Abstract
Formål
Til tross for bruk av FDA-godkjente legemiddelselskap til et begrenset antall tilgjengelige mål (kinaser og mTOR), PFS nyrekreft (RCC) er bare en utvidet til to år på grunn av utviklingen av medikamentresistens. Her vurderer vi en roman terapeutisk for RCC som retter seg mot den exportin-en (XPO1) hemmer.
Materialer og metoder
RCC celler ble behandlet med oral tilgjengelig XPO1 inhibitor, KPT-330, og celleviabilitet og Annexin V (apoptose) analyser, og cellesyklus-analyser ble utført for å evaluere effekten av KPT-330 i to RCC-cellelinjer. Immunoblotting og immunofluorescens-analyse ble utført for å validere mekanismer for XPO1 inhibering. Effekt og on-target effekter av KPT-330 ble videre analysert in vivo i RCC xenograft mus, og KPT-330-resistente celler ble etablert for å vurdere potensielle mekanismer for KPT-330 motstand.
Resultater
KPT-330 svekket RCC levedyktighet gjennom veksthemming og apoptose-induksjon både in vitro og in vivo, en prosess som økte nukleær lokalisering av p21 ved XPO1 inhibering spilt en stor rolle. I tillegg KPT-330 resistente celler forble følsomme for tiden godkjent for RCC multi-kinase hemmere (sunitinib, sorafenib) og mTOR-hemmere (everolimus, temsirolimus), noe som tyder på at disse målrettet terapi vil forbli nyttig som andrelinje therapeutics følgende KPT-330 behandling.
Konklusjon
oralt tilgjengelig XPO1 inhibitor, KPT-330, representerer et nytt mål for RCC som in vivo effekt nærmer seg sunitinib. I tillegg celler motstandsdyktig til KPT-330 beholde sin evne til å svare på tilgjengelige RCC therapeutics som tyder på en ny tilnærming for behandling i KPT-330-naive samt -resistente RCC pasienter
Citation. Wettersten HI, Landesman Y, Friedlander S, Shacham S, Kauffman M, Weiss RH (2014) Spesifikk hemming av Nuclear eksportør exportin-en Demper nyrekreft Vekst. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10,1371 /journal.pone.0113867
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 23 juni 2014; Godkjent: 31 oktober 2014; Publisert: 02.12.2014
Copyright: © 2014 Wettersten et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1, og 1R01DK082690-01A1 og ved Karyopharm Therapeutics. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Mens noen av arbeidet ble finansiert, og noen av forfatterne ansatt ved Karyopharm dette ikke endrer forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. I tillegg ble ingen av forsøkene eller konklusjoner av papiret påvirket på noen måte av Karyopharm
Innledning
Nyre kreft (nyrecellekarsinom, RCC). Er 13
th mest vanligste kreftformen i verden og er en av få kreft hvis forekomsten er økende, en finne ikke bare på grunn av bedre diagnostiske teknikker [1], [2]. Tegn og symptomer på RCC er ofte subtil eller fraværende, slik at mer enn halvparten av pasientene er diagnostisert forresten, og ofte på metastatisk scenen, mens vurderes for andre sykdommer som akutt nyreskade [3]. Mens de fem-års overlevelse for de som presenterer med lokaliserte RCC er mer enn 70%, for de med metastatisk sykdom, faller fem-års overlevelse for en forferdelig kamp 16 til 32%. Omtrent halvparten av RCC pasienter utvikler avansert sykdom og krever systemisk behandling. Til tross for bruk av flere FDA-godkjente målrettede behandlingsformer i løpet av de siste årene, som er begrenset til multi-kinase hemmere og mTOR-hemmere, progresjonsfri overlevelse (PFS) er utvidet bare ett til to år med disse målrettede therapeutics skyldes i stor grad til utvikling av legemiddelresistens [4]. Således er det viktig å utvikle nye terapeutiske midler til andre mål enn kinaser og den mTOR-reaksjonsveien
p21 ble opprinnelig beskrevet som et cyklin-avhengig kinase-inhibitor (CKI) av cyclin-CDK2, -CDK1, og. – CDK4 /6 komplekser hvis uttrykk er klassisk regulert av p53 [5]. Men i løpet av årene har det vist seg å ha pleiotropisk, og til tider tilsynelatende motstridende effekter på celle-proliferasjon, apoptose, og begynnende alderdom i kreft og i vaskulær sykdom uavhengig fra p53 [5], [6]. Generelt sett, når p21 er lokalisert i kjernen, bindes det til cyklin-CDK-komplekser og derved hemmer deres funksjon i cellesyklusutvikling, noe som resulterer i cellesyklus-stans [5]. Men når p21 er lokalisert innenfor den cytosoliske rommet, hemmer det apoptose ved kompleksdannelse med pro-apoptotiske proteiner som pro-kaspase-3 eller ASK [7], [8]. I samsvar med disse antatte mekanismer, har tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist at økte cytosol-p21 er en indikator på dårlig prognose i RCC-pasienter [9], et funn også observert i andre krefttyper [10], [11].
