Abstract
mitokondrie Bit1 (BCL-2-hemmer transkripsjon 1) protein er en del av en apoptotisk sti som er unikt regulert av inte-mediert vedlegg. Som en anoikis effektor er Bit1 slippes ut i cytoplasma følgende tap av cellebinding og induserer en caspase uavhengig form av apoptose. Tatt i betraktning at anoikis motstand er en kritisk faktor for transformasjon, hypotese vi at kreftceller kan omgå Bit1 apoptotiske sti for å oppnå forankring-uavhengighet og karsinogent potensial. Her gir vi den første bevis på svulsten undertrykkende effekt av Bit1 gjennom en mekanisme som involverer anoikis induksjon i humane lunge adenokarsinom avledet A549 celler. Restitusjon av Bit1 i anoikis motstandsdyktig A549 celler er tilstrekkelig til å indusere løsrivelse indusert-apoptose tross defekt i caspaseaktivering og svekker deres forankringsuavhengig vekst. Motsatt, stabil nedregulering av Bit1 i disse cellene øker betydelig sine anoikis motstand og forankringsuavhengig vekst. De Bit1 knockdown cellene utviser betydelig forbedret tumorigenecity
in vivo
. Det er tidligere blitt vist at den kjernefysiske TLE1 corepressor er en antatt onkogenet i lungekreft, og viser vi her at TLE1 blokkerer Bit1 mediert anoikis delvis ved sekvestrering av de pro-apoptotiske partner av Bit1, den amino-terminale Enhancer av Split (AES) protein, i kjernen. Samlet utgjør disse funnene tyder på en svulst undertrykkende rolle caspase-uavhengig anoikis effektor Bit1 i lungekreft. I samsvar med sin rolle som en tumor suppressor, har vi funnet ut at Bit1 er nedregulert i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vev
Citation. Yao X, Jennings S, Irland SK, Pham T, Temple B, Davis M, et al. (2014) The Anoikis Effector Bit1 Viser Tumor undertrykkende funksjon i lungekreft celler. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10,1371 /journal.pone.0101564
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 20 mars 2014; Godkjent: 08.06.2014; Publisert: 08.07.2014
Copyright: © 2014 Yao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) Start Grant (HB), NIH RCMI G12RR026250-03 Grant (til Xavier University of Losuiana), og NIH 1R15CA158677-01A1 Grant (HB). Disse organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en kritisk faktor for en ondartet epitelial fenotype er anchorage uavhengighet. Tapet av forankrings avhengighet til den ekstracellulære matriks ved maligne celler som gjør dem i stand til å vokse i fravær av celleadhesjon, til å forplante seg i en tre-dimensjonal matrise, for å invadere tilstøtende vev og metastasere til fjerntliggende organer [1], [2]. De molekylære mekanismene og cellulære veier underliggende forankrings uavhengighet av kreftceller har blitt omfattende studert [3], og de fleste av disse molekylære endringer konferere ondartede celler evnen til å unngå den anoikis program som er til stede i normale celler. Tatt i betraktning at nedbryting av anoikis kontroll bidrar til vekst og malignitet av mange solide svulster, gjenopprette anoikis følsomhet representerer en viktig terapeutisk strategi i begrense tumor aggressivitet og metastasering. Derfor, identifisering av nye molekylære mål for den anoikis-mediert celledød reaksjonsvei har betydelige terapeutiske virkninger.
