Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk. De blir avvikende uttrykt i mange typer kreft. I denne studien fant vi ut de genom-wide miRNA profiler i blæren urothelial carcinoma av dyp-sekvensering.
Metodikk /hovedfunnene
Vi oppdaget 656 forskjellig uttrykt kjent menneskelige mirnas og miRNA antisens sekvenser (miRNA * s) i ni blære urothelial karsinom pasienter med dyp sekvensering. Mange mirnas og miRNA * s signifikant oppregulert eller nedregulert i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium.
HSA-MIR-96
var den mest signifikant oppregulert miRNA og
HSA-MIR-490-5p
ble den mest betydelig nedregulert en. Oppregulert mirnas var mer vanlig enn downregulated seg.
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200b~429
,
HSA-MIR-200c~141 Hotell og
HSA-MIR-17~ 92
klynger ble betydelig oppregulert.
HSA-MIR-143~145
cluster var signifikant nedregulert.
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200a
,
HSA-MIR-143 Hotell og
HSA-Mir-195
ble evaluert av real-Time qPCR i totalt femtien blære urothelial karsinom pasienter. De ble abnormt uttrykt i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium (p 0,001 for hver miRNA).
Konklusjon /Betydning
Til dags dato, er dette den første studien å bestemme genome- brede miRNA uttrykk mønstre i menneskelig blære urothelial carcinoma av dyp sekvensering. Vi fant ut at en samling av miRNAs ble abnormt uttrykt i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium, noe som tyder på at de kan spille roller som onkogener eller tumor dempere i utvikling og /eller progresjon av denne kreftformen. Våre data gir ny innsikt i kreft biologi
Citation. Han Y, Chen J, Zhao X, Liang C, Wang Y, Sun L, et al. (2011) mikroRNA Expression Signaturer av blærekreft avslørt av Deep Sequencing. PLoS ONE 6 (3): e18286. doi: 10,1371 /journal.pone.0018286
Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland
mottatt: 16 juli 2010; Godkjent: 02.03.2011; Publisert: 28 mars 2011
Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2006AA02A302 og 2009AA022707) og Promotion Program for Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kina (CXB200903090055A), Bank of Clinical data over alvorlige sykdommer og biologiske prøver av Shenzhen (CXC201005260001A). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er en av de mest utbredte kreftformer i verden. Om 357 000 blærekreft saker ble nylig diagnostisert og 145.000 kreftrelaterte dødsfall ble anslått i 2002 [1]. Urothelial karsinom i blære, er den vanligste form for histopatologisk blærekreft, har en rekke genetiske og fenotypiske karaktertrekk. Mange faktorer, for eksempel kromosomavvik, genetiske polymorfismer, genetiske og epigenetiske forandringer, bidrar til tumorigenesis og progresjon av urothelial carcinoma av blæren [2].
microRNAs (mirnas) er endogene, ikke-kodende RNA-molekyler av ca 22 nukleotider i lengde som regulerer genekspresjon [3]. De blir med i RNA-induced Slå komplisert å regulere målrettet messenger RNA (mRNA) ved å undertrykke mRNA oversettelse og /eller styre mRNA cleavage [4]. mirnas spiller viktige roller i normal utvikling, cellevekst, differensiering og apoptose hos pattedyr [5].
Mer enn halvparten miRNA gener befinner seg i kreft-assosiert genomiske regioner eller i sårbare områder [6]. Avvikende uttrykt mirnas har vist seg å være forbundet med mange typer av kreft. Både tap og gevinster av miRNA funksjon bidrar til kreftutvikling. mirnas fungere som onkogener eller tumor suppressors [7]. Viktigst, ulike krefttyper, stadier eller differensiering stater har unike miRNA uttrykk profiler, noe som tyder på at mirnas kan fungere som nye biomarkører for kreftdiagnostikk [8], [9].
Flere tidligere undersøkelser brukes miRNA mikromatriser med begrenset og varierte sonder for å profilere miRNA uttrykket i blærekreft og deres resultater ikke alltid viser konsistente resultater [10] – [13]. For bedre å forstå hvilken rolle miRNAs i blærekreft utvikling og progresjon, kreves omfattende analyse av uttrykket og overflod av miRNAs i denne kreftformen. Med fortjeneste av high-throughput dyp sekvenseringsteknologi, kan genom-wide kreft mirnas være kvantitativt og nøyaktig bestemt. Her presenterer vi de genom-wide miRNA profiler i ni par av snap-frosset blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium av dyp-sekvensering. Vi fant ut at en samling av miRNAs ble abnormt uttrykt i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium, hvorav flere ble evaluert av Real-Time qPCR i totalt femtien blære urothelial karsinom pasienter.
