette β-actin som en normalisering kontroll. (A) Analyse av p53 og MDM2 inhibitor nivåer. (B) Analyse av anti-apoptotiske Bcl-2 og pro-apoptotiske Bax protein nivåer. (C) Analyse av initiator procaspase-9 og effektor kaspase-3 zymogen nivåer. Kvantifisering av normaliserte proteinnivåer mot β-actin vises på høyre panel.
Diskusjoner
Prosessen med apoptose har blitt ønsket rute for kreftceller til å dø, og normalt er preget ved morfologiske og biokjemiske forandringer som membran blebbing, cellekrymping, kromatin kondensering, aktivering av kaskader av proteaser slik som kaspaser og endonukleaser, spalting av PARP [12] og fragmentering av genomisk DNA [13]. Apoptotisk celledød er foretrukket fordi den ikke innebærer den plutselige frigjøring av proinflammatoriske mediatorer, som i fremgangsmåten for nekrose [14]. Induksjon av apoptose og inhibisjon av kreftcellevekst har blitt brukt som referanse i evaluering av fenoliske anti-kreft aktivitet, hvor de siste mange kjemoterapeutiske midler har blitt funnet å bevirke forstyrrelser i cellesyklusprogresjon eller induksjon av apoptose i tumorceller [15].
I denne studien bevis fra MTT-baserte celleviabilitet tester viste at erythrocarpine E (CEB4) induserer både tid og doseavhengig cytotoksiske effekter på alle humane tumorcellelinjer som ble testet, med effekt er størst i HSC-4-celler. Denne observasjonen inviterer videre undersøkelser av de apoptotiske virkninger av CEB4 og dens potensial som en anti-tumor medikament for behandling av oral cancer. På dette stadiet, epitelial-lignende opprinnelse NHBE som har likheter med HSC-4 bare tjener som et innledende
in vitro
kontroll for medikamentscreeningsformål, mens selve fysiologiske bivirkninger av CEB4 kan bare bli evaluert via
in vivo
studier. De minimale cytotoksiske effektene av CEB4 på NHBE celler (hvor Celleviabilitet nivåer holdt seg over 80% ved behandling) gi en foreløpig sikkerhets indikasjon for videre utvikling som et kjemoterapeutisk middel. Tre typer analyser ble også utført for å bekrefte den celledød mekanismen for CEB4 på HSC-4-celler: annexin V-FITC, PARP-spaltning og DNA-fragmentering analyser. De kombinerte resultatene av disse testene viser at cytotoksisiteten indusert av CEB4 resultater fra induksjonen av apoptose.
Det neste relevant spørsmål ville være å bestemme hvordan er CEB4-avhengig apoptose mediert på molekylært nivå? To viktige ruter programmert celledød kan skilles: den ytre og indre trasé. Handlingen av p53 er indirekte knyttet til den iboende celledød sti der det stimulerer et bredt nettverk av signaler som virker delvis gjennom Bcl-2 familien signalkaskade [16]. Tidligere rapporter har indikert at mutasjoner i p53 spiller en viktig rolle i kreft initiering og er svært fremtredende i sin kobling til kreft som tykktarm, lunge, spiserør, bryst, lever, hjerne, retikuloendoteliale vev og blodkreft vev [17].
Western blotting resultater viser en økning i nivået av fosforylert p53 og en reduksjon av dets inhibitor, MDM2 som tyder på at fremgangsmåten for induksjon av apoptose ved CEB4 er mediert gjennom indre vei. Dette er ytterligere forsterket av observasjoner på mitokondrielle proteiner, hvor en økning på pro-apoptotiske protein nivåer, Bax og reduksjon av anti-apoptotiske protein nivåer, BCL-2 ble sett. Forholdet mellom Bcl-2 og Bax regulerte induksjon av apoptose ved dimerisering med hverandre, og dermed utløser frigjøring av cytokrom c fra mitochondria [18] – [19]. I tillegg til CEB4, andre naturlige forbindelser som har vist effekt på induksjon av p53-mediert apoptose var curcumin, resveratrol, antocyaniner og capsaicin [20]. Tidligere studier på limonoid baserte forbindelser fra
Sitrus aurantifolia
har også vist seg å indusere apoptose gjennom p53 inaktivering [10], [20].
Virkningsmekanismen av cytotoksiske legemidler ikke utelukkende inkluderer funksjoner som celle krymping og DNA-fragmentering, men også aktivering av p53-signalmolekyler som fører til aktivering av en kaskade av caspase handling [21]. Caspase kaskader kan utløses gjennom to store grener, enten gjennom celleoverflate TNF-superfamilien døds reseptorer og den dreibare adapter proteinet Fas aktivert død domene (FADD) som fører til aktivering av kaspase-8 og til slutt caspase-3, eller via frigjøring av cytokrom c (Cytc) fra mitokondrier som resulterer i caspase-9 aktivitet og påfølgende caspase-3 handling. Caspase-3, representerer en konvergens punkt mellom de to rutene, og i sin tur induserer PARP cleavage, kromosomale DNA pauser og endelig sammenbrudd av cellen til apoptotiske legemer [22]. Våre resultater tyder på at CEB4 utøver sin apoptotiske virkninger ved å virke på caspaser-9 og -3, hvor nivået av full lengde procaspase-9 og caspase-3-zymogen blir redusert ved CEB4 eksponering, noe som resulterer i spaltede, aktiverte former av kaspase-9 ( 37 kDa og 10 kDa) caspase-3 (17 kDa og 12 kDa). Imidlertid apoptotisk signaltransduksjon som medfører døden reseptorsignalisering resulterer i aktivert initiator caspase-8, som i sin tur aktiverer zymogenet caspase-3, kan ikke utelukkes. Formidling av celledød via denne rute kan forklare den observasjon av en tidlig reduksjon ( 6 h) i procaspase-3 nivåer før forandringer i Bcl-2 og Bax som opptrer ved 12 timer (figur 5B og 5C.). Dette kan også bety at involvering av indre vei fungerer som en forsterkning skritt mot innledende død signaliserer via ytre vei på CEB4 eksponering.
Vi konkluderer med at CEB4 induserer cytotoksisitet gjennom apoptotisk celledød i HSC-4 kreft i munnhulen celler, og at induksjon av apoptose er forårsaket av aktivering av p53, som utløser den indre vei gjennom Bcl-2 og Bax, og til slutt gjennom caspase-9 og -3 aktivering. Våre data indikerer potensiale for utvikling av CEB4 som en ny potensiell anti-kreft legemiddel mot human kreft i munnhulen, selv om det videre arbeidet med
in vivo
sikkerhetseffekter og farmakokinetikk er nødvendig før CEB4 kan være fullt evaluert i en klinisk setting.
Takk
Vi ønsker å takke Datuk Prof. Dr. A. Hamid A. Hadi fra Senter for Natural Product Forskning and Drug Discovery, University of Malaya for hans bidrag til oppdagelsen av CEB4 sammensatte. Også Ms Norahayu Othman og Ms Yap Seow Hui fra Institute of Biological Sciences, University of Malaya for deres bidrag i løpet av cytotoksisitet screening og sti analyse av denne undersøkelsen.