atom~~POS=TRUNC eksportør, exportin11 (XPO1; CRM1), styrer Nucleo-cytoplasma lokalisering av mer enn 200 Nuclear Export Signal (NES) holdige proteiner, hvorav mange er tumor suppressor proteiner (tsps), inkludert p21 [12]. Det har tidligere vært vist at XPO1 inhibitorer har en terapeutisk effekt i RCC [13]. I denne studien har vi testet effekten av KPT-330, den muntlig tilgjengelig XPO1 inhibitor som nå er i fase I /II kliniske studier for å evaluere potensialet sitt kliniske, enten alene eller som kombinasjonsbehandling, avansert RCC. Vi viser nå at, sannsynligvis gjennom en mekanisme relatert til subcellulære lokalisering av p21, representerer dette oralt tilgjengelig XPO1 hemmer en levedyktig ny terapeutisk virker på en hittil uprøvd mål i RCC.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
RCC-cellelinjer ACHN og 786-O ble erholdt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og regelmessig evaluert med hensyn på tilstedeværelse av Mycoplasma. Normale humane nyre proksimale epitelial (NHK) celler ble oppnådd fra Lonza (Allendale, NJ). Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml streptomycin, og 100 mg /ml penicillin ved 5% CO
2 ved 37 ° C. Disse to cellelinjer ble valgt for å undersøke effekten av KPT-330 i både primær tumor avledet celler (786-O, som kan betraktes som «tidlige» svulster). Samt metastatiske celler (ACHN)
Materialer
Lipofectamine RNAiMAX transfeksjon reagens, Stealth RNAi negativ kontroll siRNA og Stealth RNAi XPO1 siRNA ble hentet fra Life Technologies (Grand Island, NY). KPT-330 ble syntetisert ved Karyopharm Therapeutics (Natick, MA). Sunitinib og sorafenib fri base ble oppnådd fra LC Laboratories (Worburn, MA). Everolimus og temsirolimus var gaver fra Dr. Prasit ved inngåelsen Sciences (San Diego, California). Dimetylsulfoksid (DMSO) og muse-monoklonalt anti-β-aktin-antistoff ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Kanin polyklonalt anti-XPO1 antistoff og monoklonalt anti-p53-antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Mus monoklonalt anti-p21WAF1 /Cip-antistoff ble oppnådd fra Millipore (Billerica, Massachusetts). Kanin monoklonalt anti-p21WAF1 /Cip-antistoff og anti-kanin IgG (H + L) F (ab «) 2 fragment (Alexa Fluor 488 konjugat) ble erholdt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Geit-anti-mus og geit-anti-kanin HRP-konjugert IgG ble oppnådd fra Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield HardSet Mounting Medium DAPI ble innhentet fra Vector Laboratories (Burlingame, California).
KPT-330, sunitinib, sorafenib, everolimus, og temsirolimus ble oppløst i DMSO for in vitro studier. KPT-330 ble kombinert med kjøretøyer Poloxamer 188 (Pluronic F68; oppnådd fra Spectrum Laboratory Products, Inc.) og PVP K-29/32 (Plasdone K-29/32; erholdt fra ISP Technologies, Inc.) i oppløsning og ble sunitnib oppløst i vegetabilsk olje for in vivo studien.
