Abstract
p53 tumor suppressor funksjon kan bli svekket i mange svulster ved mobil antagonist HDM2 og humant papillomavirus onkogen E6 som induserer p53 degradering. Restaurering av p53 aktivitet har sterk terapeutisk potensial. Her har vi identifisert TSC-22 som en roman p53-samspill protein og vise sin roman funksjon som en positiv regulator av p53. Vi fant ut at TSC-22 nivå ble betydelig nedregulert i livmorhalskreft vev. Videre, over-ekspresjon av TSC-22 var tilstrekkelig til å hemme celleproliferasjon, fremme cellulær apoptose i cervikale kreftceller og undertrykke veksten av tumorer i mus xenograft. Ekspresjon av også TSC-22 forbedret proteinnivået av p53 ved å beskytte den fra poly-ubiquitinering. Når bundet til motivet mellom aminosyrene 100 og 200 av p53, TSC-22 hemmet HDM2- og E6-mediert p53 poly-ubiquitinering og degradering. Derfor ektopisk over-uttrykk for TSC-22 aktivert funksjonen til p53, etterfulgt av økt uttrykk av p21
Waf1 /Cip1 og PUMA i humane livmorhalskreft cellelinjer. Interessant, gjorde TSC-22 ikke påvirke samspillet mellom p53 og HDM2. Knock-down av TSC-22 ved hjelp av små interfererende RNA tydelig forbedret poly-ubiquitinering av p53, som fører til degradering av p53. Disse resultatene tyder på at TSC-22 fungerer som en tumor suppressor ved å sikre p53 fra poly-ubiquitinering mediert-degradering
Citation. Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, Park J, Jang IS, et al. (2012) sentrale rolle av TSC-22 i Hindre Proteasomal Nedbrytning av p53 i livmorhalskreft. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10,1371 /journal.pone.0042006
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 29 juni 2011; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 01.08.2012
Copyright: © Yoon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble hovedsakelig støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (20110026217) og delvis assistert av Korea Basic Science Institute NAP tilskuddet (T3278B) og den interne tilskudd fra Korea National Institute of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, dicision å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TGF
β
stimulert klone 22 (TSC-22) ble først identifisert som en TGF
β
-inducible genet i mus osteoblastiske celler. TSC-22 ekspresjon blir indusert i en rekke cellelinjer av TGF
β
, forbolester, serum, og progestin og positivt regulerer TGF
β
signale [1], [2- ]. TSC-22 inneholder et leucin-glidelås-lignende motiv, men det har ikke et DNA-bindende motiv ved den N-terminale region. TSC-22 kan homodimerize og heterodimerize med TSC-22 homolog gen-en (THG-1), og har transcriptional repressor aktivitet [3].
Noen forskere har identifisert de fysiologiske rollene til TSC-22 i utviklings prosess. TSC-22 er nødvendig for gastrulation under tidlig embryo i
Xenopus laevis product: [4] og for oogenesen i
Drosophila product: [5]. Det har også vært antydet at TSC-22 induserer erytropoide celle og Cardiac myofibroblast differensiering via aktivering av transkripsjonen aktivitet av Smad3 og Smad4, og motvirke den Smad7 svar på TGF
β
-avhengig signale [6], [ ,,,0],7].
i tillegg har flere studier fokusert på svulst undertrykkelse funksjonene TSC22. TSC22 er antatt å være et potent tumor suppressor i spyttkreftceller [8], [9] humane gastriske karsinomceller [10], hepatisk karsinom [11], human astrocytic tumorer [12], og store granulære lymfocytter leukemi [13]. De detaljerte mekanismer av tumor suppressor funksjon TSC22 er rapportert sammen med hypotesen om at TSC-22 undertrykker uttrykk for anti-apoptotiske gener
Gadd45b Hotell og
Lzts2 product: [11], negativt regulerer Ras /Raf signalering [14] og er involvert i TGF-b-mediert gastrisk karsinom celledød i en caspase3 avhengig måte [10]. På den annen side er TSC22-mediert apoptose aktivitet inhiberes ved interaksjonen mellom TSC-22 og fortillin, etterfulgt av fører til TSC-22 destabilisering [15].
