Abstract
Bare et lite antall lovende medikamenter målrette kreft i bukspyttkjertelen, som er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall med en 5-års overlevelse på mindre enn 5%. Vårt mål er å utvikle en ny biotherapeutic middel der en lysosomal protein (saposin C, SapC) og et fosfolipid (dioleoylfosfatidylserin, DOPS) er satt sammen til nanovesicles (SapC-DOPS) for behandling av kreft i bukspyttkjertelen. Et særtrekk ved SapC-DOPS nanovesicles er deres høye affinitet for fosfatidylserin (PS) rike mikroområder som er unormalt eksponert på membranoverflaten av humane pankreatiske tumorceller. For å vurdere rollen til ytre celle PS,
in vitro
analyser ble brukt til å korrelere PS eksponering og cytotoksiske effekten av SapC-DOPS i menneskelig svulst og nontumorigenic bukspyttkjertelen celler. Deretter ble bukspyttkjertel tumorxenotransplantater (ortotopiske og subkutane modeller) brukes for svulst målretting og terapeutiske effektstudier med systemisk SapC-DOPS behandling. Vi observerte at nanovesicles selektivt drept menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
av indusere apoptotisk død, mens ikke-transformerte celler forble upåvirket. Dette
in vitro
cytotoksisk effekt korrelert til overflaten eksponeringsnivå av PS på kreftceller. Ved hjelp av xenografter, dyr behandlet med SapC-DOPS viste klare overlevelse fordeler og sine svulster krympet eller forsvunnet. Videre bruker en dobbel-sporing metode i levende mus, viste vi at nanovesicles ble spesielt rettet mot orthotopically-implantert, bioluminescent pankreastumorer. Disse data tyder på at den sure fosfolipid PS er en biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen som kan være effektivt målrettet for terapi utnytte kreft-selektive SapC-DOPS nanovesicles. Denne studien gir overbevisende bevis til støtte for å utvikle en ny terapeutisk tilnærming til kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Chu Z, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad SA, Franco RS, Qi X (2013) målretting og Cytotoksisitet av SapC-DOPS Nanovesicles i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10,1371 /journal.pone.0075507
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: May 1, 2013, Akseptert: 14. august 2013, Publisert: 04.10.2013
Copyright: © 2013 Chu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH /NCI Grants Antall 1R01CA158372-01 (Qi), 1R43CA117283-01 (til Qi og Xu), og New Drug State Key Prosjekt Grant Antall 009ZX09102-205 (til Qi). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært følgende steder: Xiaoyang Qi i oppført som oppfinner på patent for teknologien (SapC-DOPS) som er gjenstand for denne forskningen. I samsvar med gjeldende Cincinnati Children Hospital Medical Center politikk, utvikling og kommersialisering av denne teknologien har blitt lisensiert til Bexion Pharmaceuticals, LLC, der Dr. Qi har en liten (mindre enn 5%) eierandel. Dr. Qi er en oppfinner av vitenskapelig forskning som er i preklinisk stadium for Bexion Pharmaceuticals. På denne tiden, ikke Bexion Farmasi tilbyr ingen salgbare behandlinger eller narkotika. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdødsfall, med en 5-års overlevelse på mindre enn 5% [1], [2], [3]. Det er vanligvis asymptomatisk i de tidlige stadier, mens hyppig invaderende regionale lymfeknuter og lever, og sjeldnere lungene og viscerale organer. Nåværende multimodale strategier, inkludert kirurgi, cellegift og strålebehandling, har ikke klart å forbedre langsiktig overlevelse. Den gjeldende standarden for behandling, nukleosid analog gemcitabin [4], forlenger overlevelse etter bare noen måneder. Til tross for grundige arbeidet med å kartlegge de genetiske forandringer assosiert med kreft i bukspyttkjertelen vekst, har noen lovende narkotika mål er rapportert, og nye, effektive behandlinger er sterkt behov. Eksperimentelle terapeutiske strategier inkluderer små og store molekyl hemmere av onkogene trasé, anti-angiogene midler, vaksinering /immunterapi, genterapi, og mange andre, men ingen klart overlegne terapi har dukket opp.
