Abstract
Som pentaspan stamcelle markør CD133 ble vist å binde kolesterol og å lokalisere i plasma membran fremspring, undersøkte vi en mulig funksjon for CD133 i endocytose. Ved hjelp av CD133 siRNA knockdown strategi og ikke-differensierte humane tykktarmskreft Caco-2-celler som konstitutivt over-uttrykt CD133, gir vi for første gang direkte bevis for en rolle av CD133 i den intracellulære akkumuleringen av fluorescensmerkede ekstracellulære forbindelser. Vurdert ved AC133 monoklonalt antistoff, ble CD133 knockdown vist seg å forbedre Alexa488-transferrin (Tf) opptak i Caco-2 celler, men hadde ingen innvirkning på FITC-dekstran eller FITC-kolera-toksin. Fravær av effekten av CD133 knockdown på Tf resirkulering etablert en rolle for CD133 i begrenser Tf endocytose snarere enn å stimulere Tf eksocytose. Bruk av tidligere identifiserte hemmere av kjente endocytiske trasé og den positive virkningen av CD133 knockdown på cellulært opptak av clathrin-endocytose syntetisk lipid nanokapsler støttes som CD133 innvirkning på endocytose var først og fremst tilskrives clathrin veien. Også kolesterol ekstraksjon med metyl-β-cyklodekstrin opp regulert Tf opptak ved større intensitet i CD133
høy situasjon enn i den CD133
lav situasjon, således som tyder på en rolle for kolesterol i den hemmende effekten av CD133 på endocytose. Interessant, cellen behandling med AC133 antistoff nedregulert Tf opptak, og dermed demonstrerer at direkte ekstracellulære binding til CD133 kan påvirke endocytose. Videre flowcytometri og konfokalmikroskopi etablert at nedregulering av CD133 forbedret tilgjengelighet til TfR fra det ekstracellulære rom, og gir en mekanisme som CD133 hemmet Tf opptak. Som Tf er involvert i å levere jern til cellen, ble effekten av jerntilskudd og deprivasjon på CD133 /AC133 uttrykk undersøkt. Begge viste en doseavhengig nedregule her diskuterte til lys av transkripsjonelle og post-transciptional effekter. Samlet utgjør disse data utvide vår kunnskap om funksjonen til CD133 og understreker interessen for videre utforsking av CD133-Tf-jern nettverk
Citation. Bourseau-Guilmain E, GRIVEAU A, Benoit JP, Garcion E ( 2011) Viktigheten av stamcelle Marker Prominin-1 /CD133 i opptaket av transferrin og i Iron Metabolism i human tykktarmskreft Caco-2 celler. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10,1371 /journal.pone.0025515
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 22 mars 2011; Godkjent: 07.09.2011; Publisert: 26.09.2011
Copyright: © 2011 Bourseau-Guilmain et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av «Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE», den «Axe Cellules Souches et Kreft» på «Cancéropôle Grand-Ouest» og med «La Ligue Contre le Cancer» gjennom en «Equipe Labellisée 2007» stipend . Erika Bourseau var opprinnelig en stipendiat med «Conseil Général de Maine-et-Loire» og deretter en stipendiat med «Comité Départemental de Maine-et-Loire de La Ligue Contre le Cancer». Audrey GRIVEAU var en stipendiat med «Conseil Général de Maine-et-Loire». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Etter bruk av nye monoklonale antistoffer dannet mot neuroepithelial og hematopoietiske stamceller, CD133, også kjent hos mennesker og gnagere som Prominin-1, ble først isolert og klonet i 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 er en fem-domene transmembranprotein, som består av et N-terminale ekstracellulære hale, to små cytoplasmatiske løkker, to store ekstracellulære sløyfer som inneholder syv potensielle glykosyleringsseter og en kort C-terminale intracellulære hale som kan bli alternativt spleiset [4] eller fosforylert [5].
