Abstract
Bakgrunn
Kreftceller blir avhengige av både aktiverte onkogener og proliferativ og pro-overlevelse signaler gitt av unormal svulstens mikromiljø. Selv om mange løselige faktorer har blitt identifisert som forme crosstalk mellom tumorceller og stroma, har det ikke blitt fastslått hvordan onkogene mutasjoner i kreftceller endre deres interaksjon med normale celler i svulsten mikromiljøet.
hovedfunnene
viste at isogene HCT116 og hke-3-celler, som bare skiller seg ved nærværet av det mutante allelet KRAS, både stimulere makrofager til å produsere IL1β. I sin tur, makrofager forbedret Wnt signalering, spredning og overlevelse i både HCT116 og HKE-3 celler, noe som viser at signale av onkogene Kras i tumorceller ikke påvirker deres interaksjon med makrofager. HCT116 cellene er heterozygote for β-catenin (HCT116
WT /MT), husing en villtype (WT) og en mutant (MT) allel, men isogene linjer som bærer bare WT (HCT116
WT) eller MT β-catenin allel (HCT116
MT) har blitt generert. Vi har vist at makrofager fremmet Wnt signalisering i celler som bærer MT β-catenin allel, men ikke i HCT116
WT celler. I samsvar med denne observasjonen, makrofager og IL1β ikke klarte å stabilisere Snail i HCT116
WT celler, og for å beskytte disse cellene fra TRAIL-indusert apoptose. Til slutt viste vi at HCT116-celler som uttrykker dominant negativ TCF4 (dnTCF4) eller HCT116 cellene med taushet Snail unnlatt å stimulere IL1β produksjon i makrofager, noe som viser at kreftceller aktivere makrofager via en Wnt avhengig faktor.
Betydning
Våre data viser at onkogene β-catenin mutasjoner i kreftceller, og påfølgende aktivering av Wnt signalering, ikke bare utløse celle indre endringer, men også ha en betydelig innvirkning på crosstalk av tumorceller med tumorassosierte makrofager.
Citation: Kaler P, Augenlicht L, Klampfer L (2012) Aktivere Mutasjoner i β-catenin i tykktarm kreft celler endre sine Interaksjon med Makrofager; rollen til sneglen. PLoS ONE 7 (9): e45462. doi: 10,1371 /journal.pone.0045462
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 18 juni 2012; Godkjent: 22 august 2012; Publisert: 21.09.2012
Copyright: © Kaler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CA 111 361 (LK), U54 CA 100926 (til LA) og P30-13330 fra NCI (National Cancer Institute (USA)). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Beta catenin (β-catenin) er en E-cadherin bindende protein og spiller derfor en viktig rolle i celle-celle adhesjon [1]. I tillegg fungerer den som en effektor av Wnt signale [2]. I fravær av Wnt aliserte β-catenin blir fosforylert av GSK3P, noe som resulterer i sin ubiquitinering og etterfølgende nedbrytning i den proteasomet [3]. Aktiviteten av β-catenin styres av tumor suppressor adenomatøs polypose Coli (APC) og inaktiverende mutasjoner i APC-genet, som hindrer β-catenin degradering, er funnet i det store flertall av sporadiske kolorektal kreft [4], [5] . Videre, ca 10% av kolorektal kreft bærer mutasjoner i GSK3p-fosforyleringssetet lokalisert i den N-terminale ende av β-catenin [6]. APC mutasjoner og β-catenin mutasjoner er gjensidig utelukkende i tykktarmskreft, som de begge fører til stabilisering av β-catenin og i konstituerende β-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet.
HCT116 cellene er heterozygote for β-catenin, husing en villtype (WT)-allel og en mutert (MT) allele med inaktivering av SER45, en av restene fosforylert av GSK3P som ofte mutert i tumorer [6], [7]. Isogene HCT116-cellelinjer som bærer bare WT eller MT-allelet er generert for å studere rollen til onkogene β-catenin signalisering i tykktarmskreft [8], [9]. Som forventet, sletting av MT β-catenin allel i HCT116 cellene reduseres betraktelig β-catenin /TCF formidlet transkripsjonen aktivitet i disse cellene. Mens de totale nivåer av β-catenin var lik i celler med forstyrret WT eller MT β-catenin allelet, inaktivering av de MT-allel resulterte i omfordeling av β-catenin til cellemembraner forbundet med cellekryss [8], [9]. Overraskende ekspresjon av typiske wnt målgener, for eksempel c-myc, ikke ble redusert ved delesjon av den mutante β-catenin allel, og vekst egenskapene til disse celler under standardbetingelser ble ikke signifikant påvirket
in vitro product: [ ,,,0],8]. Disse resultatene antydet at mutasjoner i β-catenin, i tillegg til å initiere en mengde celle indre forandringer, kan også påvirke interaksjonen mellom tumorceller med komponentene i svulsten mikromiljøet og dermed bidra til tumorutvikling
in vivo
.