(A) Totalt RNA ble fremstilt fra pasienter « kreftprøver og
TSC-22
mRNA nivået ble så evaluert med real-time RT-PCR. Cx; Serienummeret på pasient vevsprøver. (B)
HeLa Hotell og
Caski
celler ble sådd ut på seks-brønns plater. Etter 24 timer ble cellene infisert med Ad-
TSC-22
eller adresse
LacZ
. På de angitte tidspunkter, ble celletall bestemt ved MTT-analyse for å analysere celleproliferasjonsprosesser priser. (C)
Jakten
celler infisert med Ad-
TSC22
eller adresse
LacZ
ble dyrket i de angitte tidsrom, og cellene ble deretter farget med propidiumjodid (PI ). Den sub-G1 cellepopulasjon (død celle) og cellesyklusprofil av PI-fargede celler ble analysert ved flow-cytometri etter PI-farging. (D) DNA-fragmentering analysen ble utført ved å isolere kromosomal DNA fra 1 × 10
6 antall
HeLa Hotell og
Caski
celler infisert med Ad-
TSC22
eller Ad
lacZ
i 72 timer (til venstre). Etter 3 dager infeksjon i adresse
TSC-22, etter p53, Puma, p21, E6 og TSC22 uttrykk ble analysert ved Western hybridisering (til høyre).
p53 er et godt kjent tumor suppressor genet som virker ved å aktivere transkripsjon av sine målrettede gener som p21, PUMA,, PKR og BAX [16] – [18]. p53-funksjon reguleres av post-translasjonelle modifikasjoner så som fosforylering, acetylering, og ubiquitinering. Det er godt forstått at p53 nivåer er strengt regulert av MDM2-mediert ubiquitinering via en auto-regulerende feedback loop [19], [20]. Av og til er regulering av p53-ekspresjon korrelerte med tumorgenese gjennom infeksjon av human papilloma virus som uttrykker E6, noe som fører til ubiquitin-formidlet p53-degradering [21], [22]. Selv om regulering av p53 er blitt undersøkt via flere ruter relatert til tumorgenese, mange spørsmål forbli omtrent den tumorinhibering mekanisme av p53-reaksjonsveien.
Siden den mekanisme som ligger til grunn av nettverket av tumorsuppressorgener ennå ikke har blitt uttrykkelig klarlagt, gjennomførte vi et cDNA microarray analyse av genekspresjon profilen i kreftvevet for å finne nye tumor-relaterte gener. Vi fant at TSC-22-ekspresjon ble betydelig redusert i livmorhalskreft vev sammenlignet med normale vev. Deretter utforsket vi romanen funksjon av TSC-22 under tumorigenesis. Vi har derfor utført et gjær to-hybrid assay for å skjerm for nye TSC-22-bindende proteiner. Fra dette ble p53 identifisert som et TSC-22-bindende protein. Vi fant også at TSC-22 kan styrke virksomheten til p53 gjennom hemming av HDM2 og E6-mediert ubiquitinering ved direkte binding til p53. På den annen side, TSC-22 over-ekspresjon stabilisert p53-protein-nivå, noe som fører til økt celledød og inhibering av celleproliferasjon. Til slutt, tumorveksthastigheten ble sterkt redusert ved ekspresjon av TSC-22 i en xenograft tumormodell. Tatt sammen indikerer disse resultater at TSC-22 spiller en avgjørende rolle i hemming av tumorvekst gjennom regulering av p53 ubiquitinering.