Resultater
Oversikt over miRNA profiler
Kjente miRNA uttrykket filer mellom blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium fra hver pasient ble sammenlignet for å finne ut forskjellig uttrykt miRNAs. Uttrykket av miRNAs i parvise prøver ble vist ved å beregne log
2Ratio. Fremgangsmåtene er vist som følger: (1) Normal ekspresjonen av mirnas i to prøver (tumor versus normal) for å få ekspresjon av transkriptet per million (TPM). Normalisert uttrykk = Actual miRNA count /Total telling av rene lyder * millioner. (2) Beregn fold-endring og p-verdi fra normalisert uttrykk. Deretter Beregn log
2Ratio. Fold-change = log
2Ratio (tumor /normal). Vi er fast bestemt 656 forskjellig uttrykt kjent menneskelige mirnas og miRNA antisens sekvenser (miRNA * s) i miRBase14.0 i ni blæren uroteliale karsinom pasienter (Tabell S1).
Vi identifiserte et stort antall miRNAs og miRNA * s som ble signicantly oppregulert eller nedregulert hos disse pasientene og kunne diskriminere blære urothelial karsinom fra matchet normal urothelium.
HSA-MIR-96
(log
2Ratio = 4,664328) var den mest signifikant oppregulert miRNA og
HSA-MIR-490-5p
(log
2Ratio = -5,79794) var den mest signifikant nedregulert en (tabell 1). Valgte forskjellig uttrykt mirnas ble validert ved Real-Time qPCR. Real-Time qPCR funn korrelert godt med sekvensering analyse. Sammenligningen mellom Real-Time qPCR funn og dype sekvenseringsresultater er vist i figur 1. De tellinger av oppregulert og downregulated mirnas varieres på forskjellige pasienter. Oppregulert mirnas var mer vanlig enn downregulated de (figur 2). I tillegg har vi identifisert et bemerkelsesverdig divergens av uttrykket nivåer mellom miRNA og paret miRNA *. Uttrykket nivåer av mirnas var vanligvis høyere enn for paret miRNA * s (figur 3).
For sammenligningen mellom dype sekvense data og sanntids qPCR resultater,
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200a
,
HSA-MIR-143 Hotell og
HSA-MIR-195
bestemmes å være forskjellig uttrykt i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium hos ni pasienter med dyp sekvensering ble validert ved hjelp real-Time qPCR. Høyden på søylene i diagrammet representerer log-transformeres median fold endringer (tumor /normal) i uttrykk på tvers av ni pasienter for hver av de fem miRNAs validerte; stolpene representerer standardfeil. Valideringsresultatene i de fem mirnas indikerte at de dype sekvense data korrelert godt med Real-Time qPCR resultatene.
Mange mirnas var fast bestemt på å bli betydelig oppregulert eller nedregulert i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium hos ni pasienter med dyp sekvensering. Tellingene av oppregulert og downregulated mirnas variert over de ni pasienter. I åtte av ni blære uroteliale karsinom pasienter var mer vanlig enn downregulated seg oppregulert miRNAs. I bare én pasient (Pasient nr B13), oppregulert mirnas var mindre vanlig enn downregulated seg.
En samling av miRNAs og sammenkoblede miRNA antisens sekvenser (miRNA * s) var fast bestemt på å bli uttrykt i ni blære urothelial karsinom pasienter ved dyp sekvensering. Vi identifiserte en bemerkelsesverdig divergens av uttrykk mellom miRNA og paret miRNA *. Uttrykket av miRNA /miRNA * parene er vist i spredningsdiagram med logaritmen koordinatsystem; hvert punkt representerer uttrykk for en miRNA /miRNA * pair. I de fleste miRNA /miRNA * parvis ekspresjonsnivået av miRNA var høyere enn for paret miRNA *. I et lite antall miRNA /miRNA * parene, miRNA var mindre enn rikelig paret miRNA *.
I tillegg til de kjente mirnas og miRNA * s, 92 nye miRNA sekvens kandidater ble påvist i vår studien (tabell S2). De fleste av dem ble uttrykt ved meget lave nivåer og bare i visse prøver. Deres uttrykk mønstre og mulige roller trenger videre etterforskning.
Uttrykk for klynge mirnas
Vi fant ut at en samling av deregulerte miRNA klynger ble uttrykt.