til tross for konstant forskningsinnsats, forblir den biologiske funksjon av CD133 stort sett ukjent. Blant beryktede fenotyper, har det vist seg at en avkortet CD133, som ikke transporteres til cellemembran, fører til human retinal degenerasjon [6]. Understreker dette viktig observasjon, analyse av en generasjon av CD133-mangelfull mus viste at mens uttrykte veldig tidlig under retinal utvikling, CD133 fungerte som en viktig regulator av disk morphogenesis og at tap av CD133 forårsaket fotoreseptoren degenerasjon og blindhet [7]. I tillegg AC133, en glykosylert epitop av CD133-protein innledningsvis forbundet med embryonale stamceller [8] og en rekke av somatiske stamceller, ble omfattende beskrevet som en antatt kreft stamcelle markør i blod, hjerne, tykktarm, prostata, lunge, bryst , lever, og hudkreft [9], [10]. Andre undersøkelser viser at CD133 er knyttet til cellemetabolismen som en glukose responsiv genet i myotubes [11], samt gi bevis for bioenergetisk spenning [12] og av ikke-eksponering for høye oksygentrykk i gliomer (Bourseau-Guilmain et al. , innsendt).
på subcellulære nivå, er CD133 fortrinnsvis lokalisert i plasmamembranfremspring og microvilli [13]. Derfra kan CD133 binde seg til kolesterol [14] og samhandle med gangliosider [15]. Som membranfremspring og mikrovilli muliggjøre forlengelse av membranens overflate for å øke celle eksponering til det ekstracellulære rom, disse observasjonene gi viktige ledetråder til identifisering av den molekylære rollen som CD133, særlig ved å betrakte cellulære utveksling med mikromiljøet. Faktisk CD133 ble funnet i membranblærer forskjellige fra exosomes som ble utgitt fra epitelceller i løpet av differensiering [16].
Parallelt med disse utenfor-in-signaler, kolesterol og sphingolipids skille i lipid flåte membranmikroområder innblandet i innsiden utsjekking signalering og endocytose [17], [18]. Tatt i betraktning den stramme forholdet mellom CD133 og kolesterol, pluss det er mulig kobling til sphingolipids og eksponering for det ekstracellulære rom, hypotese vi at CD133 er involvert i endocytose: en grunnleggende prosess der ekstracellulære forbindelser internalisert og distribuert til intracellulære
i den foreliggende undersøkelse, ved hjelp av RNA-interferens strategi og udifferensierte human tykktarmskreft Caco-2-celler som konstitutivt over-uttrykt CD133 /AC133, gir vi for første gang bevis for en rolle av CD133 i den intracellulære akkumulering av ekstracellulære forbindelsene , særlig eksemplifisert ved transferrin (Tf). I tillegg til data som etablerer en rolle for CD133 i endocytose, vi viser også at CD133 i seg selv er regulert av jern, dermed støtter eksistensen av en Tf-CD133-jern-nettverk. Disse nye observasjonene er diskutert i lys av CD133 mønster av uttrykk og dagens kunnskap på feltet.
Materialer og metoder
Cell kultur
Undifferentiated human colon carcinoma Caco- 2-celler (American Type Culture Collection: HTB-37 ™) ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Lonza, Levallois-Perret, Frankrike) inneholdende 4,5 g /L-glukose og L-glutamin. Mediet ble tilsatt med 10% føtalt bovint serum (FBS; Lonza, Verviers, Belgia), 1% antibiotika (10 enheter /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin, 25 ug /ml amfotericin B; Sigma-Aldrich, Saint- Louis, USA, MO) og 1% av ikke-essensielle aminosyrer (NEAA; Lonza, Verviers, Belgia). Når cellene nådde 80% samløpet, de ble skilt i 0,5% svine-trypsin og 0,2 g /ml EDTA (Lonza, Verviers, Belgia) før re-plating på ubestrøket plastflasker på 15 × 10
3 celler /cm
2. Halvparten av mediet ble erstattet med friskt medium hver to dager.
siRNA knockdown av CD133
Caco-2-celler ble sådd ut i seks-brønns plater med 2,3 x 10
5 celler pr brønn i 2 ml av ovennevnte medium i 24 timer. Mediet ble fjernet og cellene ble transfektert med 30 nM av RNA oligonukleotid-duplekser (Sigma-Aldrich) ved hjelp av N-TER-reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma-Aldrich). N-TER /siRNA kompleksene ble deretter inkubert i Caco-2-medium i 48 timer ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO
2. siRNA ble så fjernet og erstattet med friskt medium i 24 timer. En sekvens krafse ble anvendt som negativ kontroll: 5′-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 «. Sekvensen brukes til å utføre målrettet RNA interferens hemming av CD133 var 5»-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 «.