(A) TSC-22 og p53 cDNA-konstruksjoner ble kotransformert inn i EGY48 gjærceller til test for protein-protein interaksjon i gjær to-hybrid system. Transformanter ble analysert for deres evne til å vokse på medium som mangler leucin (til venstre) og for β-galaktosid uttrykket (til høyre). (B)
HeLa
celler og
Caski
celler ble infisert med Ad-
TSC-22
i de angitte tidsrom. Proteinnivåer ble analysert ved hjelp av Western blot med den DO-1 antistoff mot p53, anti-TSC-22-antistoff, og anti-β-actin-antistoff som en lasting kontroll. (C)
HeLa
-celler ble transfektert med 1 ug Flag-TSC-22 ekspresjonsvektor. 24 timer etter transfeksjon, p53, Puma, P21, og TSC22 ekspresjon ble analysert ved Western blotting og semi-kvantitativ RT-PCR med protein og totalt RNA oppnådd fra hver cellelinje. (D)
HeLa-celler som stabilt uttrykker
shRNA spesifikk for TSC-22 og ikke-målsøkende kontroll shRNA ble analysert for å bestemme protein- og mRNA-ekspresjonsnivåene av p53 og Puma. (E) Luciferase aktivitet av p53RE (ansvarlig element) -driven promoter ble vurdert med transfeksjon av den angitte mengden Flag-TSC-22 plasmid i
HeLa
celler (øvre panel). Aktivitet av p53RE-promoter ble vurdert i
sh-con Hotell og
sh-TSC-22
uttrykke
HeLa
celler (nedre panel) av luciferase analyser. (F) En mikrogram av Flag-TSC-22 eller Flag-mock vektor ble transfektert inn i
p53
+ /+ eller
p53
– /-
HCT116
celler. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellelysater analysert ved Western blotting med de angitte antistoffer. (G) Stabilitet av p53 protein ble vurdert i
Jakten
celler infisert med Ad-
TSC-22
eller adresse
LacZ
. 24 timer etter infeksjon, ble cellene behandlet med cykloheksimid (50 ug /ml) for de angitte tidsperioder. Cellelysater ble analysert ved Western blotting med anti-p53 antistoff (DO-1) med β-actin som en lasting kontroll.
Resultater
TSC22 hemmer tumorvekst
for å analysere den spesifikke genuttrykk profilen til livmorhalskreft, gjennomførte vi cDNA microarray analyse med cDNA preparert fra pasientenes livmorhalskreft vev. Interessant, våre microarray data viste at
TSC-22
genekspresjon ble merkbart redusert i alle kreftprøver (data ikke vist). Vi så gjennomført real-time PCR (RT-PCR) analyse for å bekrefte microarray resultater. Som vist i figur 1 A,
TSC-22
mRNA-ekspresjonsnivåer i pasientenes kreftvev ble signifikant redusert sammenlignet med de i normalt vev.
Disse resultater har ført til flere spørsmål. Det første spørsmålet var om TSC-22 kunne undertrykke tumor celleproliferasjon eller ikke. Derfor vi infisert
HeLa plakater (HPV-18) og
Caski plakater (HPV-16) celler med adenovirus uttrykker
TSC-22
eller
LacZ
(smittevern). Som vist i figur 1B, ble spredningsforhold av begge cellene betydelig redusert ved infeksjon med Ad
TSC-22
. Vi neste undersøkt om TSC-22 kan indusere cellesyklus og apoptose i
Jakten
celler. Vi fant ut at G0 /G1 befolkningen ble dramatisk økt blant Administratorer
TSC-22-
infiserte celler i forhold til at det i adresse
LacZ-
infiserte celler innen 48 timer etter infeksjon. Videre mest Admin
TSC-22-
infiserte celler gikk apoptose i sent stadium (figur 1C). Vi neste vurdert kromosomal-DNA fragmentering å observere TSC-22-indusert apoptose i
HeLa Kjøpe og
Caski
celler. Som vist i figur 1D, kromosomalt DNA fra adresse
TSC-22
-infected
HeLa Hotell og
Caski
celler viste meget høyt nivå av fragmentering. Dessuten p21 (cellesyklus hemmer) og PUMA (apoptose induser) uttrykk nivåer ble vesentlig styrket i Ad
TSC-22
infisert
HeLa Hotell og
Caski
celle (figur 1D panel til høyre). Disse effektene var mer betydelig i kronisk HPV18-smittet
HeLa
celle. p53 og TSC22 nivå i HeLa-celler ble så vidt oppdages sammenligne (d) for å caski-celler (panel figur 1D høyre). Vi spekulere at deres forskjellige uttrykk er forårsaket av den forskjellige serotype av HPV. Disse resultatene indikerer at over-ekspresjon av TSC-22 induserte høye nivåer av celledød. Våre resultater antyder sterkt at TSC-22 spiller en sentral rolle i livmorhalstumorcellevekst og død.