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200b~429
,
HSA-MIR-200c~141 Hotell og
HSA-MIR-17~ 92
klynger ble betydelig oppregulert.
HSA-MIR-143~145
klyngen ble signifikant nedregulert.
Real-Time qPCR validering
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200a
,
HSA-MIR-143 Hotell og
HSA-MIR-195
ble evaluert av Real- tid qPCR i totalt femtien blære urothelial karsinom pasienter.
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183 Hotell og
HSA-MIR-200a
ble overexpressed
HSA-Mir-143
og
HSA-Mir-195
ble underexpressed i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium (p 0,001 for hver miRNA). (tabell S3)
Diskusjoner
utvikling av høy gjennomstrømning dyp sekvenseringsteknologi gir mulighet for en nær komplett oversikt over miRNA profiler. Dyp sekvenseringsteknologi har potensial til å identifisere nye vevsspesifikke mirnas [14]. Det bestemmer den absolutte overflod av miRNAs og kan oppdage nye mirnas som har vært savnet etter vanlige kloning og sekvenseringsmetoder [15]. Deep sekvenseringsteknologi er overlegen mikromatriser som bestemmer begrenset kjente mirnas og vanligvis inneholder ikke en fullstendig liste over kjente miRNA antisense sekvenser. Inntil nå dyp sekvenseringsteknologi har vært gullstandard for den omfattende analyse av mirnas.
Forskere har vist at mirnas kan brukes som biomarkører for forskjellige typer av kreft [8], [9]. Noen mirnas som biomarkører er i stand til å spore vev av opprinnelsen til kreft med ukjent primær opprinnelse [16]. Spesifikke miRNA signaturer er overlegen mRNA signaturer i å forutsi prognosen for lungekreft [17].
I dette arbeidet brukte vi dypt sekvenseringsteknologi for å bestemme de omfattende miRNA uttrykk profiler i ni par av snap-frosset blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium. Mange mirnas ble signifikant oppregulert eller nedregulert i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium hos disse pasientene, noe som tyder på at disse avvikende uttrykte mirnas kan spille roller i disse kreftformene. Den mest signifikant oppregulert miRNA
HSA-MIR-96
har blitt rapportert å være onkogene [18], men rollen som den mest betydelig nedregulert miRNA
HSA-MIR-490-5p
er ikke klar. En masse miRNA * s ble signifikant deregulert i blæren urothelial karsinom i forhold til matchet histologisk normale urothelium i denne studien. Noen miRNA * s kan bli med RNA-induced Slå kompleks og har hemmende funksjon [19].
Mange deregulerte miRNA klynger ble uttrykt i henhold til vår dype sekvensering analyse. Vi fant at
HSA-MIR-183
klyngen ble overuttrykt i blærekreft. Denne klyngen består av
HSA-MIR-96
,
HSA-MIR-182 Hotell og
HSA-MIR-183
og ligger på kromosom 7. Disse tre miRNAs er oppregulert i prostata kreft [18]. Den koekspresjon mønster av miRNAs i denne klyngen i kreft antyder at de kan spille roller sammen.
HSA-MIR-200
familie av miRNAs (
HSA-MIR-200a /b /c
,
HSA-MIR-141 Hotell og
HSA-MIR -429
) ble overuttrykt i blærekreft.
HSA-MIR-200b~429
klyngen ligger på kromosom 1 og
HSA-MIR-200c~141
klyngen ligger på kromosom 12. koekspresjon av disse klyngene tyder på at de kan bli styrt av felles faktorer og spille roller sammen.
HSA-MIR-200b
,
HSA-MIR-200a Hotell og
HSA-MIR-429
mirnas er kodet av en enkelt polycistronic transkripsjon og negativt regulert av ZEB1 og SIP1 [20]. TGFß en kan nedregulere
HSA-MIR-200
familie fører til oppregulering av ZEB1 og ZEB2 [21].
HSA-MIR-200
familie er også overexpressed i eggstokkene og livmorhalskreft [22] – [24], noe som tyder på dette miRNA familien er onkogene i seveval kreft.
HSA-MIR-17-92
klyngen ligger på kromosom 13 og fungerer som onkogener. E2F1 og E2F3 kan direkte aktivere transkripsjon av disse miRNAs [25].
HSA-MIR-143~145
klyngen ligger på kromosom 5 og nedregulert i mange kreftformer, blant annet blærekreft og deres cellelinjer [13], [26]. Våre funn gitt mer bevis for å støtte at
HSA-MIR-143~145
klyngen er tumor-undertrykkende i blærekreft.