AC133 immunolabeling
Caco-2 celler eksponert for siRNA ble samlet og dissosiert ved hjelp Versene (Lonza) . Celler ble inkubert med 5 pg /mL AC133-antistoff (Miltenyi Biotech, Paris, Frankrike) eller IgG1κ isotypekontroll (BD-Biosciences, Le Pont-de-Claix, Frankrike) i 1 time ved 4 ° C i PBS inneholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid. Cellene ble deretter vasket tre ganger i PBS inneholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid, og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med FITC-konjugert geit anti-mus IgG F (ab «) 2-fragment polyklonalt antistoff (Dakocytomation, Trappes, Frankrike) ved 20 ug /ml i PBS inneholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid. Etter tre vaskinger til i PBS som inneholdt 5% FBS og 0,02% natriumazid, ble cellene resuspendert i PBS inneholdende 2% formaldehyd og 0,02% natriumazid.
Strømningscytometri
A BD FACSCalibur ™ fluorescerende-aktivert strømningscytometer og programvaren BD Cellquest ™ (BD-biovitenskap) ble brukt for flowcytometri oppkjøpet. Analysen ble utført ved hjelp av WinMDI 2.9 programvare (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA).
Syntese av Nilen rød-merket lipid nanokapsler (NR-LNC)
50 nm Nile røde ( NR) -merket lipid nanokapsler (LNC) (NR-LNC) som innlemmet den fluorescerende forbindelse NR ble fremstilt som tidligere beskrevet [19] ved anvendelse av en faseinversjon prosess som følger dannelsen av en olje /vann-mikroemulsjon inneholdende triglycerider (Labrafac® WL 1349, Gattefossé, Saint-Priest, Frankrike), et ikke ionisk hydrofil surfaktant (Solutol® HS 15, Gmbh, Ludwigshafen, Tyskland) og lecitin (Lipoïd® S75-3, Gmbh). NR ble oppløst i aceton ved 1% (vekt /vekt), og den resulterende NR oppløsning ble innlemmet i Labrafac® på 1:10 (w /w). Således 846 mg Solutol®, 75 mg Lipoïd®, 1029 mg Labrafac® inneholdende NR, 89 mg NaCl og 2975 mg vann ble blandet og oppvarmet under magnetisk omrøring opp til 85 ° C. Tre sykluser av progressiv oppvarming og avkjøling i mellom 85 ° C og 60 ° C ble deretter realisert. De ble til slutt etterfulgt av en irreversibel sjokk indusert ved fortynning med 12,5 ml av 0 ° C avionisert vann tilsatt til den inverse fasesone. Størrelseseksklusjonskromatografi og høytrykks-væskekromatografi (HPLC) analyser viste en fullstendig innkapsling og retensjon av NR som tidligere er observert [19]. LNC ble analysert for deres størrelsesfordeling ved anvendelse av en Malvern Zetasizer® Nano-serien DTS-1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).
Internalisering av transferrin (Tf), dekstran (Dx), kolera toksin B subenhet (CTB ) og lipid nanokapsler (LNC)
medium fra transfekterte celler ble fjernet og erstattet med DMEM supplert med 1% av serumfritt medium N1 (Sigma Aldrich) i 1 time. De tre følgende forbindelser, Tf-Alexa 488 ved 0,5 og 5 ug /ml (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike), Dx-FITC ved 0,5 og 5 mg /ml (Sigma Aldrich) og CTB-FITC ved 1 og 10 ug /mL (Invitrogen), eller i stedet, NR-LNC ved 1/1000 fortynning fra første suspensjon og dermed svarer til en 100 ug /ml konsentrasjon, ble deretter tilsatt til mediet i 1 time. Cellene ble deretter dissosiert ved hjelp Versene (Lonza). For å muliggjøre bestemmelse av fraksjonen av merkede molekyler eller partikler som ble effektivt internalisert i cellene, ble ekstracellulær fluorescens trykt ved anvendelse av 0,4% trypanblått (Sigma Aldrich). Cellene ble deretter vasket i PBS og resuspendert i PBS inneholdende 2% formaldehyd og 0,02% natriumazid. Internalisering av fluorescensmerkede Tf, Dx, CTB og LNC ble overvåket av flowcytometri.