ectopically uttrykt TSC-22 samhandler med ectopically uttrykt p53 i
H1299
celler. To ug Flag-TSC-22 ekspresjonsvektor ble kotransfektert med flagg-p53-ekspresjonsvektoren (A) eller et ikke-merket p53-ekspresjonsvektoren (B) inn
H1299
celler dyrket i 100 mm plater. 48 timer etter transfeksjon, ble cellelysater immunopresipitert med et anti-p53 (DO-1) (A) eller anti-Flag (B) monoklonalt antistoff. Immunopresipitater ble analysert ved Western blotting ved å bruke et HRP-konjugert anti-Flag (A) eller anti-p53 (FL393) (B) monoklonalt antistoff. (C-D) TSC-22 samvirker med endogen p53. Ectopically uttrykt TSC-22 samhandler med endogent p53 i celler. HEK293-celler ble transfektert med 2 ug Flag-TSC-22-plasmid i 48 timer. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-p53 (DO-1) monoklonalt antistoff, mus immunoglobulin G (IgG) (C), eller et anti-Flag (D) monoklonalt antistoff. Immunutfelninger ble analysert med Western blotting ved hjelp av en HRP-konjugert anti-Flag (C) eller anti-p53 (FL393) antistoff.
TSC-22 bindes til
p
53 i en gjær To-hybrid analysen
Som vist av våre data, TSC-22 bidrar til å hemme kreftcellevekst og celledød. Dette var konsistent med tidligere studier som viser at TSC-22 er en potensiell tumor suppressor [8] – [11], [13], [23] – [25]. For å belyse de mekanismer som ligger til grunn for denne funksjonen, må vi screenet for TSC-22-bindende proteiner ved anvendelse av en gjær to-hybrid-analyse. Gjennom dette ble p53 identifisert som et TSC-22-bindende protein (figur 2A, venstre panel). Samspillet mellom TSC-22 og p53 ble således demonstrert
in vitro
av både cellevekst og en β-galaktosidase-analyse (figur 2A, høyre panel).
Bestemmelse av effekten av TSC- 22 på
p
53
for å bedre forstå effektene av TSC-22 på p53,
HeLa Hotell og
Caski
celler ble infisert med Ad-
TSC-22
eller
LacZ
for å øke perioder. Interessant, endogene p53 nivåene var signifikant økt med transfeksjon av adresse
TSC-22
i en tidsavhengig måte (figur 2B). Forbedring av p53 uttrykk var mer betydelig i
Jakten
celler enn i
Caski
celler. For å observere den forbedring av p53-genet target-aktivitet ved ekspresjon av TSC22, Flag-tagged TSC-22 ble innført i
HeLa-celler
. p53 protein og dets mål gener, inkludert p21 og puma, var tydelig indusert av Flag-
TSC-22
uttrykk (Figur 2C). Omvendt, banket ned TSC-22 i
Jakten
celler redusert protein nivåer av p53 og PUMA (figur 2D). Men nivået av p53 mRNA ble ikke påvirket av knock-ned og over-uttrykk for TSC-22 (figur 2C og 2D, nedre panel).
For å avgjøre om p53 aktivitet reguleres av TSC-22 uttrykk i
HeLa
celler, vurdert vi
p53RE plakater (ansvarlig element) -driven promoter aktivitet med TSC-22 uttrykk og banke ned av TSC-22 i
HeLa
celler . En promoter huse en
p53RE
ble aktivert av TSC-22 uttrykk på en doseavhengig måte. På den annen side ble det promoter-aktivitet ble redusert med TSC-22 knock-down. Disse data tyder på at p53-mediert transkripsjonen aktivitet er regulert av TSC-22 (figur 2E). For å vurdere om reduksjoner i PUMA og p21 er forårsaket av direkte regulering av p53 ved TSC-22, flagg-merket
TSC-22
plasmid ble innført i
HCT116 p53
+ /+
og
p53
– /-
celler. Forbedret uttrykk for PUMA ble observert i
p53
+ /+
men ikke
p53
– /-
celler (figur 2F). Dette resultatet tyder på at reguleringen av Puma og p21 ved TSC22 er avhengig av p53. For ytterligere å undersøke forbedring av p53 ved TSC-22, vurdert vi p53 stabilitet i Ad
TSC-22
eller adresse
LacZ
smittet
Jakten
celler etter cycloheximide behandling . Som vist i figur 2 G, Ad-
TSC-22
sterkt forbedret og stabilisert endogent p53-nivåer. Disse resultatene tyder på at TSC-22 fremmer tumor suppressor funksjon av p53 ved å styrke stabiliteten i p53 protein.