Vi har nylig rapportert at tumorcelle-avledet faktor (er) aktiverte makrofager for å produsere IL1β, som i sin tur inaktiveres GSK3P, øker nivåene av ufosforylerte β-catenin og stimulert Wnt signalisering i HCT116-celler [10]. Vi viste at makrofag-avledete faktorer stimulert Wnt signalisering i en NF-kB-avhengig måte [11]. I samsvar med dette, konstitutiv aktivering av IKK2 i intestinale epitelceller, som er tilstrekkelig til å indusere tarmsvulster hos mus, utløser mobilisering av makrofager og ekspresjon av en rekke av proinflammatoriske cytokiner, inkludert TNF og IL1β [12], og celler med konstitutiv aktivering av IKK2 vises aktivert Wnt signal
A.: HCT116 og hke-3-celler ble sammenlignet for deres evne til å indusere IL1β i perifere blodmonocytter (Mo). Evnen til THP1 makrofager og IL1β å indusere Wnt signalisering i HCT116 og hke-3-celler (B), for å fremme vekst klonogene (C) og for å beskytte mot TRAIL-fremkalt apoptose (D) ble målt.
Vi viste at makro avledet faktorer stabil Snail i tykktarm kreft celler [13], en transkripsjonsfaktor som fremmer invasiv og metastatisk fenotype gjennom induksjon av en epitelial mesenchymale overgang (EMT) [14]. Sneglen er en Wnt målgen [15], [16], men det har også blitt vist å interagere med β-catenin og co-stimulere wnt målgener [15] – [17], noe som indikerer en intrikat samspill mellom Wnt signalering og Snegl. I tillegg regulerer sneglen vekst og overlevelse av tumorceller, og har vært knyttet til dannelsen av kreft stamceller [18]. Økt Wnt signalering og stabilisering av Snail derfor sterkt at makro avledet faktorer øker stamcelleegenskaper av kreftceller, som bidrar til metastasering og vise motstand mot terapi. I samsvar med dette, viste vi at makro avledet faktorer beskyttet tumorceller fra TRAIL-indusert apoptose [13]
A:. Isogene HCT116 cellelinjer med den slettede WT (HCT116
MT) eller MT β- catenin allel (HCT116
WT) ble transfektert med TOP-LUC reporter genet og ble behandlet med økende konsentrasjoner av IL1β eller ble dyrket med THP1 makrofager som angitt. B: HCT116-celler ble transfektert med NF-kB-reporter-gen og ble behandlet med TNF og IL1β som angitt
Her viser vi at evnen til HCT116-celler for å stimulere makrofager er helt avhengig av den. tilstedeværelsen av den endogene mutant β-catenin og påfølgende stabilisering av Snail i epitelceller, bekreftende vår hypotese om at oppkjøpet av onkogene mutasjoner i intestinale epitelceller endrer deres interaksjon med sine mikromiljøet. Vi viste at tykktarmskreftceller stimulere makrofager gjennom produktet av en Wnt målgen. Våre data tyder på at sneglen regulerer uttrykket av dette genet, og dermed spiller en avgjørende rolle i crosstalk mellom kolon kreftceller og makrofager
A:. Foreldre HCT116-celler eller HCT116 med slettet WT eller MT β-catenin allel var behandlet med TRAIL i fravær av THP1 makrofager eller IL1 som angitt. B: Graden av apoptose ble bestemt i 4 uavhengige eksperimenter. C:. HCT116
WT og HCT116
MT celler ble behandlet med TRAIL i fravær eller tilstedeværelse av TNF og omfanget av apoptose ble bestemt av PI farging
Resultater
Mutasjoner i β-catenin, men ikke kras, endrer tykktarmskreft celle interaksjoner med makrofager
Vi rapporterte at tykktarmskreftceller, via en løselig faktor, aktivere makrofager å utskille IL1β, som igjen fremmer β- catenin /TCF4 transkripsjonen aktivitet i kreftceller og stimulerer deres vekst [10]. For å fastslå hvorvidt oppkjøpet av onkogene Kras mutasjon i tumorceller endrer deres interaksjon med makrofager, utførte vi eksperimenter i HCT116 og HKE-3 celler, isogene cellelinjer som skiller seg bare ved tilstedeværelse av muterte KRAS allel [19]. Vi viste at både HCT116 og hke-3-celler indusert IL1β i perifere blodmonocytter, forløpere for tumorassosierte makrofager (Fig. 1A). Følgelig makrofager og IL1β stimulert Wnt signal (Fig. 1B), fremmet vekst (Fig. 1C) og beskyttet HCT116 og HKE-3 celler fra TRAIL-indusert apoptose (Fig. 1 D). Disse studiene viste at tilstedeværelsen av onkogene Kras i tumorceller ikke har en betydelig innvirkning på deres interaksjon med tumorassosierte makrofager