Analyse av utgivelsen av Tf fra Caco-2 celler etter intern
Kontroll og CD133-spesifikke siRNA ble brukt å generere CD133
høye og CD133
lave transfekterte Caco-2 celler, henholdsvis. Cellene ble deretter inkubert med Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO
2 før det ekstracellulære media ble fjernet, vasket og erstattet med friskt medium uten Tf-Alexa 488. Etter ytterligere inkubasjon ved 37 ° C /5% CO
2 i 1 time, 2 timer og 3 timer, den gjenværende intracellulære Tf-Alexa 488 fluorescens, som representerer mengden av Tf-Alexa 488 som ikke ble resirkulert til det ekstracellulære rom, ble målt ved semi- kvantitativ strømningscytometri, som beskrevet ovenfor.
Cell behandling med kjemiske inhibitorer av endocytose og cellulært opptak av Tf
tidligere identifiserte kjemiske inhibitorer av kjente endocytiske banene ble anvendt som tidligere beskrevet [19], [20 ], [21]. I korthet ble transfektert Caco-2-celler ble forbehandlet med inhibitorer i 1 time ved 37 ° C i N1 medium. Klorpromazin (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) ble anvendt for å inhibere clathrin-mediert transport [22], mens filipin (1 ug /l; Sigma-Aldrich) og dimetylamilorid (DMA, 10 iM; Sigma-Aldrich) ble anvendt for å hemme caveolae-avhengige endocytose [23] og macropinocytosis [24], respektivt. Kolesterol uttømming ble oppnådd ved en 2 timers forbehandling med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD, 10 mM, Sigma-Aldrich) i nærvær av lovastatin (1 pg /ml, Sigma-Aldrich) [25], [26]. Deretter ble det cellulære opptak av 5 mikrogram /ml Tf-Alexa 488 overvåket ved strømningscytometri-analyse som beskrevet ovenfor. For kolesterol-hemming, ble 1 mikrogram /ml lovastatin også opprettholdes i mediet i løpet av behandlingen med Tf-Alexa 488.
Analysis of Tf opptak av Caco-2-celler etter behandling med AC133 antistoffet
Caco-2-celler ble sådd ut på 2,3 x 10
5 i 24-brønners plater i 400 ul serumholdig medium. Etter en 24 timers innledende inkubering ved 37 ° C /5% CO
2 den første medium ble erstattet med N 1 serumfritt medium før inkubering med enten 0, 5, eller 10 ug /ml av AC133 antistoff eller av isotype kontroll IgG1κ . Tf-Alexa 488 ble deretter tilsatt ved 5 ug /ml og inkubert ved 37 ° C /5% CO
2 i 1 time for å studere virkningen av immunoglobulin-behandling på Tf-Alexa 488 opptak. Tf-Alexa 488 opptaket ble kvantifisert ved strømningscytometri, som beskrevet ovenfor.
Antistoff erkjennelse av tf-reseptoren på overflaten av Caco-2-celle avhengig av nivået av CD133 ekspresjon
Caco-2-cellene utsatt for CD133 eller kontroll siRNA ble samlet og dissosiert ved hjelp Versene (Lonza). Celler ble inkubert med 5 pg /ml CD71 monoklonalt muse-antistoff som gjenkjenner Tf reseptor (TfR eller CD71 antigen) (klon M-A712, BD-Biosciences) eller med 5 ug /ml IgG2a, κ isotypekontroll (BD-Biosciences) til fortsette for immunolabeling og flowcytometri som beskrevet ovenfor for AC133 celleoverflaten anerkjennelse.