(A) Prinsippskisse viser cDNA konstruerer for the Flag-taggede p53 sletting mutanter og full-lengde p53 , og indikerer TSC22 bindende domene. (B)
H1299
celler ble transfektert med de angitte plasmider som koder Flag-taggede p53 delesjonsmutanter sammen med the Flag-TSC-22 plasmid. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-p53-polyklonalt antistoff FL393 (venstre) eller DO-1 monoklonalt antistoff som er spesifikt for det N-terminale område (til høyre), etterfulgt av Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. Lysater (5%) ble også lastet på en SDS-gel for Western blotting ved å bruke et anti-Flag-antistoff (bunnen av hvert panel). (C) Prinsippskisse som viser cDNA-konstruksjoner av flagget-taggede TSC-22 delesjonsmutanter (venstre panel).
H1299
celler ble transfektert med de angitte plasmider som koder the Flag-merket TSC22 delesjonsmutanter sammen med Flag-p53 plasmid. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-p53-antistoff (FL393); co-immunopresipitert TSC22 ble oppdaget av Western blotting med HRP-konjugert anti-Flag antistoff (høyre, midtre panelet). Lysat (5%) ble analysert ved Western blotting ved hjelp av en anti-Flag antistoff (til høyre, nederst panel).
TSC-22 bindes til
p
53
in vivo
For å finne ut om TSC-22 samhandler med p53 i pattedyrceller, vi transfektert
H1299
human lunge ikke-småcellet karsinom celler med flagget-TSC22 uttrykk plasmid og ^ p53 uttrykk plasmid, og deretter utført co-immunoutfellingsstudier og Western blot-analyser. Vi fant at TSC-22 spesielt ko-immunopresipitert med p53 i celler som uttrykker både Flag-TSC22 og p53, men ikke i celler som uttrykker enten protein alene (figur 3A). Omvendt, p53 spesifikt co-immunopresipitert med TSC-22 med anti-Flag-antistoff (figur 3B), noe som antyder en interaksjon mellom TSC-22 og p53. Deretter prøvde vi å bekrefte den endogene samspillet mellom p53 og TSC-22. Siden vi ikke kunne kjøpe en passende TSC-22 antistoffet å bruke i en co-immunoprecipitation eksperiment, ble dette samspillet bekreftet av gjensidig samarbeid immunoprecipitation med endogen p53 og eksogent uttrykt Flag-merket TSC-22 i HEK293 celler som uttrykker høye nivåer av p53 (figurene 3C og D). Resultatene tyder på at TSC-22 samhandler direkte med p53.
TSC-22 binder seg til p53 i regionen, inkludert aminosyrer 100 til 200
For ytterligere å definere regionen avgjørende for binding TSC-22 til p53, p53 genererte vi en rekke delesjonsmutanter (Figur 4A). Ekspresjonsplasmider av p53 og TSC-22 ble transfektert inn i
H1299
cellene sammen eller alene. Som vist i figurene 4A og B, TSC-22 var i stand til å binde seg til p53 flere partielle delesjonsmutanter inkludert p53
1-300, p53
101-393, og p53
1-200. Imidlertid ytterligere sletting av en del av det indre området av den DNA-bindende domene, for eksempel p53
1-100, p53
201-393, p53
301-393 og p53
201-300, avskaffet p53-TSC22 binding (4A og B). Disse resultatene indikerer at den regionen, inkludert aminosyrer 100-200, som er en del av p53 DNA-bindende domene, er nødvendig for binding TSC-22. Deretter, for å identifisere den p53 bindende regionen av TSC-22, Flag-tagged avkortede TSC-22 mutanter som hver inneholdt en α-heliks ble uttrykt med p53 som vist i fig. 4C. I co-immunutfelling forsøk under anvendelse av et anti-p53-antistoff (DO-1), TSC-22
54-154 ble ko-immunopresipitert med p53, men TSC-22
1-110 og TSC-22
54-110 var ikke. Disse dataene tyder på at p53 binder aminosyrer 110-154 av TSC-22. Dessverre kunne vi ikke lenger bekrefte detaljert samspill av p53-TSC-22 fordi TSC-22
110-154 ble ikke uttrykt i vårt eksperiment (Figur 4C). Til sammen våre data viser at TSC-22 og p53 samhandle på bestemte domener i hvert protein.
