Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) representerer en klasse av små ikke-kodende RNA som styrer genuttrykk ved å målrette mRNA og utløser enten oversettelse undertrykkelse eller RNA degradering. Emerging bevis tyder på potensialet involvering av endret regulering av miRNA i patogenesen av kreft, og disse genene er tenkt å fungere som både tumor suppressors og onkogener.
metodikk /hovedfunnene
Bruke mikroRNA mikromatriser identifiserer vi flere mirnas abnormt uttrykt i menneskelig eggstokkreft kreft vev og cellelinjer.
MIR-221
skiller seg ut som en svært forhøyet miRNA i eggstokkreft, mens
MIR-21 Hotell og flere medlemmer av
la-7
familie er funnet nedregulert. Offentlige databaser ble brukt til å avsløre potensielle mål for de svært forskjellig uttrykt miRNAs. For å eksperimentelt identifisere utskrifter som stabiliteten kan være påvirket av forskjellig uttrykt mirnas, transfektert vi forløper mirnas inn menneskelige kreftcellelinjer og brukes oligonukleotid microarrays å undersøke endringer i mRNA nivåer. Interessant nok var det lite overlapping mellom predikerte og de eksperimentelle mål eller veier, eller mellom eksperimentelle mål /trasé innhentet ved hjelp av ulike cellelinjer, fremhever kompleksiteten av miRNA mål utvalg.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater identifisere flere forskjellig uttrykt mirnas i eggstokkreft og identifisere potensielle mål utskrifter som kan være regulert av disse miRNAs. Disse mirnas og deres mål kan ha viktige roller i initiering og utvikling av eggstokkreft
Citation. Dahiya N, Sherman-Baust CA, Wang T-L, Davidson B, Shih I-M, Zhang Y, et al. (2008) mikroRNA Expression og identifisering av mulige miRNA Targets i eggstokkreft. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10,1371 /journal.pone.0002436
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 04.01.2008; Godkjent: 06.05.2008; Publisert: 18 juni 2008
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, . Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program fra NIH, National Institute on Aging
Konkurrerende:
Finansiering overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er 21-23 nucleotide regulatoriske RNA behandlet 70-100 nucleotide hårnål forhånds mirnas [1], [2]. Den miRNA er innlemmet i en ribonucleoprotein kompleks kalt RNA-induced Slå kompleks (RISC) og veilede RISC til målet mRNA [3]. Binding av miRNA til målet mRNA 5’UTR kan nedregulere genuttrykk gjennom hemming av oversettelse eller økt RNA degradering. I tillegg tyder nyere bevis for at miRNA kan også oppregulere oversettelse under visse omstendigheter [4]. Hundrevis av mirnas har blitt identifisert i ulike arter, inkludert
C. elegans
, mennesker, og anlegget
Arabidopsis thaliana
. Det antas at pattedyr mirnas har potensial til å regulere i det minste 20-30% av alle humane gener [5]. Hver miRNA kan målrette opptil 200 utskrifter direkte eller indirekte, og flere mirnas kan målrette et gitt gen [6]. Derfor potensialet reguleringskretser by av miRNA er ekstremt kompleks. Ekspresjonen av flere mirnas har vist seg å være utviklingsmessig regulert og flere studier har vist at miRNA er ansvarlig for å bestemme celle skjebne. Disse resultatene indikerer at mirnas spille en viktig rolle i de grunnleggende cellulære prosesser, herunder tidspunktet for cellulær utvikling, hematopoiesen, fettstoffskiftet, organogenese, apoptose, celleproliferasjon og differensiering. Det er også sterke bevis for at mirnas er innblandet i angrep og progresjon av mange sykdommer, inkludert kreft [3].