Immunocytochemisty kombinert med konfokal laser scanning mikroskopi for identifisering av AC133, CD71 og clathrin tung kjede innen Caco-2 celler
Caco-2-celler ble sådd ut ved 4 x 10
3-celler per brønn i åtte godt Lab-Tek kammers objektglass (Nunc, Roskilde, Danmark) i 300 ul DMEM inneholdende 10% FCS i 24 timer. De ble deretter utsatt for CD133 eller kontrollere siRNA som ovenfor beskrevet før for å gå videre til immunocytokjemi. Cellene ble deretter vasket med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4) i 20 minutter ved 4 ° C. Etter vaskinger i PBS ble cellene eksponert i 60 minutter ved romtemperatur til en blokkerende oppløsning av PBS inneholdende 4% av bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) og 10% normalt geiteserum (Sigma-Aldrich). Primære monoklonale antistoffer mot CD133 (IgG1κ, Miltenyi Biotech), TfR eller CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) eller clathrin tung kjede (CHC) (IgG1, BD-Biosciences) ble inkubert ved 5 ug /ml i PBS /BSA 4% for over natten ved 4 ° C. Legg merke til at for CHC intracellulær immunolabeling, ble Triton X-100 ble tilsatt ved 0,1% i løpet av den blokkerende fremgangsmåte for cellegjennomtrengning. Etter vaskinger ble et sekundært heste anti-muse-biotin-konjugert antistoff (Vector, Burlingame, CA) brukt ved 1/100 i PBS /BSA 4% i 1 time ved romtemperatur. Etter flere vasker, streptavidin Fluo Probe Alexa 488 (Interchim, Montluçon, Frankrike), fortynnet 1/700, ble brukt. Cellene ble til slutt vasket og montert under dekkglass i fluorescerende monteringsmedium (Dakocytomation). Konfokalmikroskop bilder ble oppnådd ved hjelp av et Olympus Fluoview ™ FU 300 konfokal laser scanning mikroskopi bildesystem (Paris, Frankrike).
Iron behandlinger
Caco-2 celler ble belagt i seks-brønns plater med 2,3 x 10
5 celler per brønn i 2 ml i 24 timer. Før startet jernbehandling ble FBS inneholdende medium erstattet med serumfritt medium N1 i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (50-800 um) av treverdig nitriltrieddiksyre (Fe-NTA) i 72 timer ved 37 ° C /5% CO
2, som angitt. Fe-NTA (molarforhold 01:04) ble extemporaneously utarbeidet som en 20 mm lager fra NTA og jernklorid heksahydrat (Sigma-Aldrich). Celler ble alternativt behandlet med FeSO
4 (Sigma-Aldrich), en annen jern giver [27], [28], ved enten 150 eller 300 uM i 24 timer.
Jern savn og behandling med hypoksi- etterlignende midler
å følge en lignende fremgangsmåte som kultur før jernbehandling ble cellene i stedet behandlet i 24 timer med en jern-chelator, også kjent som en hypoksi-mimetiske middel, Desferrioksamin (DFO, Sigma-Aldrich) ved 100 og 150 pM [29], [30]. Alternativt, de ble behandlet i 24 timer med en hypoksi-mimetiske middel som virker uavhengig av jern deprivasjon, Kobolt-klorid (CoCl
2, Sigma-Aldrich) ved 100 og 150 uM [31].
Database , bioinformatikkdataene
for å søke etter antatte jernreagerende element (IRE) sekvenser i den 3 «og 5» utranslatert region (UTR) av human CD133 mRNA sekvensene brukt i denne studien (blant hvilke
Homo sapiens
prominin en avskrift variant 2, NM_001145847.1) ble hentet fra NCBI GenBank. Alle sekvenssammenstillinger ble gjort ved hjelp av ClustalW dataprogram fra EMBL europeiske Bioinformatikk Institute (Heidelberg, Tyskland). De okser (søker etter IRES) web server (https://ccbg.imppc.org/sires/) ble også brukt for prediksjon av jern responsive elementer i RNA [32].