(A) TSC22 hemmer HDM2-mediert p53 ubiquitinering.
H1299
celler ble transfektert med de angitte plasmider. De transfekterte celler ble behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før innhøstingen. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff. Ubiquitinmolekyler p53 ble påvist ved Western blotting med et anti-p53-antistoff (DO-1). Ubiquitinmolekyler p53 er indisert som Ub (n) -p53 (øvre panel). Uttrykket av total p53, er HDM2, Flagg-TSC-22 og HA-UB proteiner vist i de nederste panelene. (B) TSC-22 ikke forstyrrer samspillet mellom p53 og HDM2.
H1299
-celler ble transfektert med flagg-p53 sammen med flagg-TSC-22 eller en flagg-mock vektor i nærvær av en HDM2 ekspresjonsvektor. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-p53 (DO-1) antistoff, etterfulgt av Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. Lysat (5%) ble analysert ved Western blotting ved anvendelse angitte antistoffer (lavere panel). (C) TSC-22 inhiberer E6-mediert p53 ubiquitinering.
H1299
-celler ble transfektert med de angitte plasmider i nærvær av en HA-Ub ekspresjonsvektor. 48 timer etter transfeksjon, ble de transfekterte cellene ble behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før de ble høstet. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff. Ubiquitinmolekyler p53 ble påvist ved Western blotting med anti-p53-antistoff (DO-1). Ubiquitinmolekyler p53 er indisert som Ub (n) -p53 (øvre panel). Uttrykket av total p53, er Myc-E6, flagg-TSC-22, og HA-UB proteiner vist i de nederste panelene. (D) TSC-22 forstyrrer ubiquitinering av p53 i
Jakten
celler.
Jakten
celler ble transfektert med flagg-TSC-22 eller et flagg-mock vektor og HA-Ub uttrykk vektor. 48 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 20 uM MG132 i 5 timer før høsting. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff. Ubiquitinmolekyler p53 ble påvist ved Western blotting med et anti-p53-antistoff (DO-1). (E) Stabil TSC-22 knock-down eller kontroll
Jakten
celler ble behandlet med 20 mikrometer MG132 i 5 timer før høsting. Ubiquitinering av p53 ble analysert som beskrevet ovenfor.
TSC22 hemmer HDM2 og E6 formidlet p53 Poly-ubiquitinering
For å avgjøre om forbedring av p53 stabilitet ved TSC-22 er på grunn av hemming av p53 ubiquitinering,
H1299
-celler ble transfektert med HDM2, p53, og TSC-22 ekspresjonsplasmider, og behandles med den proteasomal inhibitor MG132 i 6 timer for å gjennomføre
in vivo
ubiquitinering assays . Som vist i figur 5A, ble p53 sterkt ubiquitinmolekyler med ekspresjonen av HDM2. Imidlertid ytterligere HDM2-p53-mediert ubiquitinering ble betydelig inhibert av ekspresjonen av TSC-22 (figur 5A). Vi neste ønsket å bestemme hvorvidt inhibering av HDM2-p53-mediert ubiquitinering ved TSC-22 er forårsaket av avbrudd av interaksjonen mellom HDM2 og p53. Derfor innførte vi p53, HDM2, og TSC22 ekspresjonsplasmider til
H1299
celler som vist i figur 5B. p53 ble deretter immunopresipitert fra celleekstrakter med DO-1-antistoff. Interessant, dette eksperimentet viste at p53 ble samtidig bundet til HDM2 og TSC-22. Dessuten ble p53-HDM2 interaksjonen ikke er avbrutt av ekspresjon av TSC-22. Disse data tyder på at TSC-22 kan beskytte p53 fra HDM2-mediert ubiquitinering ved direkte binding til p53 i et område atskilt fra HDM2 bindingssetet.