Sammenligning mellom kreft hos mennesker og deres normale kolleger har avdekket ulike miRNA uttrykk profiler. Faktisk har en rekke studier rapporterer ulikt regulert mirnas i ulike typer kreft som brystkreft [7], lungekreft [8], kronisk lymfatisk leukemi [9], tykktarmskreft [10], skjoldbruskkjertelen karsinom [11], kreft i bukspyttkjertelen [12], hode- og nakkekreft [5], prostatakreft [13], hypofyse adenomer [14], og eggstokk-kreft [15] – [18]. Sammen er disse studiene viser at enkelte humane mirnas er konsekvent deregulert i human kreft, noe som antyder en rolle for disse gener i tumorgenese. Spesifikt over-ekspresjon eller under ekspresjon av visse mirnas har vist seg å korrelere med bestemte tumortyper [19]. Overexpressed mirnas potensielt kan målrette tumorsuppressorgener, mens downregulated mirnas teoretisk ville regulere onkogener. For eksempel
la-7
mirnas, som er ned regulert i lungekreft, kan negativt regulere onkogener RAS og HMGA2, noe som gir en mekanisme for oppregulering av disse onkogener [8], [20], [ ,,,0],21]. Dermed medlemmer av
la-7
familie funksjon biologisk som tumor suppressors og deres tap er spådd å fremme transformasjon og tumorprogresjon. Omvendt, den menneskelige miRNA klyngen
MIR-17-92
fungerer som et onkogen i B-cellelymfom [22] og lungekreft [23], og kan samarbeide med
myc product: [22] .
Unique miRNA uttrykk signaturer har blitt funnet å være assosiert med bio-molekylære og prognostiske karakteristika for human lungekreft og kronisk lymfatisk leukemi [8], [24], noe som indikerer at miRNA signaturer kan brukes til å definere biologisk eller kliniske tegn på kreft hos mennesker. Utviklingen av nye miRNA markører i nær fremtid vil representere en av de viktigste målene i molekylær medisin som miRNA uttrykk profiler kanskje bedre klassifisere dårlig differensierte svulster sammenlignet med karakterutskriften baserte classifiers [19].
Det er et begrenset antall studier i litteraturen om rollene til mirnas i eggstokkreft. Zhang et al. rapportert høyfrekvente genomiske forandringer involverer miRNA gener i 227 menneskelige eggstokkreft, brystkreft og føflekkreft prøver [15]. I en annen studie ble 84 vev (15 normal og ondartet 69) og 5 cellelinjer analysert for endring i miRNA profil [16]. Endelig en studie analysere 10 ovarietumorer og 10 forskjellige normale kontroller ble nylig rapportert [17]. I denne rapporten beskriver vi en rekke eksperimenter for å belyse endringer i miRNA uttrykk i eggstokkreft og å identifisere mulige mål for relevante kandidat mirnas.
Resultater
miRNA uttrykk mønstre i eggstokkene vev
miRNA uttrykk profiler ble bestemt for 34 eggstokkreft vev (tabell 1) samt 10 eggstokkreft cellelinjer. En immortalisert human ovarial flate epitel cellelinje ble anvendt som ikke-transformerte kontroll. Uttrykket profiler ble bestemt ved bruk miRCURY ™ LNA miRNA Arrays. LNAs er en klasse av konformasjonelt begrensede nukleotid-analoger som øker affinitet av et oligonukleotid til dens komplementære RNA- eller DNA-mål. Den Exiqon miRNA matrise er for tiden den mest omfattende probe sett tilgjengelig på en rekke plattform og gir en grundig analyse av miRNA uttrykk. Etter RNA-hybridisering og rekke analyse ble prøvene gruppert i henhold til deres miRNA profil ved hjelp av hierarkisk clustering algoritme av JMP 6.0.0 programvare. Figur 1A viser hierarkisk clustering analyse av tumorvev og cellelinjer basert på generelle miRNA uttrykk. Profilene vist står i forhold til eggstokkene overflaten epitelceller (HOSE-B-celler). Prøvene ble delt opp i tre hoved klynger. Det midtre cluster består utelukkende av tumorer (17 sampler), mens den venstre gruppen inneholder 2-cellelinjer og 7 primære svulster. Retten klyngen er beriket i cellelinjer og inneholder 8 cellelinjer av 18 medlemmer i klyngen. Den hierarkiske clustering ble deretter gjentatt basert på en mye mindre antall gener og inkluderte bare 70 svært forskjellig uttrykt miRNA i eggstokkreft vev og cellelinjer. Dette clustering analyse ga opphav til flere klynger, men igjen, cellelinjene klynget sammen i 2 forskjellige klynger mens de primære vev ble gruppert sammen (figur 1B), noe som tyder spesifikke forskjeller i miRNA uttrykket mellom eggstokkreft vev og cellelinjer.