to apoptotiske reaksjonsveier, mitokondrie (intrinsic) og celledød reseptor (ytre), er blitt vist å regulere anoikis prosess. Etter løsgjøring-indusert tap av integrin-medierte overlevelse signalering, blir den indre apoptotiske reaksjonsvei utløst gjennom aktivering av de pro-apoptotiske medlemmer av BCL familien av proteiner (inkludert Bax, Bad, By og Bim). Disse proteinene utløse permeabiliseringen av den ytre mitokondriemembranen som fører til cytosoliske frigjøring av cytokrom c og nedstrøms aktiveringen av caspase enzymer [5], [6]. Dette mitokondrie-avhengige caspaseaktivering sløyfe, som kan bli ytterligere forsterket gjennom nedregulering av ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl familiemedlemmer (slik som Bcl-2 og Bcl-xL) som virker i vakt mitokondriell integritet [7], kan til slutt føre til DNA-fragmentering og celledød. Døden reseptor (ytre) bane avhenger av bindingen av døds ligander (Fas eller TRAIL) til døden reseptor og anvender dannelsen av en dødsinduserende aliserte kompleks (DISC) i aktivere den nedstrøms caspase-8. Dette død reseptor-mediert kaspase 8 aktivering kan bevirke destabilisering av mitokondriemembranen som fører til apoptose [8], [9]. Selv om konvergens og crosstalk mellom ytre og indre apoptotiske trasé finnes på ulike nivåer, både trasé stole på caspaseaktivering sløyfe for å gjennomføre celledød. Imidlertid har bevis som indikerer fremkom eksistensen av kaspase-uavhengige mekanismer i anoikis [10],. Nærmere bestemt, enten ved overekspresjon av Bcl-2 eller behandling med globale kaspaseinhibitorer er inhibering av kaspase-aktivering ute av stand til å blokkere basal anoikis i tumorceller som bestemt ved DNA-stige-analyse [10]. Alternativet caspase-uavhengig modusen for anoikis er en viktig terapeutisk mål i svulster som viser en funksjonshemmet caspase-avhengig apoptose veien.
Ruoslahti og kolleger har nylig identifisert en roman inteavhengig apoptotiske sti som formidles av mitokondrie Bit1 (BCL2, hemmer transkripsjon 1) protein [11]. Etter tap av integrin-mediert celleadhesjon, er Bit1 slippes inn i cytoplasma, danner et kompleks med den transkripsjonelle coregulator AES, og deretter induserer en caspase-uavhengig modus for apoptose. Mens flere kjente anti-apoptotiske faktorer slik som Bcl-2, Bcl-xl, Akt er ineffektive i å blokkere Bit1 apoptose, er integrin-medierte feste det eneste anti-apoptotiske behandling som kan undertrykke apoptose Bit1 funksjon [11]. Tatt i betraktning at integrin-mediert celle adhesjon, spesielt α5β1 inte, er det bare opp-stream behandling som kan blokkere Bit1 apoptose vei, kan Bit1 spille en viktig rolle i anoikis som en vokter av anker avhengighet [11] – [15]. På grunnlag av den manglende evnen av kaspaseinhibitorer å inhibere Bit1 apoptose og fravær av kaspase-aktivering i Bit1 transfekterte celler, kan Bit1 pathway representerer en av de kaspase-uavhengig anoikis mekanismer i ondartede celler [11]. Derfor vises Bit1 apoptotiske sti å være en attraktiv terapeutisk mål i omgå anoikis motstand særlig i tumorceller som viser mangelfull caspase aktivitet. Utnyttelse av Bit1 som et terapeutisk mål krever en detaljert undersøkelse av mekanismen av sin apoptose funksjon, som vi har funnet til dels være avhengig av å slå av en overlevelsesfremmende gentranskripsjon program kontrollert av Groucho transkripsjonen corepressor TLE1 [15].
rollen Bit1 i anoikis har blitt vist i flere transformerte cellelinjer. Gjennom genetisk manipulasjon tilnærminger, har vi vist at ekspresjon av eksogene mitokondrielle Bit1 blokkerer anoikis motstand av flere tumorcellelinjer, mens nedregulering av endogen Bit1 uttrykk forvirrer deres anoikis ufølsomhet [11] lenger – [15]. Siden oppkjøpet av anoikis motstand er en viktig faktor for neoplastisk transformasjon og metastatisk potensial [1], [2], undertrykkelse av Bit1 anoikis sti i ondartede celler kan bidra til kreft progresjon, spesielt i anskaffelse av avansert tumorigent og metastatisk atferd. Faktisk våre tidligere studier vist at Bit1 kan fungere som en suppressor av metastaser
in vivo product: [14]. Selv om den nøyaktige mekanisme som ligger til grunn dens metastase-inhiberende virkning gjenstår å bli definert, anoikis den Bit1 induserende funksjon kan spille en hastighetsbegrensende trinn i prosessen metastase. Interessant, har rollen Bit1 i tumorigenesis ikke blitt vist til nå.