(A) HDM2 og Myc-E6 ble transfektert med angitte plasmider inn
H1299
celler. De transfekterte celler ble behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før innhøstingen. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff. Ubiquitinmolekyler p53 ble påvist ved Western blotting med et anti-p53-antistoff (DO-1). Ubiquitinmolekyler p53 er indisert som Ub (n) -p53 (øvre panel). Uttrykket av total p53, er HDM2, Flagg-TSC-22 og HA-UB proteiner vist i de nederste panelene. (B) Flag-merket villtype (WT) eller mutant TSC22
1-110 ble ko-transfektert med de indikerte plasmider i
H1299
celler. De transfekterte celler ble behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før innhøstingen. Cellelysater ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff. Ubiquitinmolekyler p53 ble påvist ved Western blotting med et anti-p53-antistoff (DO-1). Ubiquitinmolekyler p53 er indisert som Ub (n) -p53 (øvre panel). Uttrykket av total p53, er HDM2, Flagg-TSC-22 og HA-UB proteiner vist i de nederste panelene. (C) Nude mus ble inokulert med 1 × 10
6
Jakten
celler ved subkutan injeksjon. Subkutane svulster avledet fra
Jakten
celler ble behandlet med adenovirus vektorer som angitt. Tumorvolumer er vist som gjennomsnittet av minst fem mus pr gruppe (n = 10 til 14 per gruppe). Bars = SD. (D) Virkning av TSC-22-behandling på ekspresjonsnivået av p53 i HeLa-celle-avledede tumorer skåret ut ved 27
th dag etter behandling som bestemt ved immunoblotanalyse. Representant immunoblot av de tre prøvene fra hver gruppe.
siden forsøkt å vise at TSC-22 kan beskytte p53 fra E6-mediert ubiquitinering fordi E6 og HDM2 bindende domener av p53 overlapping. p53 var sterkt ubiquitinmolekyler med uttrykk for E6 i
H1299
celler (figur 5C, Lane 3); imidlertid ytterligere ekspresjon av TSC-22 tydelig blokkerte E6-mediert p53 ubiquitinering (figur 5C, Felt 4). Vi neste brukte
Jakten
celler som konstitutivt uttrykt E6 for å undersøke TSC-22-mediert p53 stabilitet under fysiologiske forhold. Ubiquitinering av p53 ble sterkt øket etter MG132 behandling i cellene. I motsetning til dette, dette ubiquitinering tydelig forsvant ved å over-ekspresjon av TSC-22 (figur 5 D). p53 ubiquitinering ble reddet ved ekspresjon av shRNA spesifikk for TSC-22 i
HeLa
celler i fravær av MG132 (figur 5E, spor 2). Imidlertid er forskjellen i nivået av p53 ubiquitinering var ikke signifikant mellom
sh-con
og
sh-TSC-22
celler i nærvær av MG132. Vi har utforsket ytterligere virkningen av TSC-22 på p53 ubiquitinering ved ekspresjon av både HDM2 og E6. Som vist i figur 6A, ble nivået av p53 ubiquitinering dramatisk indusert av både HDM2 og E6. Men begge HDM2 og E6-mediert p53 ubiquitinering var tett avbrutt av TSC-22 uttrykk (Figur 6A). I tillegg, testet vi om TSC-22-p53 interaksjon er nødvendig for å inhibere p53 ubiquitinering. Som vist på figur 6B, C-terminal delesjonsmutant TSC-22
110 som ikke reagerer med p53 (figur 4C), hemmet ikke HDM2 og E6 mediert-p53 ubiquitinering (figur 6B). Dette resultatet viser at TSC-22 hemme p53 ubiquitinering via direkte interaksjon. Disse dataene antyder sterkt at TSC-22 samhandler direkte med p53 og blokkerer E6 og /eller HDM2-medidated p53 ubiquitinering, fulgt av stabiliserende protein av p53.
TSC-22 undertrykker tumorvekst i Nude Mice
Vi neste fastslått om TSC-22 hemmer tumorvekst
in vivo
. Eksponentielt voksende
Jakten
livmorhalskreftceller ble injisert subkutant i immunmangel BALB /c nakne mus. Når tumorvolumet nådde ca 100 mm
3, 1 x 10
9 pfu av adenovirus som uttrykker TSC-22 eller
LacZ
ble injisert inn i tumorene. Etter tre sekvensielle intra-tumoral injeksjon av adenovirus ble dyrene (5-7 per gruppe) overvåkes med hensyn til tumorvekst. Tumor vekst og morfologi ble analysert i løpet av 30 dager. Figur 6C viser at tumormassen i mus injisert med Ad-TSC-22 ble bemerkelsesverdig redusert i forhold til svulster injisert med adresse
LacZ
eller som var ubehandlet. Vi neste undersøkte effekten av TSC-22 p53 på stabilisering i tumorvev, som er høstet fra kontroll og TSC-22-behandlede mus. TSC-22 transfeksjon ble observert å øke ekspresjonsnivået av p53-protein (figur 6D). Sammen er disse resultatene viser tydelig at TSC-22 kan være en potent tumor suppressor i denne dyremodell.