Tre generert av cluster analyse av eggstokkreft vev og cellelinjer basert på (A) alle testede mirnas i vev og cellelinjer, og (b) differensielt regulerte mirnas (endring 2.0 eller 0,5 i mer enn 60 % av prøvene) i vev og cellelinjer i forhold til de normale kontroll SLANGE-B-celler.
Ved hjelp av prinsipal komponent analyse (PCA) fant vi at global miRNA uttrykket kan skille eggstokkreft svulster fra eggstokkreft cellelinjer (figur 2). Den ikke-tumorigent kontroll HOSE-B også utstilt et unikt uttrykk mønster, skilles fra begge cellelinjer og vev.
To-dimensjonal PCA viser at globale miRNA uttrykk mønstre er forskjellige i eggstokkreft cellelinjer (angitt i blått ), eggstokkreft vev (angitt i grønt), og de ikke-tumorigene HOSE-B-celler (i rødt).
uttrykt forskjellig mirnas
Vi identifiserte mirnas som var forskjellig uttrykt mellom ikke-neoplastiske og neoplastiske prøver (figur 3A, tabell 2). Bare mirnas som ble endret i det minste to ganger ble vurdert i minst 60% av prøvene vesentlige kandidater. Ved hjelp av disse strenge kriterier, identifiserte vi 25 oppregulert og 31 downregulated mirnas mellom kontroll og kreft vev. Tilsvarende har vi identifisert fem oppregulert og 23 downregulated mirnas i eggstokkreft cellelinjer sammenlignet med ikke-neoplastiske HOSE-B-celler. 14 mirnas ble deregulert i både vev og cellelinjer og er oppført i figur 3A. Antallet mirnas som viste nedregulering i tumorprøver (n = 31) såvel som i kreftcellelinjer (n = 23) var høyere enn antallet oppregulert (n = 25 i tumorvev, n = 5 i cellelinjer) mirnas . Dette er i samsvar med tidligere publiserte miRNA profilering studier, hvorav de fleste har vist nedregulering av miRNAs å være mer vanlig enn oppregulering i kreft [8], [13], [19], [25], [26].
(A) Venn-diagram viser antall mirnas forskjellig uttrykt i eggstokkene cellelinjer, i eggstokkreft vev og i begge. For hver kategori blir mirnas forhøyet (angitt i rødt) og nedregulert (angitt i grønt) er angitt nedenfor diagrammet. (B) Den Venn-diagram viser antall forskjellig uttrykt mirnas identifisert i denne studien og antall mirnas identifisert i 3 tidligere eggstokkreft studier. De mirnas til felles er angitt under diagrammet og fargekodet (rød: forhøyet, grønn: redusert)
MIR-221
var den mest høyt hevet miRNA. i begge vev og cellelinjer (9-fold og 7 ganger henholdsvis), mens
MIR-21
ble signifikant redusert i begge prøvetyper (3-fold og 9-fold, henholdsvis) (tabell 2). Blant de forskjellige
la-7
familiemedlemmer,
la-7e Hotell og
la-7F
viste mer enn to ganger deregulering i minst 60% av tumorprøver . Den andre
la-7
familiemedlemmer (
la-7g
,
la-7d
,
la-7c
,
la-7a -e
,
la-7i
,
la-7a
,
la-7b
ikke ble nedregulert som konsekvent, men hver og en av dem ble funnet sunket 2 fold eller mer i minst 20% av svulstene. Totalt 94% av svulstene hadde minst en
la-7
familiemedlem downregulated minst to ganger. Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP utstilt nedregulering av
la-7
familiemedlemmer også.
la-7F
ble nedregulert mer enn fire ganger i cellelinjer, mens
la-7d Hotell og
la-7a- e
var også signifikant redusert (mer enn 2,3 ganger og to ganger, henholdsvis).