For å ta rollen som Bit1 i kreftdannelse videre, har vi utført foreløpige online database søk for å undersøke om Bit1 uttrykk endres i ulike typer humane tumorer som sammenlignet med deres normale motstykker. Forbløffende nok har vi funnet ut at Bit1 uttrykk er selektivt og undertrykte betydelig i lungekreft. Denne foreløpige funn, i forbindelse med den siste bevis som dokumenterer at TLE1 kan fungere som en bestemt onkogen lunge [16], har bedt oss om å undersøke betydningen av Bit1 apoptotiske sti i anoikis ufølsomhet og karsinogent potensial for ikke-småcellet lungekarsinom ( NSCLC), som er den mest aggressive formen for lungekreft og er meget kjemoresistent delvis på grunn av en mangelfull caspase-avhengig apoptose veien [17], [18]. Her viser vi at eksogene Bit1 omgår anoikis motstand av human lunge adenokarsinom A549 cellene gjennom aktivering av kaspase-uavhengig apoptose og hemmer deres forankrings-uavhengig vekst. Konsekvent, knockdown av endogen Bit1 i disse cellene ytterligere forbedrer sine anoikis ufølsomhet og forankringsuavhengig potensial
in vitro Hotell og forsterker sin tumorigent vekst
in vivo
. I tråd med sin svulst undertrykkende funksjon, ble Bit1 uttrykk funnet å være nedregulert i NSCLC tumorer.
Materialer og metoder
Cell kultur og transfeksjon analyser
NSCLC A549 og H460 celle linjer erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med glutamin inneholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin. Den stabile A549 avledet kontroll og Bit1 shRNA pool av celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med glutamin inneholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin, streptomycin, og 1 ug /ml puromycin (Invitrogen). Forbigående transfeksjon analyser ble utført med lipofektamin 2000 (Invitrogen) for A549-celler og Lipofectamine LTX-reagens (Invitrogen) for H460-celler i OPTI-MEM (Invitrogen) i følge produsentens protokoll sammen med den totale mengden av plasmid anvendt pr transfeksjon normalisert med den tilsvar tom vektorkonstruksjon.
Kjemiske reagenser, antistoffer, og plasmider
Poly (2-hydroksyetylmetakrylat (poly-HEMA) og mus monoklonalt anti-FLAG, anti-AES, anti-GFP og anti -B-actin-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). det polyklonale anti-TLE1 antistoff ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). den kaspaseinhibitor zVad-FMK og det anti-myc antistoff ble kjøpt fra Calbiochem ( La Jolla, California). anti-caspase-3, anti-spaltet caspase-3, Bcl-2, BCL-XL, Bax, Bad, og anti-PARP antistoffer ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Den pattedyr-ekspresjonsvektor som koder for mitokondriell Bit1 ble samlet som tidligere beskrevet [11]. De GFP-TLE1 plasmider ble oppnådd fra Origene (Rockville, MD). Konstruksjonen som koder for celledød domenet (CDD) av Bit1 ble hentet fra Dr. Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) og ble tidligere karakterisert [19].
siRNA og shRNA transfeksjon
de TLE1 spesifikke sirnas og kontroll ikke-målretting sirnas ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). For forbigående transfeksjon eksperimenter, A549 celler (2 × 10
5) ble transfektert med 25 mikrometer av hver siRNA bruke Lipofectamine RNAiMAX transfeksjon reagens (Invitrogen). 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet og underkastet immunoblottingforsøk eller anoikis analyser som beskrevet nedenfor. For å generere stabil A549 Bit1 knockdown og kontroll bassenger, ble A549 foreldre celler transfektert med pRS vektor som inneholder kort hårnål RNA mot TLE1 (Origene) eller ikke-målsegge shRNA (Origene). 48 timer post-transfeksjon, 1 ug /ml puromycin (Invitrogen) ble tilsatt til mediet for å selektere for puromycin-resistente kloner. Individuelle puromycin-resistente kloner ble screenet for Bit1 nedregulering ved immunoblotting ved bruk av et spesifikt antistoff til Bit11 [15]. To Bit1 shRNA knockdown-positive kloner og to kontroll shRNA kloner ble slått sammen for videre karakterisering.