I de siste to tiårene, mobilnettet membraner har blitt mål for anti-kreft narkotika. Flere linjer av bevis har antydet en kobling mellom cellulære membran abnormaliteter og ceramid-mediert induksjon av apoptose i tumorer [5], [6], [7], [8], [9]. Basert på disse observasjoner har midler som interfererer med cellemembraner blitt utviklet for å modulere membran organisasjon, flyt, metabolisme, og signaltransduksjon [10], [11], [12]. Lite er kjent, men de underliggende signalveier påvirket av membran målrettet antineoplastiske midler.
Vi har jobbet med å utvikle en ny biotherapeutic stoff som selektivt kan målrette cellemembranen av bukspyttkjertelsvulster og effektivt ødelegge ondartede bukspyttkjertelen celler uten å skade normale vev og celler. Dette midlet er sammensatt av to rensede naturlige cellulære komponenter – en liten naturlig protein (saposin C, SapC) og et naturlig lipid (dioleoylfosfatidylserin, DOPS) – som vi montere inn i kreft-selektive nanovesicles (SapC-DOPS). SapC er en liten ikke-enzymatisk glykoprotein finnes i alle normale vev som fungerer som en biologisk aktivator av lysosomale enzymer [13]. Den funksjonelle organiseringen av SapC omfatter en membran fusogene domene og et område for aktivering av lysosomale enzymer [14], [15].
N
-koblet glykosylering er ikke avgjørende for SapC aktivitet [16], [17]. SapC fremmer nedbrytning av glukosylceramid, sphingomyelin, og galaktosylceramid til ceramid via syre β-glukosidase, syre sfingomyelinase, og syre β-galacotsylceramidase, henholdsvis [13], [18], [19]. Hos pasienter med lysosomale lagringssykdommer, akkumulerer SapC sammen med glykosfingolipider i makrofager [20], og det ser ut til at overdreven SapC og lipider kan være giftig for disse cellene.
En generell egenskap saposins er deres lipid membran bindingsaktivitet [ ,,,0],21] fordi de spiller en viktig rolle i lipidtransport [22], lipid microdomain montering [23], og omorganisering av biologiske membraner [24], [25], [26]. SapC fortrinnsvis reagerer med umettede, negativt ladede fosfolipider (for eksempel DOPS), ved sur pH-verdi [15], [21]. Dette er nødvendig for at SapC aktivering av lysosomale enzymer.
Vi antok at fordi fosfatidylserin (PS) er forholdsvis rik på overflaten av kreftceller og vev [27], [28], det ville gi en tumor- spesifikke mål for SapC. Sammenlignet med ikke-transformerte celler, neoplastiske celler er hypermetabolsk og således produsere betydelige mengder av syre og karbondioksid (CO
2) som biprodukter av anaerob glykolyse og aerob respirasjon, respektivt. Hydrogenioner akkumuleres i tumorvev, og som et resultat, er den midlere ekstracellulære pH-verdi i faste tumorer nedre (pH ~ 6) enn i normalt vev (pH ~ 7) [29], [30]. Kreftceller viser også andre spesielle egenskaper, så som generaliserte membran endringer [31], [32], [33] og «lekkasjen» av lysosomale enzymer [31]. Fascinerende nok er det flere lysosomale hydro forhøyet i tumorvev [34], [35]. Derfor er en unik surt mikromiljø med ekstracellulære lekkasje av lysosomale enzymer gjør svulstvev et optimalt mål for SapC [9].
I en tidligere studie fant vi at SapC-DOPS indusert apoptose i flere kreftcelletyper, inkludert neuroblastom, ondartet perifer nerve kappe tumor, og brystkreftceller, skåner normale celler og vev [36]. Mekanismen for SapC-DOPS induksjon av apoptose ble bestemt til å være delvis, ved heving av intracellulære ceramider, etterfulgt av kaspase-aktivering. Vi har også undersøkt antitumor effekt og systemisk biodistribusjon av SapC-DOPS nanovesicles i prekliniske kreftmodeller [9], [36], [37]. Vi fant at SapC-DOPS nanovesicles betydelig målrettet og hemmet veksten av prekliniske xenotransplantater av nevroblastom, ondartet perifer nerve kappe tumor, og hudkreft og viste ingen toksiske virkninger i nontumor vev [9], [36], [37].