Statistisk analyse
XLSTAT 2006 Version 2006,3 (Addinsoft Paris, Frankrike) ble anvendt for dataanalyser. Den statistiske signifikans av hvert eksperiment ble bestemt ved en Dunnetts test. Testene ble ansett som signifikant med p-verdier. 0,05
Resultater
Effekt av spesifikke siRNA-mediert knockdown av CD133 på intracellulær akkumulering av Tf, Dx og CTB i ikke-differensiert Caco -2 celler
for å bestemme den potensielle påvirkning av CD133 på intracellulær akkumulering av ekstracellulære forbindelser, ikke-differensiert human colon carcinoma Caco-2 celler som naturlig uttrykker høye nivåer av CD133, ble brukt. Enten ved hjelp av siRNA som ikke fører til transcriptional nedregulering (kontroll siRNA) eller siRNA som ikke nedregulere målrettet CD133 mRNA og protein uttrykk (CD133 siRNA), to situasjoner ble analysert: Caco-2 celler som uttrykker høye nivåer av CD133, og Caco -2-celler som uttrykker lave nivåer av CD133. Figur 1A viser at behandling av Caco-2-celler med 30 nM av CD133 siRNA effektivt førte til en reduksjon på 52 ± 11% i CD133 proteinekspresjon, analysert ved hjelp av strømningscytometri immunofluorescens (AC133 antistoff) sammenlignet med kontroll siRNA. Å analysere Caco-2 celle pinocytic evne i CD133
høye og CD133
lave situasjoner, ble den intracellulære akkumuleringen av eksogene markører for pinocytic trasé deretter overvåket. Selv om alternative internalise veier har blitt beskrevet avhengig av celletyper og differensiering status (for oversikt se [33]), Tf-Alexa 488, Dx-FITC og CTB-FITC ble brukt som prototype markører for reseptor endocytose [34], væskefase endocytose [24], [35] og caveolae avhengig endocytose [23], [36], respektivt. Flowcytometri måling av intracellulære fluorescens etter 1 time eksponering av CD133
høye Caco-2-celler til enten 0,5 eller 5 mg /ml Dx-FITC, 1 eller 10 mg /ml CTB-FITC og 0,5 eller 5 pg /mL Tf -Alexa 488 mellom 100% opptak som skal måles sammenlignet med basal GEOMEAN fluorescerende intensitet av bærer alene behandlede celler som representerer 0% opptak. Selv CD133 knockdown hadde ingen innvirkning på intracellulær akkumulering av Dx-FITC (figur 1B) eller på CTB-FITC (figur 1C), cellulært opptak av Tf-Alexa 488 ble betydelig forsterket i CD133
lav-Caco-2 celler uansett konsentrasjon testet (figur 1D). således etablert Disse data for den første gang at CD133 fungere som en modulator av intracellulær akkumulering av eksogene forbindelser.
A) Immunofluorescens forbundet strømningscytometrisk analyse av CD133 ekspresjon på ikke-differensierte Caco-2-celler ble behandlet med 30 nM av kontroll eller CD133-spesifikke siRNA. Resultatene er uttrykt som en prosentandel av kontrollbehandling, som representerer GEOMEAN fluorescens intensitet som oppnås etter AC133 farging av celler behandlet med irrelevant siRNA (CD133
høye Caco-2-celler); oppmerksom på den effektive nedregulering av CD133 når CD133-spesifikke siRNA (CD133
lave Caco-2 celler) ble brukt. B-D) Strømningscytometrisk analyse av intracellulært opptak av Dx-FITC (B), CTB-FITC (C) og Tf-Alexa 488 (D) i løpet av CD133
høye og CD133
lave Caco-2 celler etter 1 timers inkubering ved 37 ° C /5% CO
2. Resultatene er uttrykt som prosent av kontroll, således som representerer de GEOMEAN fluorescensintensitet nivåene erholdt for celler behandlet med bærer alene. Data representert gjennomsnitt ± standardavvik oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Dunnetts test: ** p 0,01, *** p 0,001
Effekt av siRNA mediert knockdown av CD133 på Tf exocytose
I lys av det faktum at CD133 viste seg å være hemmer cellulært opptak av Tf mens du har noen innvirkning på Dx og CTB, vi videre fokusert på forholdet mellom CD133 uttrykk og Tf akkumulering. Den potensielle effekten av siRNA mediert knockdown av CD133 på Tf-Alexa 488 eksocytose ble derfor undersøkt. For dette formål, CD133
høy og CD133
lave ikke-differensiert Caco-2-celler ble inkubert med Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO
2 før det ekstracellulære mediet fjernet , vasket og erstattet med friskt medium uten Tf-Alexa 488. etter ytterligere inkubering i 1, 2 og 3 timer ved 37 ° C /5% CO
2 mengden av Tf-Alexa 488 som ikke ble resirkulert til det ekstracellulære rommet ble målt ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. etablerte data presentert i figur 2 som intracellulære nivåer av Tf-Alexa 488 redusert med inkubasjonstid. Etter 1 time med inkubering mer enn 80% av den internalisert Tf-Alexa 488 forble innenfor cellene i både CD133
høy og CD133
lav uttrykkende celler, mens etter en 3 timers inkubering, 54 ± 9% og 43 ± 4 % av internalisert Tf-Alexa 488 forble innenfor CD133
høye og CD133
lave uttrykker celler, henholdsvis. Imidlertid hele tiden studert, ble ingen signifikant forskjell observeres avhengig av CD133-ekspresjonsnivåer (figur 2). Disse observasjonene understreket at selv om Tf resirkulering skjedde i begge CD133
høy og CD133
lav ikke-differensiert Caco-2 celler, kortsiktige forskjeller i intracellulær Tf opphopning skyldes i hovedsak til virkningen av CD133 på endocytose mekanismer fremfor eksocytose .