I denne studien, Real-Time qPCR ble utført for å evaluere uttrykk mønstre av
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183
,
HSA-MIR-200a
,
HSA-MIR-143
og
HSA-MIR-195
i totalt femtien blære urothelial karsinom pasienter.
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183 Hotell og
HSA-MIR-200a
ble overexpressed
HSA-Mir-143
og
HSA-MIR-195
ble underexpressed i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium. Disse funnene støttes vår dype sekvense analyse.
Vi har sammenlignet våre resultater i publiserte data til seacrch for uavhengige eksterne valideringer.
HSA-MIR-182
,
HSA-Mir-183
og
HSA-MIR-224
er oppregulert og
HSA-Mir-1
,
HSA-MIR-101
,
HSA-MIR-143
,
HSA-MIR-145
,
HSA-MIR-127 Hotell og
HSA-MIR-29c
er nedregulert i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium [27]. Våre dype sekvense resultatene var stort sett i samsvar med disse funnene. Den oppregulering av
HSA-Mir-182 Hotell og
HSA-MIR-183
og nedregulering av
HSA-MIR-143
ble funnet i urinblæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium i vår real-Time qPCR evaluering. Profileringen av miRNAs i 106 blærekreft og 11 normale prøver ved hjelp av mikromatriser har avdekket at et sett av miRNAs er oppregulert eller nedregulert i blære kreft [13]. Av disse deregulerte mirnas,
HSA-MIR-21
,
HSA-MIR-20a
,
HSA-MIR-184
,
HSA-MIR-26a
,
HSA-MIR-125b
,
HSA-MIR-29a
,
HSA-MIR-29c
og så på aksje tilsvarende uttrykk mønstre med våre resultater.
HSA-MIR-133a
,
HSA-MIR-133b Hotell og
HSA-MIR-195
er nedregulert i blære kreft [28]. Disse mirnas viste nedregulering i vår sekvensering analyse og
HSA-MIR-195
downregulation ble comfirmed Real-Time qPCR i denne studien.
Vi brukte matchet ved histologisk normal urothelium som kontroll i vår studie . Det har blitt rapportert at enkelte prøver av histologisk normal urothelium fra blærekreftpasienter har genetiske endringer [29]. Noen kromosomavvik som deles av både en svulst og en histologisk normal ser vev ved siden av svulsten kan føre til lignende endringer av miRNA uttrykk. For å kompensere for denne svakhet, sammenlignet vi våre resultater til flere publiserte rapporter ved hjelp urothelium fra normaler som kontroll [10], [13], [28]. En stor samling av funnene var sammenlignbar mellom deres og vår. Våre funn var også i overensstemmelse med disse papirer ved hjelp av avstemt tilstøtende histologisk normale urothelium som kontroll vedrørende en rekke mirnas [26], [27]. Overlappende funn mellom publiserte data og våre resultater er vist i tabell 2.
Så langt vi kjenner til, er dette den første genom-wide profilering av miRNAs i human blærekreft av dyp-sekvensering. Vi fant ut at en samling av deregulerte miRNAs ble abnormt uttrykt i blæren urothelial karsinom sammenlignet med matchet histologisk normal urothelium, noe som tyder på at de kan spille roller som onkogener eller tumor dempere i utvikling og /eller progresjon av denne kreftformen. Våre data gir ny innsikt i kreft biologi. Mer arbeid vil være nødvendig for å bestemme mulige roller mirnas som diagnostiske biomarkører og kandidat terapeutiske mål for blærekreft.
Materialer og metoder
Pasientprøver
Skriftlig informert samtykke var innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av Institutional Review Board of Peking University Shenzhen Hospital. Femtien pasienter med blære urothelial karsinom som fikk delvis eller radikal cystektomi ble inkludert i studien. Av disse pasientene ni ble brukt for første dyp sekvensering analyse av miRNAs og førtito ble brukt for en ekstra evaluering. Blære urothelial karsinom ble diagnostisert histopathologically. Blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium fra hvert fag var snap-frosset i flytende nitrogen immmediately etter reseksjon. Detaljert informasjon om ni blære karsinom urothelial pasienter i dyp-sekvensering settet er oppsummert i tabell S4.