A:. B: HCT116
WT og HCT116
MT celler ble behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær av IL1β som angitt og lokalisering av β-catenin ble bestemt ved immunofluorescens i celler behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær av IL-1β eller TNF som angitt. B:. Graden av kaspase 8 aktivering og spaltingen av PARP og β-catenin ble bestemt ved immunblotting
HCT116-celler er også heterozygot for β-catenin, inneholdende en villtype (WT) og allel en mutant (MT) allele med en 3-bp delesjon som eliminerer serinrest ved kodon 45 [7], noe som resulterer i β-catenin stabilisering og aktivering av Wnt signalering. For å avgjøre om tilstedeværelsen av den aktiverte, MT β-catenin i tumorceller modulerer deres interaksjon med makrofager vi utført eksperimenter i HCT116-celler med en sletting av enten WT (HCT116
MT) eller MT β-catenin allel (HCT116
WT) [8]. De isogene cellelinjer ble behandlet med IL1β eller ble dyrket med THP1 makrofager. Som i foreldre HCT116 celler, makrofager og IL1β indusert Wnt signal i HCT116
MT-celler (fig. 2A). I kontrast, HCT116
WT celler, som viste lavere Wnt signal, ikke klarte å svare på IL1β eller til makrofager med økt Wnt signal (Fig. 2A). Evnen til IL1β og TNF for å aktivere NF-kB, den store signalveien aktiveres av disse cytokinene, ble ikke påvirket av status for β-catenin (Fig. 2B), og dette demonstrerer pathway spesifisitet, og er i overensstemmelse med våre tidligere funn at NFKB signalering er oppstrøms for Wnt signalering [11]. Disse resultatene viser at nærværet av de MT β-catenin allel i tumorceller, noe som resulterer i konstitutiv β-catenin /TCF4 aktivitet, endrer deres interaksjon med makrofager
A.: Makrofager og IL1β inaktivere GSK3p-aktivitet i HCT116 og HKE-3 celler. B: Nivåene av sneglen ble bestemt i HCT116-celler som var dyrket med THP1 makrofager eller ble stimulert med IL1β i fravær eller nærvær av LY294002 som angitt. C: HCT116
WT og HCT116
MT-celler ble dyrket med THP1 makrofager eller ble behandlet med IL1β eller TNF som er anført i 24 timer. D: Evnen til THP1 makrofager og rekombinant IL1β å indusere Wnt signal ble sammenlignet i celler transfektert med uspesifikke (NSP) eller Snail bestemt siRNA
Makrofager mislykkes i å beskytte HCT116-celler som mangler MT β-. catenin allel fra TRAIL indusert apoptose
Vi viste at makro avledet faktorer beskytte kolon kreftceller fra TRAIL-indusert apoptose gjennom en mekanisme avhengig av Wnt signal [13], noe som tyder på at HCT116
WT celler (mangler mutant β-catenin allel), som ikke svare på makrofager med forbedret Wnt signal (fig. 1), kan vise en endret respons på TRAIL. Vi behandlet foreldre HCT116 cellene, HCT116
WT og HCT116
MT celler med TRAIL i fravær eller tilstedeværelse av THP1 makrofager eller IL1β. Som vist på fig. 3, HCT116-celler som mangler det mutante β-catenin allel (HCT116
WT) som vist økt følsomhet for TRAIL-fremkalt apoptose, som er i overensstemmelse med det faktum at Wnt signal beskytter cellene mot TRAIL-fremkalt apoptose [20]. I motsetning til foreldre HCT116-celler og HCT116-celler med slettede WT β-catenin allel (HCT116
MT), ble HCT116
WT cellene ikke beskyttet mot TRAIL-indusert apoptose av makrofagen, IL1β (Fig. 3A, B) eller av TNF (figur 3C).