CD133
høy (kontroll siRNA) og CD133
lav (CD133 siRNA) ikke-differensiert Caco-2 celler ble eksponert for Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO
2 før det ekstracellulære mediet ble fjernet, ble vasket og erstattet med friskt medium uten Tf-Alexa 488. mengder av Tf-Alexa 488 som ikke ble resirkulert til det ekstracellulære rommet målt ved flowcytometrisk analyse etter ytterligere celle inkubering ved 37 ° C /5% CO
2 i 1 til 3 timer. Data er uttrykt i% av Tf-Alexa 488 i utgangspunktet internalisert. De representerer gjennomsnitt ± standardavvik oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter.
Effekt av kjemiske inhibitorer av kjente endocytiske trasé på opptaket av Tf ved ikke-differensierte Caco-2-celler, avhengig av nivået av CD133 ekspresjon understreket betydningen av clathrin pathway
Etter å ha fastslått at nivået av uttrykk for CD133 hatt en innvirkning på Tf opptak innenfor ikke-differensierte Caco-2 celler, men ikke modulere Tf resirkulering, vi så opp spørsmålet om CD133 er involvert i konkrete pinocytic trasé [ ,,,0],33]. For dette formål opptak av Tf-Alexa 488 innenfor CD133
høye og CD133
lav uttrykkende celler ble overvåket etter behandling med tidligere identifiserte kjemiske inhibitorer av kjente endocytiske veier. Klorpromazin ble anvendt for å inhibere clathrin mediert transport [22], filipin å inhibere caveolae avhengig endocytose [23] og DMA for å inhibere macropinocytosis [24]. Flowcytometri etablert at forbehandling av kontroll CD133
høye Caco-2 celler med filipin, klorpromazin og DMA før eksponering for 5 mikrogram /ml Tf-Alexa 488, førte til en 30%, 90% og ikke-signifikant reduksjon i Tf opptak henholdsvis (figur 3A). Den store effekten av klorpromazin kombinert med svakere effekt av filipin dermed understreket at Tf opphopning innenfor ikke-differensierte Caco-2 celler skyldes i hovedsak clathrin-mediert transport [37]. Den filipin effekt kunne forklares ved det faktum endocytose Protopic substrater for reseptormediert endocytose, slik som LDL eller Tf, som vanligvis rute til den intracellulære rommet gjennom clathrin vei, alternativt kunne bruke caveolae veien [38], [39] . Videre, som kolesterol har vist seg å være involvert i dannelsen av klatrin belagt endocytiske vesikler [26], filipin, som sequestrates kolesterol, kan også ha en indirekte innvirkning på clathrin endocytose. Interessant, når de vurderer CD133 knockdown og CD133
lave Caco-2 celler, ble svært like data innhentet med filipin, klorpromazin og DMA, som fører til 18%, 85% og ikke-signifikant reduksjon i Tf opptak, henholdsvis (figur 3A) . Dermed de kvantitative effekter av CD133 på Tf endocytose ser ut til å være i hovedsak knyttet til clathrin avhengige veien. Overraskende, kolesterol utarming, oppnås ved å bruke MβCD i kombinasjon med lovastatin [25], [26], som er blitt sagt å påvirke klatrin uavhengige retninger og til en viss grad klatrin uselvstendige trasé [26], [40], [41], førte en stor forbedring i Tf-Alexa 488 opphopning innenfor CD133
høye Caco-2 celler (+ 49%, figur 3A). Interessant, virkningen av kolesterol uttømming på Tf-Alexa 488 opptak innen CD133
lave Caco-2 celler var mindre markert (+ 21%, figur 3A). De siste dataene støtter hypotesen om at CD133 interaksjon med intracellulær kolesterol har også en innvirkning på Tf endocytose. For ytterligere å underbygge en mulig sammenheng mellom CD133 og clathrin avhengige endocytose vei, virkningen av CD133 knockdown på opptaket av syntetiske nanopartikler (LNC) som tidligere ble beskrevet til å bruke clathrin veien på vei til den intracellulære løpet av Caco-2 celler [ ,,,0],21] ble undersøkt. Interessant, som for fluorescerende Tf, opptak av fluorescensmerket tagget LNC (NR-LNC) var signifikant høyere i CD133
lave Caco-2 celler (kontroll siRNA) sammenlignet med CD133
høye Caco-2 celler (CD133 siRNA) (Figur 3B).