i denne studien har vi evaluert anti-kreft nytte av SapC-DOPS, og dens
in vitro Hotell og
in vivo
kreft-målretting og anti-neoplastisk aktivitet mot menneske kreft i bukspyttkjertelen celler og bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC
menneske~~POS=TRUNC bukspyttkjertelen cellelinjer (MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3, Capan- 1, ASPC-1, HPAF-II, Hs766T) fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) ble dyrket med Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter penicillin /ml, og 10 mg streptomycin /ml. Menneskelig bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE) ble vennlig levert av A. Lowy (Moores UCSD Cancer Center, La Jolla, CA), og dyrket som beskrevet i litteraturen [38]. Menneskelig bukspyttkjertelen cfPac1-Luc3 cellelinjen ble vennlig levert av O. Wildner (Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Tyskland) [39]. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2. Ingen kryss-kontaminering ble funnet i disse cellene.
Fremstilling av proteiner og Nanovesicles
SapC ble fremstilt som tidligere beskrevet [17] med modifikasjoner. Kort fortalt ble rekombinante saposins uttrykkes ved hjelp av kjæledyr system i
E. Coli
celler. Uttrykte proteiner ble renset på en kolonne nikkel og fullstendig avsaltet med C4 revers-fase høy-ytelse væskekromatografi (HPLC). Etter lyofilisering, ble saposin pulver som anvendes og dets konsentrasjon ble bestemt ved sin vekt. Alle fosfolipider ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Bad ultralydbehandling ble anvendt for å danne SapC-DOPS nanovesicles som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [40]. Etter fjerning av oppløsningsmidlet under nitrogengass, ble fosfolipider blandet med rene saposin proteiner i 20 pl syrebuffer (pH 5) og raskt fortynnet i 50X volum av fysiologisk vandig oppløsning. Protein-lipid-blandingen ble deretter forsiktig ultralydbehandlet, og de to komponentene lett kan monteres inn i nanovesicles. De sonikerte nanovesicles kan brukes etter lagring ved 4 ° C i minst en uke. For langtidslagring, ble stabile frysetørkede SapC-DOPS prøver tilberedt med en vann-organisk kooppløsningsmiddel system. Etter fjerning av løsningsmidlet, ble tørket DOPS ble oppløst i 80% tert-butylalkohol. SapC og sukrose (10 mg /ml) oppløsning ble tatt opp i vann. DOPS og SapC /sukrose (vol: vol = 1:0.6) blanding ble frysetørket til et pulver kake i en frysetørker (Virtis Unitop, The VIRTIS Co., Gardiner, NY). For dyr injeksjon, ble kaken rehydratisert i fosfatbufret saltvann (PBS) for å danne SapC-DOPS nanovesicles. De nanovesicles viste samme tumor-målretting og cytotoksisitet
in vitro Hotell og
in vivo
.
SapC-DOPS nanovesicles ble karakterisert og overvåket av en N4 pluss partikkelstørrelse analysator som tidligere beskrevet [9], [36]. Stabile SapC-DOPS nanovesicles ha en gjennomsnittlig diameter på omtrent 200 nm med en midlere zeta-potensial på -42. SapC binder lipidmolekylene og spontant inkorporerer i det ytre lipid bilaget av liposomene ved ultralydbehandling. Etter ultralydbehandling og ultrasentrifugering for å pelletere SapC-DOPS koplet liposomer, ble det ikke påvist SapC i supernatantfraksjonen, impliserer en meget høy lasting /koblingseffektivitet [9]. Tørr SapC ble oppløst i PBS løsning for SapC behandling uten DOPS. DOPS uten SapC ble utarbeidet etter samme forberedelse prosedyre for SapC-DOPS nanovesicles.
Live Imaging
Fluorescent merking av SapC-DOPS nanovesicles.