A.: HCT116 transfektert med tom vektor eller dnTCF4 ble ko-dyrket med primære perifere blodmonocytter (MO) i 24 timer, og mengden av IL1β ble bestemt ved hjelp av ELISA. B: HCT116 eller hke-3-celler transfektert med NSP (ikke-spesifikk) eller snegle bestemte RNAi ble dyrket med THP1 monocytter og mengden av IL1β ble bestemt ved hjelp av ELISA
Til tross for husing mutante β-catenin HCT116-celler. viser overveiende plasmamembranen lokalisering av β-catenin [8]. Behandling av celler med TRAIL utløste tap av distinkte membranfarging i begge HCT116
MT og HCT116
WT-celler (fig. 4A), i samsvar med spaltingen av β-catenin i TRAIL-behandlede celler (Fig. 4B) . Men mens TNF og IL1β restaurert membran lokalisering av β-catenin i HCT116
MT celler, de klarte ikke å motvirke effekten av TRAIL i HCT116
WT celler (fig. 4A). Følgelig, makrofager og IL1β mislyktes i å hemme TRAIL-fremkalt spaltning av β-catenin, aktivering av kaspase-8, og etterfølgende behandling av PARP i HCT116
WT-celler (Fig. 4B).
IL1β i sin tur binder IL1R på kreftceller og stimulerer Wnt signalering. Vi viste at makrofag-avledet faktor stabilisere snegle i tumorceller, noe som ytterligere fremmer Wnt signalering og er nødvendig for evnen av tumorceller for å aktivere makrofager for å produsere IL1β.
Disse data bekreftet at celler med aktive Wnt signal vise en endret respons på makro avledet faktorer, potensielt påvirker deres mottakelighet for terapeutiske midler.
Mangel på Snail stabilisering i HCT116-celler med inaktivert MT β-catenin allelet
Wnt signal har vært vist seg å fremme transkripsjon, stabilitet og nukleære lokaliserings av snegle [15], [16]. Faktisk viste vi at inaktivering av GSK3P av LiCl eller ved en spesifikk inhibitor GSK3P, AR-A014418, var tilstrekkelig til å øke nivåene av sneglen i HCT116-celler [13]. Vi viste at overekspresjon av Snail fremmer TCF4-β-catenin-drevet transkripsjon, og at stanse av Snail forstyrrer Wnt signal i HCT116-celler [13], i samsvar med evne Snail å assosiere med β-catenin og co-regulere uttrykk for wnt målgener [17], [21].
Makrofager og IL1β inaktivere GSK3p både HCT116 og HKE-3 celler (fig. 5A), og konsekvent, stabil Snail uavhengig av tilstedeværelsen Kras mutasjoner i tumorceller [13]. Aktivering av GSK3p av en bestemt PI3K hemmer, YL294002, utelukket macrophage- og IL1β- indusert stabilisering av Snail i HCT116 cellene, noe som bekrefter at makro avledet faktorer stabilisere Snail gjennom sin evne til å inaktivere GSK3p (Fig. 5B).
Vi viste tidligere at makrofag-avledet faktorer mislyktes i å stabilisere sneglen i HCT116-celler som uttrykker dnTCF4, i samsvar med forestillingen om at aktive Wnt signalering er nødvendig for stabilisering av snegle [13]. Her sammen vi muligheten for makro avledet faktorer for å stabilisere Snail i HCT116 cellene som hadde en sletting av enten WT eller MT β-catenin allel. Som i foreldre HCT116-celler, makrofager, IL1β og TNF stabilisert Snail i HCT116
MT celler (Fig. 5C). I motsetning til dette, makrofag-avledede faktorer mislyktes i å stabilisere sneglen i HCT116
WT-celler (fig. 5C), i samsvar med den manglende evne av makrofager for å forbedre Wnt signalering i disse cellene (fig. 1). Vi forstummet Snail i HCT116 cellene og bekreftet at, i samsvar med våre publiserte data [13], makrofager og IL1β unnlatt å stimulere Wnt signal i fravær av Snail (Fig. 5D).