A) Konsekvenser av CD133-spesifikke siRNA knockdown for effektiviteten av kjemiske midler med kjente endocytiske baner i moduler Tf opptak av ikke-differensierte Caco-2-celler. Etter behandling med enten bærer alene (kontroll), filipin, klorpromazin, DMA eller MβCD lagt med lovastatin (MβCD), CD133
høy (kontroll siRNA) og CD133
lav (CD133 siRNA) ikke-differensiert Caco-2 celler ble utsatt for 5 mikrogram /ml Tf-Alexa 488. Cellular internalisering av Tf-Alexa 488 ble deretter målt ved flowcytometri. Resultater er uttrykt som% av Tf-Alexa 488 beløpene som ble internalisert i kjøretøyet behandlet kontrollgruppe. Legg merke til fraværet av virkningen av CD133-siRNA knockdown på den store inhibering av Tf-opptak forårsaket av klorpromazin. Merk også den reduserte opp regulerende effekt av kolesterol utvinning i CD133 lav situasjon (MβCD). Data representert gjennomsnitt ± standardavvik av en triplikat oppnådd fra en representativt eksperiment som er gjengitt to ganger. Sammenligninger med kontroll: Dunnetts test, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; sammenligning mellom kontroll siRNA og CD133 siRNA: Dunnetts test: p 0,05. B) Spesifikk siRNA mediert knockdown av CD133 innenfor ikke-differensiert Caco-2 celler førte til en økning i LNC intracellulær akkumulering. Strømningscytometrisk analyse av intracellulært opptak av NR-LNC innenfor CD133
høy (kontroll siRNA) og CD133
lav (CD133 siRNA) Caco-2 celler etter 1 time med inkubering ved 37 ° C /5% CO
2. Resultatene er uttrykt som prosent av kontroll, således som representerer de GEOMEAN fluorescensintensitet nivåene erholdt for celler behandlet med bærer alene. Data representert gjennomsnitt ± standardavvik oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Dunnetts test. ** P 0,01
Behandling av ikke-differensierte Caco-2 celler med AC133 antistoff som gjenkjenner det ekstracellulære domenet av CD133 resulterte i en reduksjon i Tf opptak
etter å ha fastslått at CD133 uttrykk kvantitativt påvirket Tf endocytose, så vurderte vi at en direkte interaksjon mellom CD133 protein og Tf endocytic maskiner ville ha blitt påvirket av ekstracellulært ligand binding til CD133. Som ekstracellulær ligand av CD133 ikke hadde ennå blitt identifisert, og siden monoklonale antistoffer er allerede blitt brukt til å aktivere eller som funksjon å blokkere immunglobuliner, for eksempel i interaksjon mellom integriner og ekstracellulære matriks [42], den AC133 antistoff, som gjenkjenner en ekstracellulær glykosylering tilknyttet epitop av CD133 [43], ble deretter testet som CD133 ligand leve Caco-2 celler. Interessant, mens behandling av ikke-differensierte Caco-2-celler med et IgG1κ isotype kontroll-immunglobulin hadde ingen effekt på den intracellulære akkumuleringen av Tf-Alexa 488 evaluert ved flow-cytometri (figur 4A), behandling med den AC133-antistoff resulterte i en vesentlig reduksjon i tf opptak av 38 ± 8% og 75 ± 1% ved 5 og 10 ug /ml, henholdsvis (figur 4A). Disse data etablerte som AC133 effektivt kan utøve funksjonelle effekter på levende celler her tilskrives et samspill mellom CD133 selv og Tf endocytic maskiner i ikke-differensiert Caco-2 celler.
A) AC133 antistoff behandling hemmet Tf opptak.