I noen deler av eksperimentet de SapC-DOPS nanovesicles ble fluorescensmerkede med en stabil og høy intensitet fargestoff, CellVue® Maroon (CVM, Molecular Targeting Technology Inc., Exton, PA – Eksitasjon maks = 647 nm; Emission maks = 677 nm [9], [36 ]). CVM har vist nytte i bildebehandling subkutane svulster, samt skjult, orthotopically implantert, og metastatiske svulster. Skjebnen til fargestoffet kan følges i live mus bruker en hel-dyr bildeenhet [IVIS-200X (cy5.5 filter), Xenogen]. For alle bilde ble musene svakt bedøvet med isofluran og plassert på en varm plattform i bildebehandlingsenheten.
En porsjon av CVM i etanol ble blandet med fosfolipider oppløsningsmiddel for badekar sonication fremstilling ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor. CVM merket SapC-DOPS nanovesicles ble skilt fra gratis CVM fluorophore bruker en Sephadex ™ G25 kolonne (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Bioluminesens av bukspyttkjertelen kreftceller.
For å spore tumorceller, ble luciferase uttrykker cfPac1-Luc3 menneskelige bukspyttkjertelen kreftceller brukes. Etter injeksjon av luciferin, ble den samme levende bildeenhet (IVIS-200X, Xenogen) som brukes for visualisering og lokalisering av bioluminescence.
In vitro
Studier
Effekt av SapC-DOPS nanovesicles på tumorceller.
Tre mye brukt pankreatisk adenokarsinom-cellelinjer (MiaPaCa-2, PANC-1, og BxPC-3) og ikke-transformerte celler (HPDE) ble sådd ut (10
4 /100 ul /brønn) i 96-brønners flatbunnede vevskulturplater (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) og dyrket i deres respektive vekstmedium i 24 timer, hvoretter SapC-DOPS (0,14 mg) eller PBS kjøretøy ble tilsatt til kulturmediet. For å vurdere celleviabilitet, en standard 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) -dye analyse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble utført som beskrevet tidligere [9], [36] tre dager etter oppstart av behandling. Mikroskopisk vurdering av tumorceller og HPDE-celler ble utført.
For å evaluere for apoptose, MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler ble behandlet med SapC-DOPS, PBS, eller DNAase (positiv kontroll), og deretter vurdert med terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse ved hjelp in Situ celledød Detection Kit, POD (Roche Applied Science, Tyskland) som beskrevet i produsentens protokoll.
for å bekrefte at det var monterte SapC-DOPS nanovesicles som forårsaket celledød, MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler og HPDE ble behandlet med enten SapC-DOPS, SapC alene, eller DOPS alene. Celleviabilitet ble vurdert med en MTT-dye-analysen.
For å finne ut om SapC-DOPS-indusert apoptose ble formidlet av caspaseaktivering, proteiner fra nanovesicles-behandlede MiaPaCa-2-celler ble analysert ved western blot. Cellene ble behandlet i 48 timer med SapC-DOPS, DOPS, PBS, eller staurosporin (positiv kontroll), og deretter lysert for protein ved immunblotanalyse ved hjelp av NuPAGE Novex Bis-Tris Gel (4-12%), og elektroforesen måten i henhold til produsentens (Invitrogen, Carlsbad, California). Protein ble overført ved hjelp av en Semi-Dry blotting enhet (FB-SDB-2020, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) til Hybond-ECL nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Anti-human kaspase-9 og anti-actin antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ble benyttet for påvisning av aktive caspaser og aktin (kontroll), henholdsvis.
Disse eksperimentene ble utført i fire eksemplarer og data var i analysert ved hjelp av variansanalyse (ANOVA). T-testanalyse eller Toveis ANOVA Tukey-testen ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans for eksperimenter med to eller mer enn to grupper, henholdsvis. Analysene ble utført med SPSS 12.0.
Sammenheng mellom drepende effekt av SapC-DOPS og PS eksponering på bukspyttkjertelen celleoverflaten.