Diskusjoner
I vårt søk for å identifisere gener assosiert med livmorhalskreftutvikling, analyser uttrykk mønster etter cDNA microarray eksperimenter og RT-PCR viste at
TSC-22
genet ble konsekvent redusert i tumorvev (fig. 1a). Flere tidligere studier har rapportert at TSC-22 er nedregulert i menneskelige spyttkjertelsvulster [23], mus leversvulster [11], og menneskelige hjernesvulster som astrocytomas [26]. Disse resultater antyder at nedregulering av TSC-22 kan spille en rolle i utvikling av kreft i forskjellige vev. Men disse tidligere rapporter ikke ta opp problemet med TSC-22 blir redusert i kreftceller. En rimelig forklaring er at TSC-22 kan hemme kreft celle utvikling. Våre resultater viste at TSC-22 dramatisk inhiberte celleproliferasjon og celledød når den uttrykkes med et adenovirus ekspresjonssystem (figurene 1C og D). Tilsvarende er forbedring av TSC-22 ekspresjonen forbundet med økt apoptose i humane mage-karsinomceller [10].
Gitt at TSC-22 er en transkripsjons repressor [3], rollen til TSC-22 i tumor suppresjon har blitt foreslått av Mari
et al
. [11]. Gjennom eksperimenter med TSC-22 siRNA, denne gruppen viste at DNA-skader-induserbar genet 45 β (Gadd45ß) og antatte tumor suppressor 2 (Lzts2) er antatte mål for TSC-22. Men forholdet gjennom disse målene spiller sentrale roller i tumor undertrykkelse av TSC-22 ble ikke direkte avslørt. I vårt forsøk på å finne en ny funksjon av TSC-22 i tumor undertrykkelse, identifiserte vi en bindende protein i en gjær to-hybrid eksperiment. Denne studien viste at TSC-22 bindes direkte til p53 (figur 2A). Vi har videre observert at TSC-22 oppregulert protein nivåene av p53 uten å endre nivåene av p53 mRNA. TSC-22 over-uttrykk og knock-down eksperimenter viste at TSC-22 forenkler funksjon av p53 som en transkripsjonen aktivator av målgener som kan hemme tumordannelse (Figur 2C-G). Disse resultatene indikerer at økt p53 protein-nivåer er assosiert med post-translasjonell regulering av TSC-22. TSC22-p53 interaksjon ble vurdert av
in vivo
analyser der p53 ble co-immunoutfelt med TSC-22 (Figur 3-4).
Over-uttrykk for TSC-22 klart forhindret ubiquitinering av p53 av HDM2, som regulerer p53 omsetning gjennom sin E3 aktivitet. Flere regulatorer som påvirker p53-funksjon via modulering av HDM2-p53 interaksjon har blitt identifisert, inkludert p14Arf [27], [28], YY1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Numb [ ,,,0],33], og Nucleostemin [34]. . Blant disse regulatorer, er Numb mest lik TSC-22 fordi Numb binder seg til p53 og HDM2, og dermed hindre ubiquitinering og degradering av p53 [33]
Ja, vi har oppdaget en trefoldig kompleks som inneholder alle tre proteiner: TSC-22, HDM2 og p53. Dermed gjør TSC-22 ikke konkurrere med HDM2 for binding til p53. TSC-22 binder seg til DNA-bindingsdomenet av p53, som er avgjørende for p53-funksjon. Derfor er det fortsatt ikke bestemt om denne interaksjonen er nødvendig for å aktivere målgener av p53 i kjernen.
Interessant, økt celledød og hemming av spredning av TSC-22 uttrykk ble oftere observert i
420−1.75×A
550)]/(time×volume×A
600).
Co-immunoprecipitation
To