Analyse av apoptose, anoikis, og celleviabilitet
Apoptose ble bestemt ved å kvantifisere graden av cytosoliske nukleosomale fragmenter med bruk av celledød Detection ELISA kit (Roche Molecular Biochemicals) per produsentens instruksjoner [14], [15]. For å vurdere for anoikis celledød, ble cellene sådd ut på poly-HEMA belagte 96-brønners plater i fullstendig vekstmedium inneholdende 0,5% metylcellulose ved en tetthet på 1,0 x 10
4 /brønn ved forskjellige tidspunkter som tidligere beskrevet [14], [15 ]. Frigjorte celler ble deretter oppsamlet og underkastet den celledød ELISA-assay apoptose. Celleviabilitet ble kvantifisert ved alarmar blå flekker (Invitrogen) og påfølgende fluorescens lesing (485 nm eksitasjon bølgelengde og 520 nm emisjon bølgelengde) ved hjelp av mikroplateleser (BioTek Instruments).
celleproliferasjon og myke agar analyser
Anchorage-avhengig vekst ble bestemt ved utsåing av cellene i et volum på 150 ul i en tetthet på 2000 celler per brønn i 96-brønners plater. Ved hver angitte tid, ble antallet av metabolsk aktive celler målt ved anvendelse av MTT-assay som tidligere beskrevet [15]. I korthet, ble ti mikroliter av MTT-reagenset på 5 mg /ml (Sigma) tilsatt til hver brønn i en 96-brønns plate. Platen ble deretter inkubert ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 timer. Etterpå ble den resulterende MTT bunnfall ble oppløst i 100 pl av en 50% MeOH-50% DMSO-løsning og ble underkastet en 550 nm absorbans lesing ved hjelp av en mikroplateleser (BioTek Instruments). Den forankrings-uavhengig vekst av celler ble vurdert under ett, ved bruk av 96-brønners plateformat [15]. Som beskrevet tidligere, var 5000 celler i 0,3% agaroppløsning sådd ut på brønner på forhånd er dekket med 0,6% agar i kulturmedium. Veksten i de resulterende kolonier ble kvantifisert ved alarmar blå flekker (Invitrogen) og fluorescens lesing på 485 nm eksitasjon bølgelengde og 520 nm emisjon bølgelengde med en mikroplateleser.
caspaseaktivering analysen
caspase -3 aktivitet ble bestemt fluorometrisk med underlaget Ac-DEVD-AFC underlaget og ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Roche Applied Science).
Protein forberedelse og vestlige blotting analyser
Protein forberedelse og vestlig blotting ble utført som beskrevet tidligere [14], [15]. I korthet ble cellene høstet 24-48 timer etter transfeksjon med ulike konstruksjoner eller sirnas ved tilsetning av iskald NP-40 lyseringsbuffer (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 10% glyserol , 2 mM natrium-vanadat, 1 mM henylmethylsulfonyl fluor; 10 ug /ml leupeptine; og 5 ug /ml aprotinin) og inkubert ved 4 ° C i 20 min. For immunoblot analyse, ble like mengder proteiner løst på 4-20% stigning Tris-glysingeler (Invitrogen) og elektro overført til nitrocellulose membran. Membranene ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av sekundære antistoffer konjugert med pepperrot-peroksydase. Membraner ble utviklet ved hjelp av ECL deteksjonssystemet.