En flowcytometrisk analyse med FITC-merket Annexin V ble utført på 8 cellelinjer (Hs766T, ASPC-1, cfPac1-Luc3, CAPAN-1, BxPC-3, MiaPaCa-2, HPAF-II, og PANC-1) for å bestemme graden av PS eksponering på celleoverflaten. Cellelinjene ble deretter separert i to grupper: «High-PS» gruppe inneholdt de som hadde en midlere fluorescens (MF) over 50 (vilkårlige enheter) og «Low-PS» gruppe inneholdt de med en MF mindre enn 50. cellene ble behandlet med SapC-DOPS nanovesicles og prosentandelen av celledød ble bestemt ved MTT-analyse. MTT-eksperimenter ble utført i fire paralleller, og data ble analysert ved hjelp av ANOVA. Dataene som presenteres er aritmetisk gjennomsnitt ± SEM.
In vivo
Studier
Etikk erklæring om bruk av dyr.
Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Cincinnati (IACUC protokollen Antall: 11-05-05-02) og Cincinnati Children Hospital Medical Center (IACUC protokollen Antall: 1E03031). Dyrene ble bedøvet med isofluran eller pentobarbital for tilbakeholdenhet før injeksjoner av tumorceller for å redusere smerte og ubehag. Anestesidybden ble overvåket ved å kontrollere smerte respons (tå eller hale klype), muskel og kjeve slapphet, og tilstedeværelse av vanlige respirasjon. Dyrene ble avlivet når tumorer nådde 20% av kroppsmassen (dvs. størrelsen på hodet), sårdannelse eller necrotized. Tumorbærende dyr ble avlivet med karbondioksid når normale fysiologiske funksjoner som spising og drikking, urinering og avføring ble svekket. De tidlige fjerning kriteriene på grunn av komplikasjoner av kirurgi inkludert utslipp fra stedet av kirurgi, tap av appetitt, vekttap, og unnlatelse av å stelle. Tidlig fjerning kriterier som følge av tumorvekst inkludert hemiplegi, ingen respons på stimuli som støy eller touch for en periode som overstiger 12 timer etter smertestillende administrasjon, vekttap større enn 20% med ukentlig veiing, dehydrering, til svikt stelle, eller apati i mer enn 24 timer. Disse kriteriene ble behandlet av samråd med behandlende veterinær.
In vivo
modeller ble brukt til å undersøke spesifisiteten, anti-tumor aktivitet og allergi forbedret cytotoksisitet av SapC-DOPS nanovesicles i målretting bukspyttkjertelen tumorceller. For alle
in vivo
studier, kvinnelig naken /naken atymiske mus (Taconic Farms, Germantown, NY, totalt 98) veier ca 20-25 gram ble brukt. Tumorceller ble enten injisert subkutant eller orthotopically (figur S1, Materials S1). Alle IV-injeksjoner ble foretatt i halevenen. For å bekrefte tilstedeværelsen av humane pankreatiske tumorer, hematoxylin og eosin (H E) farging av xenopodet tumorer ble utført; eksempler er vist i Figur S2.
Dose vurdering for inhibering av bukspyttkjerteltumorvekst med SapC-DOPS.
Mus (totalt 24) ble inokulert subkutant i høyre flanke med en suspensjon av PANC- 1 tumorceller (10
7cells /mus). Tjuefire dager etter vaksinasjonen, ble tumorstørrelse målt ved hjelp av vernier calipers og formelen V = (π /6) LW
2 (V = volum, L = lengde, W = bredde) [36]. Den følgende dag (dag 1), grupper av tumorbærende mus (n = 6 /gruppe) ble hver injisert intravenøst med SapC-DOPS (1, 4 eller 8 mg /kg ved en 0,2 ml dose volum) eller bærerkontroll ( 0,2 ml PBS). Tumorstørrelse målinger ble utført daglig, og injeksjoner ble fortsatt annenhver dag frem til de største svulstene nådde 2000 mm
3 størrelser (18 dager). Musene ble deretter avlivet og en faktisk tumorvekt ble målt. Statistiske analyser i denne delen av studien ble utført med GraphPad Prism® v4 programvare. Forskjeller i slutt tumor vekter ble bekreftet ved hjelp av ANOVA med Dunnetts Multiple Comparison Post Test.
Evaluering av evne til SapC-DOPS å målrette overflaten PS på bukspyttkjertelen kreftceller.