Immunoblotting
Immunoblotting var som beskrevet tidligere [14]. I korthet, etter passende behandlinger, ble cellene vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), lysert i lyseringsbuffer, og cellelysater ble immunoblottet. Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk i en time ved romtemperatur og probet med egnede antistoffer. Membranene ble deretter probet med HRP merket anti-mus eller anti-kanin-IgG-antistoffer. Signal ble oppdaget ved hjelp av forbedret Chemiluminescence (ECL) løsninger. Densitometry analyse ble utført utnytte ImageJ 1,440 programvare (https://imagej.nih.gov/ij), og etter normalisering til lasting kontroll (β-aktin) er angitt over hver immunoblot.
immunfluorescens
Etter den angitte behandling i åtte brønn kammers objektglass, immunofluorescens ble utført som beskrevet tidligere [14]. I korthet ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd og anbragt i blokkerende buffer. Deretter ble cellene inkubert med den angitte antistoff, inkuberes med anti-kanin IgG (H + L) F (ab «)
2 Fragment (Alexa Fluor 488 konjugat), og dekkglass med Vectashield med DAPI. Prøvene ble undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi.
MTT-analysen
Cellenes levedyktighet assay ble utført som beskrevet tidligere [14]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, og etter passende behandlinger, ble cellene inkubert i MTT-løsning /media-blanding. Deretter ble MTT oppløsningen fjernet og det blå krystallinske bunnfall i hver brønn ble oppløst i DMSO. Synlig absorbans av hver brønn ved 540 nm ble kvantifisert ved hjelp av en mikroplateleser.
Cell syklus analyse
Cellesyklus analyse ble utført utnytte MUSE Cell Analyzer (Millipore, Billerica, MA) etter produsentens instruksjon. I korthet, etter de angitte behandlinger, ble cellene vasket med PBS og farget med propidiumjodid (PI). Etter farging ble cellene behandlet for cellesyklus analyse
Annexin V analysen
Annexin V Død Cell analysen ble utført utnytte MUSE Cell Analyzer etter produsentens anvisninger. Kort fortalt, etter passende behandlinger, ble cellene inkubert med Annexin V og Døde Cell Reagens (7-AAD) og hendelsene for døde, sent apoptotiske, tidlig apoptotiske og levende celler ble talt opp.
Immunohistochemistry
Biogenex I6000 automatisert immunostainer ble brukt til å utføre IHC på formalinfiksert parafin innebygd xenografter. Antigen ble hentet av dampende med Cell Marque Declere reagens. Bakgrunn ble blokkert med Biogenex kraftblokk. Primært antistoff ble applisert i 1 time ved romtemperatur fulgt av påvisning med de to-trinns, Hi-Def Polymer Detection Kit fra Cell Marque, etterfulgt av celle Marque DAB chromagen. Prøvene ble kontra med hematoxylin, dehydrert, ryddet, og coverslipped. Vi brukte følgende primære antistoffer: p21 (Abcam) og Ki67 (Cell Marque). Den Millipore Apoptose kit ble brukt i henhold til produsentens protokoll.
siRNA transfeksjon
Lipofectamine RNAiMAX transfeksjon reagens ble blandet med Stealth RNAi siRNA følge produsentens instruksjoner. Deretter ble cellene inkubert med blandingen i vekstmedier uten penicillin /streptomycin for riktig tidspunkt for transfeksjon av siRNAs og knockdown ble bekreftet av immunoblotting.
ACHN xenograft mus eksperiment
UC Davis Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) komiteen godkjent spesielt denne studien. Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med University of California IACUC. Mann atymiske Nu /Nu mus ble hver injisert med 5 × 10
5 ACHN celler subkutant i flanken regionen. Tumorprogresjon ble overvåket ukentlig med en caliper (tumor volum = lengde x bredde x bredde /2). Når tumor størrelser nådde rundt 80-100 mm
3, mus ble tilfeldig fordelt i fem grupper (kjøretøy, sunitinib, KPT-330 lav eller høy dose, eller KPT-330 lav og sunitinib) for medikamentell behandling. For kjøretøyet gruppe, ble kjøretøy oppløsninger (Pluronic F-68 og PVP K-29/32 blanding og vegetabilsk olje) gitt oralt (to ganger per uke og fem ganger i uken henholdsvis n = 8). For sunitinib gruppen kjøretøyet løsning for KPT-330, ble Pluronic F-68 og PVP K-29/32-blanding, og sunitinib (40 mg /kg) gitt oralt (to ganger per uke og fem ganger i uken henholdsvis n = 8) [15]. For KPT-330 lav gruppe, ble lav dose av KPT-330 (7,5 mg /kg) og vegetabilsk olje gitt oralt (to ganger per uke og fem ganger i uken henholdsvis n = 8). For KPT-330 høy-gruppen, ble høye doser av KPT-330 (15 mg /kg) og vegetabilsk olje gitt oralt (to ganger per uke og fem ganger i uken henholdsvis n = 8). For KPT-330 lav og sunitinib gruppe, var lav dose av KPT-330 (7,5 mg /kg) og sunitinib (40 mg /kg) gitt oralt (to ganger per uke og fem ganger per uke henholdsvis n = 8). Etter 25 dagers behandling ble dyrene avlivet og tumorvev ble samlet i 10% formalin for immunhistokjemi analyse.