subcellulære fraksjone
subcellulære fraksjonering ble utført som beskrevet tidligere [15]. I korthet ble transfekterte celler dyrket i vedlagte eller frittliggende forhold ved de angitte tider ble innhøstet vasket en gang med PBS, resuspendert i 1 ml av isotonisk mitokondriell-buffer (250 mM mannitol, 70 mM sukrose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7,5]) og homogenisert med 40 slag i en Dounce homogenisator. Lysatene ble sentrifugert ved 500 x g i 5 minutter for å fjerne kjerner og ubrutte celler. Supernatanten ble videre sentrifugert ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for å isolere den mitokondrielle anrikede pellet. Den resulterende cytosolisk supernatant ble underkastet SDS-PAGE elektroforese og immunoblotting. For separasjon av cytosol og atomfraksjonen, NE-PER kjernefysiske isolasjon kit (Pierce, nr 78833) ble brukt og utført som foreskrevet av produsenten [15]. Proteinkonsentrasjonen i de forskjellige fraksjoner ble kvantifisert ved bruk av Bio-Rad proteinanalysesett med BSA som standard.
Coimmunoprecitation assay
Coimmunoprecipitation assay ble utført som beskrevet tidligere [15]. Kort sagt ble transfekterte celler høstet ved vasking en gang med PBS og resuspendert i iskald Nonidet P-40 lyseringsbuffer (1% Nonidet P-40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glyserol, 2 mm natrium-vanadat, 1 mm fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /ml leupeptin, og 5 ug /ml aprotinin) etterfulgt av en 20-minutters inkubering ved 4 ° C. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering. Myc-merket Bit1 ble immunopresipitert med anti-myc-agarose konjugat (Abcam) mens GFP-merket TLE1 ble immunopresipitert med anti-GFP-agarose (Medical and Biological Laboratories). Immunpresipitatet ble grundig vasket med lyseringsbuffer. Bundne proteiner ble løst ved SDS-PAGE og Western blotting ble utført ved hjelp av tilsvarende antistoff.
In vivo
tumorigenesis analysen
Alle prosedyrer ble utført i henhold til protokoller som er godkjent av Institutional komité for bruk og vedlikehold av forsøksdyr Xavier University of Louisiana Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, godkjenningsnummer 060911-001BI). Åtte uker gamle hunn atymiske nakne mus (BALB /c) ble brukt til tumorgenese analyser. De A549 utledet kontroll shRNA og Bit1 shRNA celler (1,0 × 10
6) ble injisert subkutant. Tumorstørrelsene ble målt periodevis med en kaliper, og tumorvolumet ble bestemt med formelen (d1 d2 x
2) /2 hvor d1 representerer den større diameter, og d2 mindre diameter. Mus ble ofret da de primære svulster nådd 2 cm i diameter.
In Situ apoptose Detection
Påvisning av apoptotiske celler i kontroll shRNA og Bit1 shRNA tumorsnitt ble utført ved hjelp av blindgaten Colorimetric TUNEL System ( Promega) etter produsentens anvisninger. I korthet snitt ble deparaffinized, rehydrert, og inkubert med proteinase K i 20 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, ble seksjonene inkubert med en arbeidskonsentrasjon på rekombinant terminal deoksynukleotidyltransferase (rTdT) ved 37 ° C i 1 time. Snittene ble det vasket med PBS og neddykket i 0,3% hydrogenperoksid for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. Snittene ble deretter vasket med PBS og inkubert med streptavidin-HRP-løsning. Den resulterende mørkebrune signal ble visualisert med Diaminobenzidin (DAB) som kromogen.
Menneskelunge svulstvev rekke analyse
Menneskelig svulstvev array-lysbilder som inneholder plateepitelkarsinom, adenokarsinom, større cellekreft, og matchede normale lunge-vev ble oppnådd fra US Biomaks, Inc. (Rockville, MD). Den immunhistokjemi prosedyren ble utført av Biomaks Inc. på to vev microarray lysbilder. Som tidligere beskrevet [14], [15], vev array-objektglass ble deparaffinised, hydrert og utsatt for antigen gjenfinning. Platene ble deretter inkubert i 2,5% normalt hesteserum i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoff (1:100 fortynning) i 1 time ved romtemperatur. Den affinitetsrenset kanin-anti-Bit1 antistoff (HPA012897) som tidligere ble testet for sin spesifisitet [14], [15] ble innkjøpt fra Sigma. Kanin normalt serum ble anvendt som negativ kontroll antistoff for å erstatte det primære antistoff på styreskyveren med 1 timers inkubasjon. Tissue matriseObjektGlassene ble deretter vasket og inkubert med ImmPRESS reagens (Vector Laboratories), etterfulgt av behandling med peroxidise substrat DAB-løsning (DAKO Cytomation). Glassene ble scoret for gjennomsnittlig fargeintensitet Bit1 av to etterforskere med ingen kunnskap om patologiske status av prøvene. Den gjennomsnittlige farging ble gradert som 0, ingen farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; og 3, sterk farging.