For å avgjøre om SapC- DOPS nanovesicles spesifikt mot bukspyttkjerteltumorceller
in vivo
, MiaPaCa-2 celler (5 × 10
6 celler) ble injisert subkutant i flankene av musene. Etter 5 uker, når svulstene var håndgripelig, en av følgende var IV injisert i hver mus: fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles (6 mg /kg), ikke-kompleks SapC og fluorescensmerkede DOPS, fluorescensmerkede DOPS alene, eller PBS kontroll (5 mus /gruppe, totalt 20). Vurdering av
in vivo
fordeling av fluorescens ble utført med live-animalsk bildeenhet. Bilder ble tatt på flere tidsintervaller fra 5 minutter til 100 timer etter injeksjon.
For å bestemme blokkerende effekt av PS bindende, ble luciferase uttrykker cfPac1-Luc3 bukspyttkjerteltumorceller brukes. Cellene ble forbehandlet med PS-bindende proteiner lactadherin-C2 [41] og β2-glykoprotein [42] (0,1 mg /ml), eller til venstre i medium uten behandling som en kontroll i en time og så injisert subkutant på toppen av leder av naken mus (totalt 8). Bioluminesens avbildning ble utført for å visualisere svulstcellene. På en time etter implantering, fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles var IV injisert, og fluorescens signalet ble dokumentert ved hjelp av levende imaging system.
For å undersøke SapC-DOPS klarering fra normal mus vev, fluorescensmerkede SapC-DOPS ble IV injisert i 5 mus. Musene ble deretter avlivet, og lever, milt, lunge, hjerte og nyre ble fjernet og avbildes ved 1, 12 og 24 timer etter injeksjonen for å evaluere for tilstedeværelse av fluorescensmerkede SapC-DOPS.
Effekt av SapC-DOPS nanovesicles på bukspyttkjerteltumorvekst.
MiaPaCa-2 bukspyttkjerteltumorceller (5 × 10
6 celler), som vi dokumentert i
in vitro
studiene var utsatt for SapC -DOPS behandling (mer enn 80% celledød), ble injisert subkutant i den øvre del av ryggen av mus. Tumorstørrelse ble målt av målepunkter hver 3. dag, og volumet ble kalkulert. Når det midlere tumorvolum økte til ca. 500 mm
3, musene ble injisert IV med enten SapC-DOPS (6 mg /kg) eller PBS alene (5 mus /gruppe, total 10). Injeksjonene ble gjentatt på dag 3, 6, 12, 15, 18, 21, og 24, og tumormålinger ble fortsatt inntil dag 30. T-testanalyse eller Toveis ANOVA Tukey-testen ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans for eksperimenter med to eller større enn to grupper, henholdsvis. Analysene ble utført med SPSS 12.0.
Sporing av svulst bioluminesens og SapC-DOPS fluorescens i mus med ortotopiske pankreastumorer.
For å demonstrere hvordan SapC-DOPS selektivt rettet ortotopiske pankreastumorer, human cfPac1- Luc3-celler ble injisert inn i bukspyttkjertelen av naken mus. Etter en orthotopic bukspyttkjertelen svulsten ble oppdaget ved hjelp av levende avbildning på dag 6, fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles, fluorescensmerket SapC, fluorescensmerkede DOPS, eller PBS (kontroll) var IV injisert (6 mus /gruppe, totalt 24).
Survival of SapC-DOPS-behandlede mus med orthotopically implantert pankreastumorer.
grupper av mus (n = 6 hver, totalt 12) med orthotopically injiserte bukspyttkjertelen tumorceller (luciferase-uttrykke cfPac1-Luc3 linje) bekreftet av Bioluminescens på levende avbildning ble IV injisert med gjentatte doser (dag 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) av SapC-DOPS (6 mg /kg i 30 ul PBS) eller kjøretøy kontroll (PBS 30 mL). De fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles ble deretter påvist ved bruk av levende imaging system. De overlevende dyr ble overvåket før alle musene i kontrollgruppen utløpt. Overlevelseskurver ble opprettet ved hjelp av Kaplan og Meier metoden med GraphPad Prism programvare. Bioluminescent svulster ble overvåket med live bildeenheten i 23 uker.