Statistiske metoder
For in vitro studier, sammenligninger av gjennomsnittsverdier ble utført ved hjelp av uavhengige utvalg t-test. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant. For in vivo studien ble tumorvekst sammenlignet parvis mellom alle behandlinger ved hjelp av Tukey HSD-metoden.
Resultater
Demping av XPO1 av KPT-330 hemmer RCC levedyktighet gjennom cellesyklus arrest og induksjon av apoptose
Vi først bekreftet at KPT-330 svekket nivåer av XPO1 i to RCC cellelinjer i samme størrelsesorden (fra 0,1 mm) til den som ble observert med tidligere utviklede hemmere av denne atom transporter (fig. 1a) [1. 3]. For å evaluere effekten av XPO1 hemming av KPT-330 mot celleoverlevelse, fant vi ut at celle levedyktighet i respons til denne inhibitor ble tydelig i en konsentrasjon på 0,1 mikrometer i RCC cellelinjer, men i en størrelsesorden høyere dose (10 mm) i normal renal tubulær epitelial (NHK) celler (fig. 1B), et funn som muligens på grunn av økte XPO1 nivåer i RCC-vev sammenlignet med normale nyrevev som vi tidligere har vist [13]. For å begynne å undersøke mekanismene i KPT-330-indusert redusert cellelevedyktighet i RCC, ble cellesyklus og apoptose analyse utført. Når inkubert med KPT-330, begge RCC-cellelinjer viste en økning av celler i G2 /M-fasen av cellesyklus på mer enn 10% (Fig. 1C), samt en apoptotisk cellefraksjon på ca. 10% (Fig . 1D og S1) fig., noe som tyder på at redusert levedyktighet av RCC celler ved KPT-330 skjer via både cellesyklus arrest og induksjon av apoptose.
RCC celler 786-O og ACHN ble dyrket til -60% konfluens og behandlet med KPT-330 ved angitte doser i 24 timer og immunoblotting ble utført med spesifikke antistoffer (A). RCC og NHK-celler ble dyrket til ~ 30% konfluens, ble behandlet med KPT-330 ved angitte doser i 72 timer, og MTT-analyser ble utført (B). Cellesyklusanalyse (C) og Annexin V-analyse (D) ble utført etter 24 timer inkubasjon med DMSO (forts) eller KPT-330 (1 uM). * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feil linjer indikerer standardavvik.
XPO1 inhibering begrenset p21 til kjernen i RCC-celler, men ikke i en normal nyre epitelcellelinje
Økt cytosol-p21, som er blitt vist å hemme apoptose [5] og således muligens hindre tumor overvåking, er en indikator på dårlig prognose for RCC [9]. Av denne grunn, og i lys av den kjente egenskap av atom p21 i dempning av cellesyklusprogresjon, spurte vi om atom p21 er nødvendig for KPT-330 for å forårsake de observerte virkninger i RCC-celler. Når visualisert ved immunofluorescens cytochemistry, ble p21 vist å være i stor grad begrenset til kjernen etter KPT-330 behandling i begge RCC-cellelinjer (Fig. 2A). I samsvar med cellesyklus data, KPT-330 ikke klarte å endre lokalisering av p21 i NHK celler (Fig 2A.); Dette kan forklare den svikt av KPT-330 for å redusere overlevelse i de normale celler, og er relevant for fremtidig klinisk translasjon av disse funnene (
vide infra
). Interessant, ble p21 nivåer utvidet med KPT-330 i RCC celler (Fig. 2B), noe som tyder på at p21 var ikke bare begrenset i kjernen av KPT-330, men viste også økte nivåer, sannsynligvis mediere observert G2 /M cellesyklus arrest ( se fig. 1C og [16]).