Kreftceller aktivere makrofager via en Wnt avhengig faktor
Vi demonstrerte at tumor-avledet faktor (er) stimulere makrofager til å skille ut en rekke oppløselige faktorer, blant annet IL1β, et cytokin som vi etablert var nødvendig for krysstale mellom tumorceller og makrofager [10 ]. Vi viste at HCT116-celler som uttrykker dnTCF4 mislyktes i å stimulere perifere blodmonocytter å utskille IL1β (fig. 6A), som bekrefter at Wnt signalering er nødvendig for ekspresjon av tumor avledet faktor som stimulerer makrofager.
På samme måte stanse all Snail, en Wnt target gen, i HCT116 eller HKE-3 celler resultert i manglende evne til disse cellene til å utløse IL1β produksjon i transform THP1 monocytter (fig. 6B). Til sammen bekrefter disse dataene at tykktarmskreftceller aktiverer makrofager via et Wnt /snegle-regulert faktor, som er nødvendig for fremstilling av IL1β.
diskusjon
Selv om hensiktsmessig stimulerte makrofager ha iboende evne for å drepe tumorceller, er det blitt klart at makrofager rekruttert til tumoren mikromiljøet og formet av tumor-avledede faktorer mister evnen til å ødelegge tumorceller. Videre har det blitt fastslått at tumorassosierte makrofager (TAM), gir løselige faktorer som fremmer vekst, overlevelse og metastatisk spredning av tykktarmskreftceller [22] – [24]. Flere makro avledet faktorer har blitt identifisert som regulerer veksten av kreftceller. Vi viste at makrofag-avledet IL1β fremmer Wnt signalisering i kolon kreftceller og derved regulerer deres vekst og overlevelse [10], [13]. I sin tur, kreftcellene skiller ut faktorer som tiltrekker og aktiverer myeloide celler, og dermed forplanter en selv forsterkende loop som oppretttumorvekst. Men mye mindre er kjent om innholdet av tumor-avledet faktorer som demper cytotoksiske evne til makrofager og stimulere deres tumor fremme egenskaper. Tumor-avledet CCL2 fremmer rekruttering av inflammatoriske monocytter og [25], og tumor-avledede versican har vist seg å aktivere myeloide celler via TLR2-avhengig signalisering [26].
Vi viste at makrofag-indusert aktivering av Wnt signalisering i kolon kreftceller fremmer deres vekst og overlevelse, i samsvar med en fremtredende rolle Wnt signalisering i tykktarmskreft, og tilbakevendende mutasjoner av APC eller β-catenin i de fleste av sporadisk coloncancere [27]. I denne studien viste vi at aktivering av Wnt signal i tykktarm kreft celler starter ikke bare en mengde celle indre endringer i epitelceller, men også påvirker hvordan epitelceller kommunisere med makrofager. Inaktivering av MT β-catenin allel i HCT116 cellene vesentlig endret deres interaksjon med makrofager. Vi viste at makrofager unnlatt å fremme Wnt signal og for å beskytte HCT116
WT celler fra TRAIL-indusert apoptose. Dette stemmer overens med vår tidligere rapport at ekspresjon av dnTCF4 i tumorceller forebygges signalering mellom makrofager og tumorceller [11], [13], og bekrefter at kjøpet av onkogene mutasjoner endrer interaksjonen av epitelceller med den tilstøtende stroma.
Som IL1β har FGF19 vist seg å modulere Wnt signal i HCT116-celler [28]. Imidlertid, i kontrast til våre funn, FGF19 økt β-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet bare i paren HCT116-celler og i HCT116-celler som beholdt WT β-catenin allelet [28]. Sammen disse dataene understreke betydningen av β-catenin mutasjoner for responsen av tumorceller til autokrint og parakrine signaler og dermed for deres interaksjon med celler i svulsten mikromiljøet. Våre data bekreftet at aktivering av onkogene reaksjonsveier, slik som Wnt, ikke bare utløser celle indre forandringer, men også induserer stromale endringer som er nødvendig for tumorprogresjon. I motsetning til p-catenin mutasjoner, gjorde onkogen aktivering av Kras i intestinale epitelceller ikke påvirke crosstalk mellom epitelceller og stroma.