Langsiktig sporing av svulst bioluminesens og SapC-DOPS fluorescens i mus med ortotopiske pankreastumorer.
Luciferase-uttrykke cfPac1- Luc3 pankreatiske tumorceller ble orthotopically injisert i mus bukspyttkjertelen. Etter 110 dager, ble fordelingen av bioluminescent svulster overvåkes ved hjelp av live-animalsk bildeenhet. Etter bioluminescence utsvevende, ble fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles injisert (6 mg /kg) og musene ble fotografert på nytt.
Målretting av skjult orthotopically-implantert og metastatiske svulster ved fluoresceinmerkede SapC-DOPS nanovesicles.
ortotopiske pankreastumorer ble generert ved å implantere en luciferase-uttrykke bukspyttkjertelen svulst linje (cfPac1-Luc-3) i mus. Etter 6 uker ble musene avbildes for å identifisere alle tumorsteder. Når bioluminescence hadde utsvevende, fluorescensmerkede SapC-DOPS var IV injisert.
Resultater
In vitro
Studier
Effekt av SapC-DOPS nanovesicles på tumorceller.
i tidligere studier, fant vi at den optimale molare forholdet mellom SapC og DOPS var 01:03 til 01:10 for maksimal cytotoksisk effekt mot humant neuroblastom og hud kreftceller [36], [37 ]. Vi fastslått at dette molar rekke SapC: DOPS forholdet hadde også signifikant drap effekt på menneskers bukspyttkjertelen (MiaPaCa-2) kreftceller (figur 1A). Når de tre pankreas adenokarsinom-cellelinjer og HPDE-celler ble behandlet med SapC-DOPS de fleste tumorceller døde, mens de HPDE cellene forble levedyktige (figur 1B). Mikroskopisk undersøkelse av SapC-DOPS-behandlede celler viste at tumorcellene hadde morfologiske egenskaper i overensstemmelse med apoptotisk død, mens den utransformerte HPDE cellene først på normal (figur 2). TUNEL-analyse viste at SapC-DOPS faktisk hadde indusere apoptose (figur 1C). I motsetning SapC-DOPS og den positive kontrollen DNAase, hadde den negative PBS kontroll ingen apoptotisk effekt. Begge komponentene SapC-DOPS var avgjørende for optimal tumorcelledreping. Hvis bare proteinet (SapC) eller fosfolipid (DOPS) komponenter ble individuelt tilsatt til cellene, var det ingen induksjon av apoptose, og andelen av apoptotiske celler var sammenlignbar med PBS-kontroll (figurene 1B og 1D). Western blot analyse viste at spaltingen av proenzymet pre-caspase-9 til den aktive formen skjedde bare i de SapC-DOPS-behandlede celler og staurosporin-behandlede celler (figur 1E).
(A) rolle SapC og DOPS molarforhold for cytotoksisitet på menneskelig bukspyttkjertelen (MiaPaCa-2) kreftceller. (B) Celledød (%) i humane kreft i bukspyttkjertelen celler (MiaPaCa-2, Panc-1, og BxPC-3) og normale kontroller (HPDE) etter eksponering for SapC-DOPS. (Data i 1B-1D er rapportert som aritmetisk gjennomsnitt ± SEM). (C) Apoptose (%) i MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler etter behandling med enten SapC-DOPS, PBS (negativ kontroll), eller DNAase (positiv kontroll). (D) Celledød (%) i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler og HPDE etter eksponering for SapC-DOPS, SapC alene, eller DOPS alene. (E) Western blot-analyse viser at behandling av MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler med både SapC-DOPS og staurosporin positiv kontroll (P) resulterte i spaltning av pre-caspase-9 til aktiv kaspase-9, mens behandling med DOPS, PBS og negativ kontroll (N) førte ikke til enzymaktivering.
tumorceller (Panc-1, CAPAN-1 og MiaPaCa-2 i (B), (C) og (D) henholdsvis) hadde morfologiske egenskaper i samsvar med apoptotisk død etter behandling med SapC-DOPS, mens de ikke-transformerte HPDE celler (A) dukket normal.