Statistisk analyse
Data er presentert som middel (± bred singlett.). For vestlige blotter og anoikis analyser, ble eksperimenter utført minst tre ganger med tre paralleller. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble etablert på en P-verdi 0,05 hjelp av tosidige Student t-test. For lunge svulstvev rekke analyse, ble en enveis ANOVA med påfølgende innlegget hoc testing med Tukey-Kramer multippel sammenligning test brukes til å sammenligne den gjennomsnittlige fargeintensitet for hver sakstype [14], [15]. Alle beregninger ble gjort ved hjelp av NCSS statistisk programvare (NCSS, Kasville, Utah)
Resultater
Den Anoikis Resistance of A549 celler er forbundet med mangel på Betydelig caspase aktivitet
NSCLC celler er notorisk kjent for å være resistente mot forskjellige former av apoptotiske stimuli inkludert død reseptorstimulering, cytotoksiske medikamenter, og stråling. Evnen til NSCLC å unngå apoptose har blitt tilskrevet delvis til en ineffektiv caspase-uavhengig maskiner [17], [18]. Men mekanismene for hvordan NSCLC blokker anoikis ikke blitt grundig undersøkt. For å møte den potensielle nytten av caspase-uavhengige mekanismer i omgå anoikis motstand av NSCLC celler, må vi først undersøkte bidraget av caspase veien i anoikis. I samsvar med tidligere rapporter [20], den NSCLC cellelinjen A549 viste meget lavt nivå av apoptose når de dyrkes i suspensjon (figur 1A). Staurosporin (STS), en potent kinase inhibitor, betydelig apoptose i disse celler (figur 1A). For å ta rollen som caspase avhengig veien i anoikis blokaden i A549 celler, undersøkte vi cytosolic utgivelsen av mitokondrie cytokrom c protein (en avgjørende faktor i å aktivere nedstrøms caspase effektorer) under avløsning. I motsetning til STS behandlede celler som viste betydelige mengder cytokrom c i cytoplasma, frittliggende celler oppviste bare spormengder av cytokrom c i den cytoplasmiske fraksjon (figur 1B). Deretter overvåkes vi aktivering av nedstrøms eller skarp kaspase 3 via spalting av det fluorescerende caspase-3-substrat (figur 1C), og prosessering av pro-kaspase 3 til og immunoblotting (Fig 1 D). I tråd med mangel på signifikant cytosoliske frigjøring av cytokrom c, frittliggende A549-celler viste ingen vesentlig kaspase 3 aktiveringen (figur 1C), og viste ingen prosessering av pro-kaspase 3 (figur 1D). Enden målet for caspase maskineri er å spalte den kjernefysiske poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) protein [5], [6]. Som vist på fig. 1E, forble PARP relativt intakt i sin opprinnelige 116 kDa formen i frittliggende A549 celler (figur 1E). Tatt sammen, disse funnene tyder på at anoikis motstanden av A549-celler er assosiert med en ineffektiv cytokrom c /caspase-avhengig celledød svei.