Vi viste at makro avledet faktorer stabil Snail i tykktarm kreft celler [13], som regulerer epitelial mesenchymale overgang og dermed fremmer stemness av kreftceller og deres evne til metastatisk seeding [29], [30]. Sneglen er en Wnt målgen [15], [16], som i sin tur interagerer med β-catenin, og således samtidig regulerer ekspresjonen av målgener wnt [17]. I motsetning til de paren HCT116-celler, makrofag-avledede faktorer mislyktes i å stabilisere sneglen i HCT116-celler med slettet MT β-catenin allelet (fig. 5C). Vi har vist at evnen til makrofager og IL1β å hemme TRAIL-fremkalt apoptose og for å fremme klonogene vekst av tumorceller ble også hemmet i tumorceller med taushet snegle uttrykk [13], noe som viser at sneglen regulerer flere trinn i koloncancer progresjon og peker til en avgjørende rolle av snegle i krysstale mellom tumorceller og makrofager. Her viser vi at aktiv Wnt signalering i kolon kreftceller, og Wnt-avhengig stabilisering av snegle spesifikt, er nødvendig for tumorceller til å stimulere makrofager til å produsere IL1β (fig. 6). Tilsvarende siste resultatene viste at Snail oppregulerer uttrykket av proinflammatoriske mediatorer i orale keratinocytter, inkludert IL6, IL8, CXCL1 og IL1β [31]. Dette er i tråd med våre funn at makro avledet faktorer beskytte kolon kreftceller fra TRAIL-indusert apoptose gjennom stabilisering av Snail [13]. Derfor er mangelen på sneglen stabilisering i HCT116-celler med inaktiverte MT β-catenin allel ligger under den manglende evne av makrofager for å beskytte disse cellene fra TRAIL-fremkalt apoptose. Disse data bekreftet at aktivering av Wnt signal og påfølgende stabilisering av Snail i tykktarm kreft celler i betydelig grad påvirker deres interaksjon med makrofager, og foreslår en sentral rolle Snail i crosstalk mellom tykktarmskreftceller og makrofager.
Sammen vår data sterkt at kreftceller stimulere makrofager via en Wnt avhengig faktor. Dette er i tråd med våre funn at HCT116-celler som uttrykker dnTCF4 unnlatt å stimulere IL1β i makrofager (Fig. 6) og dermed stille opprørt crosstalk med makrofager [13]. Faktisk viste vi at HCT116-celler som uttrykker dnTCF4 har økt respons på TRAIL, og at makrofager ikke beskytte disse cellene fra TRAIL-indusert apoptose [13]. Eksperimenter er i gang for å identifisere de tumor-avledede faktorer som stimulerer makrofager, og for å bestemme hvorvidt ekspresjonen av Toll-lignende reseptorer (TLR’ene) på makrofager er nødvendig for krysstale mellom tykktarmskreftceller og makrofager (figur 7).
human colon tumor viser heterogene nivåer av Wnt aktivitet [32], og det har vist seg at bare celler med høye nivåer av Wnt signalvisningstykktarmskreft stamcelle (CSC) Egenskaper [33], [34]. Faktisk stanse av β-catenin i HCT116-celler har vist seg å redusere antall colonospheres, som er sterkt anriket i cscs [35]. I samsvar med dette, HCT116
WT celler ikke klarte å danne kuler når belagt i lave serum forhold [9]. Vi har vist at makrofager og IL1β forbedret Wnt signalering og stabilisert snegl i tumorceller [13], som har vist seg å utstyre cellene med stamcelle-lignende egenskaper [18], som tyder på at macrophage- avledet faktorer bidrar til heterogeniteten til tykktarmskreft ved å utvide den fraksjon av tumorceller som har kreft stamcelleegenskaper. Likeledes har myofibroblast-avledede faktorer blitt vist å pålegge CSC-fenotype ved å fremme Wnt signalering på tumorceller [34] og periostin, en komponent av den ekstracellulære matriks, fremmer stemness av kreftceller og øker deres evne til å danne metastaser ved oppregulering Wnt signalering [36].