RCC-celler 786-O og ACHN ble dyrket til -60% konfluens og behandlet med KPT-330 ved angitte doser i 24 timer. Immunofluorescens ble utført ved konfokal mikroskopi (20x) og antallet celler i hvilke p21 var hovedsakelig i kjernen ble tellet i tre tilfeldig valgte felt og dividert med det totale celletallet (A). Immunoblotting ble utført med spesifikke antistoffer (B). Blå, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feilfelt angir standardavvik.
siRNA hemming av XPO1 økt atom p21 i RCC celler
For å demonstrere spesifisitet KPT-330 på nivåer og lokalisering av p21, og at disse effektene er på grunn av XPO1 hemming, RCC (786-O og ACHN) celler ble transfektert med enten et siRNA spesifikk for XPO1 eller en kryptert sekvensstyring siRNA. Begge cellelinjer demonstrert reduserte nivåer av XPO1 ledsaget av en økning i den totale p21 ved XPO1 knockdown (fig. 3A), med immunofluorescens farging som viser at p21 er i stor grad begrenset til kjernen under disse betingelser (Fig. 3B), tilsvarende det som ble observert med KPT-330 (se fig. 2B). Således er virkningen av KPT-330 på p21 skyldtes spesifikt til XPO1 dempning.
RCC (786-O og ACHN) celler ble dyrket til -60% konfluens, og ble transfektert med eggesekvensstyring eller XPO1- spesifikk siRNA i 48 timer. Immunoblotting ble utført med spesifikke antistoffer (A) og immunofluorescens ble utført ved konfokal mikroskopi (20x) (B). Antall celler i hvilken p21 var hovedsakelig i kjernen ble tellet i tre tilfeldig valgte felt og delt på det totale celleantall. Blå, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feilfelt angir standardavvik.
Oralt administrert KPT-330 svekket tumorvekst, assosiert med økt atom p21
For å begynne å oversette dette arbeidet til sengen, effekten av KPT- 330 i en RCC mus xenograft modell ble evaluert. Når subkutant-implanterte tumorer ble håndgripelig, ble musene behandlet med sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 lav (7,5 mg /kg) og høy (15 mg /kg) doser, en kombinasjon av sunitinib og KPT-330 lav dose, eller bærer (som var den samme for KPT-330 og sunitinib). Sunitinib ble benyttet både som en narkotikakontroll og som en potensiell kombinasjonsbehandling partner siden sunitinib er førstelinjebehandling for RCC [17]. Både KPT-330 høy dose og kombinasjonen av sunitinib og KPT-330 lav dose hemmet RCC vekst betydelig i forhold til kjøretøyet (fig. 4), noe som tyder på at KPT-330 kan anvendes som eneste terapi og er også fordelaktig når det kombineres med dagens første linjen terapeutisk, sunitinib.
5 × 10
5 ACHN celler ble injisert subkutant til flanke regionen. Når tumorene var håndgripelig, ble musene behandlet med bærer, sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 lav (7,5 mg /kg), KPT-330 høy (15 mg /kg) eller sunitinib og KPT-330 lav for 25 dager som er omtalt i materialer og metoder. Tumorveksten ble overvåket ved målepunktet (tumorvolum = lengde x bredde x bredde /2), og tumorvekstraten (tumorvolum ved dag X /tumorvolum på dag 0) ble beregnet. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feilfelt indikere standard feil.
For å validere på target effekter av KPT-330, ble xenograft vev behandlet etter offer for immunhistokjemi analyse. Som sammenlignet med kontroll xenograft vev, KPT-330 (høy dose) behandlede dyr viste en økning i p21 nukleær farging, en økning i apoptose markør Apoptag farging, og en reduksjon i farging av spredning Ki67 (fig. 5), alt i samsvar med våre in vitro observasjoner. Disse funnene tyder på at KPT-330 demper RCC vekst gjennom hemming av cellevekst og induksjon av apoptose i RCC xenograft modell, og at regulering av p21 lokalisering spiller en stor rolle i effekten av KPT-330.