A. Celler ble dyrket som er festet (A) eller løsrevet fra ECM i 24 timer (D24) og 48 timer (D48) og ble høstet for apoptose-analyse ved bruk av celledød Elisa ELISA. Parallelt ble celler også behandlet med 1 pM staurosporin (STS) i 24 timer og utsatt for celledød Elisa ELISA. B. cytosoliske fraksjoner ble oppnådd fra celler i A og analysert for tilstedeværelse av cytokrom c ved western blot. C. Tilstedeværelsen av caspase-3-lignende aktivitet i cellelysatene fra celler behandlet i A ble bestemt ved spaltning av et fluorescerende substrat z-DEVD-AFC (DEVD). D. og E. Celler i A ble underkastet Western-blotting for å detektere prosessering av pro-kaspase 3 (D) og PARP (E). I A og C, ble tre uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller, * indikerer p. 0,05 i forhold til betingelsene knyttet (Student t test)
Bit1 svekker Anoikis Resistance of lungekarsinom celler
i betraktning av mangel på signifikant løsgjøring-indusert caspaseaktivering i A549-celler, så utforsket vi rolle Bit1 celledød bane i den forankrings-uavhengig overlevelse av disse cellene. Vi økte ekspresjonen av mitokondriell Bit1 i A549-celler via transfeksjon med en Bit1 konstruksjon som uttrykker Bit1 proteinet utelukkende i mitokondriene (Bit1 mito) [11], [15], og testet cellenes evne til å overleve i fravær av feste fra ECM. Den Bit1 mito og kontroll transfekterte celler hadde samme grad av spontan apoptose når vokst festet til en kulturskål (figur 2A). I slående kontrast til Bit1 mito transfekterte celler viste signifikant økt apoptose enn kontrollcellene ved avløsning. Lignende resultater ble funnet ved Bit1 mito ble innført i humane NSCLC-H460 cellelinje (figur S1). For å løse spesifisiteten av anoikis induksjon ved Bit1 mito, målrettet vi Bit1 ekspresjon i cytoplasma av A549-celler ved bruk av en Bit1 konstruksjon som inneholder en kode ved den N-terminale region av Bit1 protein (Bit1 cytomegalovirus) [11] [15]. Eksogent ekspresjon av cytoplasmiske lokaliserte Bit1 (Bit1 cytomegalovirus) i A549 (figur 2B) og H460 (fig S2) celler utløst apoptose. Den celledød domene (CDD) av Bit1 ble nylig kartlagt ved de N-terminale 62 aminosyrer og ble vist å være effektive i indusering av apoptose i brystkreftceller [19]. Innføringen av CDD peptidet også resultert i apoptose i A549 (figur 2C) og H460 (fig S3) celler. Ytterligere karakterisering av Bit1 anoikis reaksjonsveien i A549-celler bekreftet at Bit1 utløste celledød uavhengig av caspaser. Først fant vi ingen signifikant behandling av bøddelen caspase 3 i Bit1 transfekterte celler (figur 2D). For det andre nedstrøms atom substrat av caspases, PARP, forble intakt (figur 2D). Tredje, pan-caspase inhibitor z-Vad-FMK var ineffektive i å blokkere Bit1-indusert anoikis (figur 2E). I samsvar med den manglende Bit1 effekt på kaspase-aktivering, ble ekspresjonen av apoptose familien av regulatorer som styrer caspase-avhengige mitokondriell apoptotiske reaksjonsvei ikke endret ved Bit1 (figur 2D). Spesielt på steady state nivåer av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-xl proteiner samt den pro-apoptotiske Bax og dårlige proteiner uendret ved ektopisk Bit1 både festet og frittliggende forhold. Disse funnene tyder på at Bit1 kan omgå anoikis motstand av lungekreftceller gjennom induksjon av en caspase-uavhengig apoptotiske sti.