Fordi en aktiv Wnt signal er en signatur av tykktarmskreftstamceller, er det mulig at kreftstamceller har en eksklusiv mulighet til å samhandle med cellene i svulsten mikromiljøet. I samsvar med dette, kreft assosiert fibroblaster fremme invasivitet av CD133
+ kolon kreft stamceller mer effektivt enn for CD133
– celler [37]. Dette vil trolig bidra til den unike evnen til kreft stamceller til å forplante tumorvekst og for å gi resistens mot terapeutiske tilnærminger.
Materialer og Metoder
cellelinjer og co-kultur eksperimenter
HCT116 og hke-3-kolorektalt karsinom-cellelinjer, som skiller seg bare ved nærværet av den mutante k-Ras-allelet [19], ble dyrket i MEM, supplementert med 10% FCS. HCT116 med forstyrret WT eller MT β-catenin allelet ble gitt av Kenneth Kinzler [8]. Den humane monocyttisk cellelinje, THP1, ble dyrket i RPMI. Normale humane monocytter, 90% CD14 og CD11c positiv positiv og mindre enn 1% anti-T-celle-reseptor, ble kjøpt fra
Astarte Biologics plakater (Redmond, WA). Tumorceller og monocytter /makrofager ble ko-dyrket adskilt av Transwell innsatser av en polykarbonatmembran med 0,4 uM porestørrelse som utelukker direkte celle-celle-kontakt, men tillater utveksling av løselige faktorer (Corning Incorporated, Lowell, MA).
for klonogene analyser, HCT116 og hke-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 200 celler per brønn i en brønns plate alene eller sammen med perifere blodmonocytter i 7 dager som tidligere beskrevet [10], [11]. Koloniene ble fiksert og farget med 6% glutaraldehyd og 0,5% krystallfiolett og telles ved hjelp av Total Lab 1.1-programvaren (lineære Dynamics, Durham, NC, USA).
apoptose analysen
Celler ble behandlet med rekombinant TRAIL (50 ng /ml, den optimale konsentrasjonen for induksjon av apoptose i HCT116-celler) alene eller i nærvær av makrofager, IL1β (5 ng /ml) eller TNFa (10 ng /ml) i 7 timer. Celler ble resuspendert i hypotonisk buffer (0,1% Triton X-100, 0,1% natrium- citrat) og farget med propidiumjodid (50 ug /ml) i 4 timer ved 4 ° C som beskrevet [38]. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri og cellesyklusfordeling, og omfanget av apoptose (celler med en subG1 DNA-innhold) ble analysert ved hjelp av den
Modfit
programvare. Cellene ble behandlet med TRAIL for -7 timer og var samlet for evaluering basert på morfologiske kriterier. Vi bekreftet apoptotiske natur celler ved biokjemisk analyse av cellelysatene. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av uparet Student t test, med verdier og 0,05 anses statistisk signifikant
Transient transfeksjon og reporter gen analysen
HCT116 og HKE-3 celler ble transient transfektert med TOP-. FLASH plasmid (som bærer en TCF spesifikk promoter) eller det øverste FOP plasmid (en kontroll plasmid som bærer et mutert promoter) ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. Transfeksjon effektivitet ble normalisert ved ko-transfeksjon med pTK-Renilla og luciferase aktivitet ble bestemt i henhold til leverandørens protokollen (Dual Luciferase reporter analysen, Promega, Madison, WI).
immunfluorescens
For subcellulære påvisning av β-catenin ved immunofluorescens ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Cellene ble inkubert med anti-β-catenin antistoff (BD Biosciences, San Jose, CA, 1:100) i 1 time ved 37 ° C og med sekundære anti-kanin antistoff konjugert til FITC i 45 minutter ved 37 ° C. Bilder ble kjøpt med en SPOT CCD-kamera og analyseres av SPOT programvare.
Western Blot
Western blot ble utført ved hjelp av standard prosedyrer. Membraner ble blokkert med 5% melk i TBS som inneholder 0,1% Tween 20, og inkubert med antistoffer spesifikke for caspase 8 (Abcam), caspase 9, PARP og Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3 (Millipore, Billerica, MA), total beta -catenin (BD Biosciences, San Jose, CA), og β-aktin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Immunoreaktive bånd ble visualisert ved kjemiluminescens (Amersham ECL
TM western blotting deteksjon kit, Piscataway, NJ).