RNA ekstraksjon
Når andelen av kreftceller i et vev seksjon var større enn 80%, den frosne blokk ble underkastet RNA-ekstraksjon. Total RNA ble ekstrahert fra femti-en par av snap-frosset blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. RNA integritet ble evaluert av Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).
miRNA sekvensering og analyse
Atten små RNA bibliotek fremstilt av ni par av snap-frosset blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium ble konstruert, forsterket og sekvensert. Totalt RNA ble brukt for miRNA sekvensering. Etter 5’adapter og 3’adapter ble ligert til små RNA, Revers transkripsjon ble utført. Deretter PCR ble utført og PCR-produktene ble renset. Til slutt, ble miRNA biblioteker konstruert og sekvensert ved Illumina Cluster Station og Genome Analyser (Illumina Inc, CA, USA) ved Beijing Genomics Institute ved Shenzhen i henhold til produsentens protokoll.
Lav kvalitet leser ble fjernet og adapter sekvenser nøyaktig ble klippet ved hjelp av en dynamisk programmeringsalgoritme før ytterligere analyse. Etter eliminering av duplikat leser, de resterende lesninger av minst 18 nt ble kartlagt til et humant genom referanse (hg19) ved hjelp av SOAP V2.0 [30]. Å identifisere sekvens koder som stammer fra koding eksoner, gjentar, rRNA, tRNA, snRNA, og snoRNA, UCSC RefGene, RepeatMasker, NCBI Refseq data og ncRNA merknader kompilert fra NCBI GenBank data (https://www.ncbi.nih.gov ) ble brukt. For å identifisere nye miRNA gener, ble alle hårnål lignende RNA strukturer omfatter små RNA koder identifisert ved hjelp MIREAP (https://sourceforge.net/projects/mireap).
Real-Time qPCR bekreftelse og statistiske metoder
Tre overexpressed (
HSA-MIR-182
,
HSA-MIR-183 Hotell og
HSA-MIR-200a
) og to underexpressed mirnas (
HSA-Mir-143
og
HSA-MIR-195
) ble evaluert i alle pasientene i denne studien. Disse mirnas ble valgt fordi de var betydelig deregulert i den innledende dype sequecing analyse. snRNA U6 ble anvendt som endogene kontroll. Real-Time qPCR ble utført ved hjelp av All-in-One ™ miRNA QRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). 10 ug av total-RNA ble omdannet til cDNA i henhold til produsentens protokoll. PCR ble utført i et totalt reaksjonsvolum på 20 ul, inkludert 10 ul 2xAll-in-One ™ qPCR Mix, 2 mL av Universal Adaptor PCR Primer (2 mm), 2 mL av All-in-One ™ qPCR Primer (2 mm), 2 pl First-Strand cDNA (fortynnet i 1:05), 50xROX Reference Dye 0,4 mL og 3,6 mL dobbelt destillert vann. Reaksjonene ble utført og analysert ved anvendelse av ABI PRISM 7000 Fluorescerende Kvantitativ PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-reaksjoner ble utført for cancer og normal cDNA i tre eksemplarer for hvert sett. Syklusparametrene for PCR var som følger: (1) en innledende denatureringstrinn av 15 minutter ved 95 ° C; (2) 40 sykluser, med en syklus bestående av 15 s ved 95 ° C, 20 s ved 55 ° C og 30 s ved 70 ° C. Katalog antall All-in-One ™ miRNA qPCR Grunning er oppført i tabell S5. Median i hvert tre eksemplarer ble brukt til å beregne relative miRNA konsentrasjoner (ΔCt = Ct
medianmiRNA-Ct
mediansnRNAU6). Expression fold endringer ble beregnet ved hjelp av 2
-ΔΔCt metoder [31]. De miRNA uttrykket forskjeller mellom kreft og kontroll ble analysert ved hjelp av Student
t
test innen SPSS (versjon 16.0 SPSS Inc.). En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1..
mirnas ble uttrykt forskjellig mellom blære urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s001 plakater (XLS)
Tabell S2.
Sekvensene av nye miRNA kandidater ble registrert i blæren urothelial karsinom og matchet histologisk normal urothelium.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s002 plakater (XLS)
tabell S3.
Delt-Ct-verdier av Real-Time qPCR i femtien blære urothelial karsinom pasienter.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
Pasientinformasjon i dyp sekvensering sett.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s004 plakater (DOC)
Tabell S5.
Primer katalog.
doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s005 plakater (DOC)
Takk
Vi takker alle givere som deltok i dette programmet, alle våre medarbeidere som har bidratt til byggingen av den urologiske Tissue Bank ved Peking University Shenzhen Hospital og alle de som er viet til den dype sekvense service på Beijing Genomics Institute ved Shenzhen.