Sammenheng mellom drepende effekt av SapC-DOPS og PS eksponering på bukspyttkjertelen celleoverflaten.
fluorescens histogrammet i figur 3A viser at det eksterne PS nivå på PANC-1-celler var høyere enn for ASPC-1-celler. Den relative PS uttrykk på celleoverflaten av humane pankreatiske tumorcellelinjer er vist i figur 3B. Blant disse cellelinjene, MiaPaCa-2, HPAF-II, og PANC-1 hadde MF over 50 og derfor omfattet «High-PS» gruppe. Som vist i figur 3C, cellene i High-PS gruppen viste signifikant større cytotoksisitet i respons til SapC-DOPS enn cellene i lav-PS gruppen (p 0,05).
(A) Fluorescens histogram av PS nivåer på PANC-en og ASPC-en celleoverflater målt ved Annexin V-FITC. (B) Den differensielle PS-ekspresjon på human pankreas celleoverflaten av 9 cellelinjer. (C) Kombinert prosentandel av celleoverlevelse i de to gruppene av cellelinjer behandlet med SapC-DOPS som bestemt ved MTT-analyse (p = 0,0032)
In vivo
Studies.: subkutan bukspyttkjertelen tumor Model
Dose vurdering for hemming av bukspyttkjerteltumorvekst ved SapC-DOPS.
tumor størrelser etter administrasjon av SapC-DOPS ved doser på 4 mg /kg og 8 mg /kg hver annen dag var betydelig mindre enn den for kontrollgruppen og 1 mg /kg behandlingsgruppen (p = 0,003 * og ** 0,00015) etter 18 dagers behandling (figur 4). Basert på disse dataene, valgte vi en behandlingsdose på 6 mg /kg for effektstudier.
PANC-1 xenografttumorer i nakne mus ble behandlet hver dag med 1, 4 eller 8 mg /kg av SapC -DOPS, eller med PBS kontroll. Tumor størrelser ved høye doser (4 mg /kg og 8 mg /kg) var betydelig mindre enn kontroll og 1 mg /kg gruppene (p = 0,003 * og 0,00015 **, henholdsvis).
Evaluering av evne til SapC-DOPS å målrette overflate PS på pankreatiske tumorceller.
live avbildning demonstrerte at fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles ble hurtig rettet mot følbar tumor i løpet av 5 minutter (data ikke vist) og fluorescens vedvarte i over fire dager (figur 5). Fluorescensen fra den sammensatte SapC-DOPS nanovesicles målrettes til tumor områder, mens ingen svulst fluorescens ble registrert etter ko-injeksjon av ikke-kompleks SapC og fluorescensmerket DOPS, eller etter injeksjon av fluorescensmerkede DOPS alene eller PBS-kontroll (figurene 6A og 6B). Mens fluorescensmerkede SapC-DOPS ble notert til å akkumulere i leveren tidlig (2 timer etter injeksjon), var det ingen spor av lever fluorescens i levende avbildning etter 24 timer (Figur 6A). Tilsvarende ikke-kompleks SapC og fluorescensmerkede DOPS, og de fluorescensmerkede DOPS alene, ble identifisert i leveren 0.5 timer på levende avbildning, men raskt forsvant (figur 6B).
nanovesicles ble hurtig målrettet til håndgripelig svulst i løpet av 5 minutter (data ikke vist). Fluorescens varte i over 1 (A) og 4 (B) dager. SapC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, CVM = 6 mikrometer.
Heterotop MiaPaCa-2 tumorer (innringet) ble generert ved subkutan injeksjon i øvre flanken av nakne mus. (A) Mus 1 2 var tumor-bærende mus, injisert med fluorescensmerkede SapC-DOPS nanovesicles; Mouse 3 var ikke-tumorbærende, PBS injisert. Mus 1 og 2 begge viser lokalisering av fluorescerende markør til tumorstedet. Fluorescens lokaliserer også til leveren etter 2 timer, men er gått 24 timer. (B) tumor-bærende mus 4, 5 og 6 ble injisert med ikke-kompleks SapC og fluorescensmerkede DOPS, kun fluorescensmerkede DOPS, og PBS, respektivt. Det er ingen fluorescens lokalisert til tumor i noen av disse mus. ER.