Etter avslutningen av eksperimentet beskrevet i fig. 6, xenograft vev ble samlet og behandlet for immunhistokjemi med de angitte antistoffer som beskrevet i Materialer og Metoder. Bar = 20 mikrometer.
KPT-330 resistente celler var følsomme for FDA godkjente terapi for RCC
På grunn av den hyppige forekomsten av kjemoterapi motstand i RCC pasienter behandlet med målrettet terapi, det er avgjørende for å gi alternative terapeutiske muligheter for de som kan utvikle resistens mot XPO1 hemming med strategien foreslås i denne studien. For å evaluere den mekanismen som RCC celler blir resistente mot KPT-330, fokuserte vi på VHL-mut 786-O-celler, siden VHL mutasjon er sett hos omtrent 90% av RCC pasienter [18]. 786-O-cellene ble først inkubert med en lav konsentrasjon (50 nM) av KPT-330, og seriemessig overført til media med økende konsentrasjoner av KPT-330 i løpet av en periode på seks måneder. Celler som begynte å vokse på en mikrometer KPT-330 ble definert som «KPT-330 motstandsdyktig»; fra foreldre 786-O-celler (P), ble totalt to separate resistente cellelinjer etablert (R1 og R2). Som definert, R1 og R2 celler var mindre følsomme overfor KPT-330 enn i P-celler når behandlet med forskjellige doser av KPT-330 (Fig. 6A) uten noen dempning av XPO1 (fig. 6B). Interessant, lokalisering av p21 var upåvirket i KPT-330 resistente celler (fig. 6C), noe som ytterligere støtter viktigheten av dette proteinet i KPT-330 signalering.
KPT-330 resistente 786-O (R1 og R2) celler ble etablert som beskrevet i teksten, og disse så vel som foreldre (P) celler ble behandlet med KPT-330 ved de angitte doser i 72 timer, hvoretter MTT-analyser ble utført (a). R1, R2, og P-celler ble behandlet med KPT-330 i 24 timer og deretter immunblotting og immunfluorescens ble utført. Antall celler i hvilken p21 ble hovedsakelig i kjernen ble talt i tre tilfeldig valgte felt og delt på det totale celletallet (blå, nucleus (DAPI); Green, p21) (B). * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feilfelt angir standardavvik.
For å vurdere potensialet for rednings terapi, overlevelse av resistente celler ble undersøkt med konvensjonelle målrettede midler. Når KPT-330 resistente celler ble behandlet med hver av de for tiden godkjent for RCC-kinase-inhibitorer (sunitinib og sorafenib) og mTOR inhibitorer (everolimus og temsirolimus), R1 og R2 cellene beholdt følsomhet på samme måte som P-celler (fig. 7), noe som tyder på at konvensjonelle målrettede behandlingsformer kan benyttes som andrelinjebehandling hvis pasienten utvikler resistens mot KPT-330.
KPT-330 resistent 786-O (R1 og R2) og foreldre (p) celler ble behandlet med KPT-330 ved de angitte doser i 72 timer, hvoretter MTT-analyser ble utført. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Feilfelt angir standardavvik.
Diskusjoner
Nye behandlingsformer for avansert RCC har blitt godkjent av FDA nesten hvert år siden advent av sorafenib, den første målrettet RCC terapeutisk. Men selv med disse legemidlene, utvidet PFS for de med metastatisk RCC er bare ett til to år på grunn av utvikling av medikamentresistens; Situasjonen for pasienter med langt fremskreden sykdom er gjort mer sturen ved det faktum at det er, men et begrenset repertoar av tilgjengelige terapeutiske mål (for tiden bare kinaser og mTOR) [4]. Således er det viktig å identifisere nye mål for RCC som er forskjellige fra de som i dag anvendes. I lys av tidligere studier som viser at XPO1 inhibitorer har en terapeutisk effekt i RCC in vitro og in vivo [13], i denne studien evaluerte vi effekten og mekanismen for KPT-330, den XPO1 inhibitor som for tiden fase 1-forsøk, for å bestemme potensiell klinisk bruk av KPT-330 for avansert RCC. Faktisk utfall av flere pågående fase I /II kliniske studier med KPT-330 (selinexor, clinicaltrials.gov) tyder på at oral KPT-330 har klart anti-kreft aktivitet med akseptabel toleranse på tvers av flere solide og hematologiske maligniteter, men det er snaut data på denne agent i RCC og ingen mekanisk informasjon.