A. Cellene ble transfektert med C-terminalt myc-merket mitokondrie lokalisert Bit1 (Bit1 mito) eller den tomme vektorkonstruksjon. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene dyrket blir festet eller løsrevet fra ECM. Etter 48 timer i kultur ble cellene høstet og analysert for apoptose ved å måle mengden av DNA-fragmenter histon (celledød Elisa). B og C. Celler ble transfektert med den N-terminalt myc-merket cytoplasmisk lokaliserte Bit1 (Bit1 cytomegalovirus) (B), Bit1 celledød domene (CDD) (C), eller vektorkonstruksjon, og 48 timer senere ble cellene utsatt for celledød ELISA. D. Vektor eller Bit1 mito transfekterte celler ble dyrket som er festet (A) eller frittliggende (D) fra ECM i de angitte tidsrom. Cellene ble deretter høstet og utsatt for western blotting mot spesifikke antistoffer mot caspase-3, PARP, BCL-2, BCL-XL, Bax, Bad, myc, og B-aktin. E. Bit1 mito-transfekterte celler ble dyrket i vedlagte eller frittliggende betingelser i nærvær av z-Vad-FMK (50 pM) eller DMSO i 48 timer. Cellene ble deretter høstet og underkastet celledød ELISA. I A, B og C, ble tre uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller, * indikerer p. 0,05 av Student t test
For ytterligere å bekrefte rollen Bit1 som anoikis effektor i lungekreft, vi undersøkt om knockdown av endogen Bit1 uttrykk vil påvirke anoikis ufølsomhet av A549 celler. Vi tenkte at A549 celler vil gjennomgå anoikis ved langvarig kultur i suspensjon og hvis ablasjon av Bit1 apoptotiske sti kan gi anoikis beskyttelse. Faktisk, etter en langvarig 72 timers kultur i suspensjon, frittliggende A549 cellene til slutt viste tegn på apoptose (figur 3A). Den observerte anoikis induksjon var forbundet med noen signifikant behandling av kaspase 3 og PARP (figur 3B), noe som indikerer at alternativ celledød mekanisme (er) forskjellig fra den caspase-avhengige reaksjonsveien er involvert. Vi downregulated Bit1 uttrykk i A549 celler via kort forstyrrer RNA (siRNAs) og utsettes de Bit1 og kontroll siRNA behandlede celler til anoikis analysen. To Bit1 spesifikke sirnas # 1 og # 2 viste en betydelig 70-80% nedregulering av ekspresjon Bit1 (figur 3C). Sammenlignet med de A549 foreldre eller kontroll siRNA behandlede celler, idet Bit1 siRNA transfekterte celler utviste redusert apoptose etter en 72 timers kultur i suspensjon (figur 3D). For å komplettere disse resultatene, vi også generert to stabile Bit1 knockdown A549 avledet kloner, nemlig Bit1 shRNA1 og Bit1 shRNA2, med hver klon uttrykker et distinkt Bit1 shRNA som er rettet mot en annen sekvens i 3 «ikke-kodende regionen Bit1 mRNA. Parallelt ble stabil kontroll shRNA kloner 1 og 2 genereres fra nontargeting egge shRNAs. Som vist i figur 3E, er stabil Bit1 shRNA1 og shRNA2 viste en reduksjon i Bit1 ekspresjon ved 70% og 80% henholdsvis sammenlignet med kontroll shRNA kloner. Den stabile Bit1 shRNA1 og shRNA2 ble deretter kombinert for å generere Bit1 shRNA bassenget mens kontroll shRNA kloner 1 og 2 består kontrollen shRNA bassenget (figur 3E). I samsvar med dataene fra siRNA studier, vises Bit1 shRNA bassenget et betydelig redusert nivå av apoptose enn kontroll shRNA bassenget etter en 72 timers kultur i suspensjon (figur 3F). I samsvar med den manglende effekt av ektopisk Bit1 på mitokondrie pathway (figur 2D), ble det observert økt anoikis motstand i Bit1 knockdown cellene ikke forbundet med endringer i uttrykket nivåer av BCL-2 familie av apoptose regulatorer (figur S4). Disse funnene, i forbindelse med våre resultater indikerer at eksogen mitokondrie Bit1 kan indusere anoikis, gir sterke bevis for at Bit1 apoptotiske vei representerer en viktig caspase-uavhengig anoikis mekanisme i lungekreftceller.
Å. og B. Celler ble dyrket i festet (A) eller frittliggende (D) forhold i de angitte tidsrom, og deretter underkastet kastet celledød ELISA (A) eller vestlig blotting (B) med antistoffer mot kaspase-3, PARP, og B aktin. I A, ble tre uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller; *, P 0,05 i forhold til vedlagte celler (Student t test). C. og D. Cellene ble transfektert med kontroll- eller Bit1 bestemte sirnas, og 48 timer senere ble cellene utsatt for immunblotting (C) med antistoffer mot Bit1 og B-aktin for å bekrefte knockdown av Bit1 uttrykk.