cytosol-p21 er en indikator på dårlig prognose i RCC, og det kan tenkes å bli brukt som en markør i andre kreftformer, slik som brystkreft, som også karakteriseres ved overuttrykt cytosolisk p21 [10]. Både når inkubert
in vitro
i flere RCC-cellelinjer, og når administrert oralt
in vivo
i et humant mus xenograft RCC, KPT-330 økte atom p21 gjennom spesifikk hemming av XPO1, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av RCC cellelevedyktighet gjennom cellesyklus-stans (og hemming av proliferasjon in vivo) og induksjon av apoptose. Overraskende nok var det minimal effekt av KPT-330 på normal renal tubulær epitelial celle-levedyktighet eller p21 lokalisering i disse cellene, et funn som understøtter sannsynligheten for minimale negative effekter på nyre (samt andre organ) funksjon i pasienter som gis denne legemiddel. Når du er i kjernen, p21 arrestasjoner cellesyklus ved å binde cyclin /CKD komplekser i alle faser, mens når du er i cytosol, hemmer p21 apoptose ved å samhandle med pro-apoptotiske proteiner inkludert pro-caspase 3 og ASK [5]. Således våre funn tyder på at atom p21 er involvert i mekanismen som KPT-330 påvirke RCC-celler, en hypotese understøttes av det faktum at NHK celler hvis p21 lokalisering ble ikke påvirket av KPT-330 var ikke like følsom for KPT-330 som RCC celler og som KPT-330 resistente celler mislyktes i å lokalisere p21 til kjernen.
i mange kreftformer, er atom eksport av proteiner forsterket i løpet av sykdomsprogresjon og kan faktisk bidra til prosessen med legemiddelresistens [19]. For eksempel, er høyere nivåer av ekspresjon XPO1 positivt korrelert med karakter progresjon, så vel som økt forekomst sprednings i glioma [20], bukspyttkjertelkreft [21], og livmorhalskreft [22]. Basert på våre data, er det sannsynlig at kjernefysisk eksport av p21 ved XPO1 er mer uttalt i RCC enn i NHK celler som cytosolic p21 i svulstene er økt, spesielt i de RCC tilfeller med dårligere [9] prognoser. Denne observasjonen (mindre effekter ved hemming XPO1 i normale celler enn sine kreftceller) er i samsvar med andre publiserte studier med SINE viser at SINE target syke celler skåner normale celler [12]. Videre våre funn at KPT-330 resistente celler beholdt sensitiviteten til alle gjeldende FDA godkjent målrettet terapi for avansert RCC (sunitinib, sorafenib, everolimus, og temsirolimus) antyder at pasienter som ikke KPT-330 eller for hvem motstand utvikler, kan fortsatt svare på disse eldre legemidler [4].
Konklusjoner
dataene som vises her tyder på at XPO1 hemming av KPT-330 demper RCC levedyktighet gjennom cellesyklus arrest samt induksjon av apoptose, og at økt kjernekraft p21 ved XPO1 hemming spiller en stor rolle i effekten av KPT-330 i RCC. Vi viser at KPT-330 forsterker antitumoraktivitet av sunitinib, noe som resulterer i fullstendig inhibering av RCC tumorvekst in vivo med denne kombinasjonen. Videre våre data støtter sannsynligheten for at pasienter motstandsdyktig til KPT-330 vil svare på eldre målrettede behandlingsformer. Gitt at avansert RCC har en dårlig prognose selv med målrettede behandlingsformer, introduserer vårt arbeid KPT-330 som en roman terapeutisk for RCC, som raskt kan flyttes inn i klinisk riket for å evaluere effekten av seg selv eller kombinasjonsbehandling med andre RCC therapeutics.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
KPT-330 indusert apoptose i RCC celler. RCC celler 786-O og ACHN ble dyrket til -60% samløpet. En Annexin V-analyse ble utført etter 24 timer inkubasjon med DMSO eller KPT-330 (1 uM) som beskrevet i Materialer og Metoder. Den gating vises
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113867.s001 plakater (PPTX)