Vi har sammenlignet differensielt regulerte eggstokkene mirnas identifisert i denne studien med de som er rapportert i tre tidligere studier [15] -.. [17] av totalt 136 mirnas funnet deregulert i tidligere studier, 16 ble også identifisert i vår studie (figur 3B) av disse 16 mirnas, ni ble nedregulert (
la-7d
,
MIR-106b
,
MIR-122a
,
MIR-141
,
MIR-183
,
MIR-195
,
MIR-200a
,
MIR-335, mir424
) og 7 ble oppregulert (
MIR-100
,
MIR-199A
,
MIR -296
,
MIR-29a
,
MIR-29c
,
MIR-99a, mir-494
). Interessant, rapporterer vi 56 mirnas som ikke tidligere har blitt funnet deregulerte i eggstokkreft (figur 3B).
Forut genet mål av miRNA gener
mirnas kan regulere et stort antall mål gener og flere databaser basert på ulike algoritmer er tilgjengelige for å forutsi målene for utvalgte miRNAs. Target Scan 3.0 og PicTar ble brukt til å forutsi genet målene for de deregulerte mirnas identifisert i denne studien. Tabell 2 viser de 3 beste spådd mål i henhold til både Target Scan og PicTar for hver forskjellig uttrykt miRNAs. Det var lite overlapping mellom mål identifisert med de to ulike databaser og bare 7 mål (FAM44B, bach1, BCL6, HMGA2, Calu, FGF2, og TNKS2) for 7 mirnas (
la-7
familie,
MIR-98
,
MIR-155
,
MIR-195
,
MIR-346
,
MIR-206
,
MIR-335
) ble delt mellom disse to databasene når de 3 beste målene ble undersøkt.
Experimental identifisering av miRNA mål
for ytterligere å studere potensielle mål av nøkkel eggstokkene miRNAs, vi overexpressed
MIR-34c
,
MIR-98
,
MIR-424
, og
la-7F
i 2 eggstokkreft cellelinjer (BG -1 og UCI-101).
MIR-424 Hotell og
la-7F
ble nedregulert i både vev og cellelinjer (figur 3a), mens
MIR-34c Hotell og
MIR-98
ble funnet nedregulert i eggstokkreft vev og i cellelinjer, henholdsvis. Figur 4 viser den vellykkede over-ekspresjon av de mirnas 72 timer etter transfeksjon. Vi deretter brukt Illumina mikromatriser å undersøke mRNA endringer nivå etter overekspresjon av disse kandidatene. Tabell 3 og 4 listen transkripsjoner som ble mest betydelig endret etter over-uttrykk for miRNAs i BG-en og UCI-101 cellelinjer, henholdsvis. Interessant, disse tabellene omfatter gener som
GPX3, MCM7, MSN Hotell som tidligere har vært innblandet i eggstokkreft. Blant de betydelig endrede gener (absolutt Z-ratio 1.5), er det 10 kjente kreftgener (
MSN, PIM1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1
), 4 tumor suppressor gener (
HIF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP
), 26 cellesyklusgener (
ACAT2, cdk5, FDPS, ID1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, SKP2, SNRPA1, VAMP8, WEE1
), og 6 gener involvert i kromatin remodellering (
ASF1A, GCN5L2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3
). Svært lite overlapping ble funnet mellom den forutsagte (Pictar og Target Scan) og eksperimentelle mål. Interessant, de eksperimentelle målene variert i henhold til den cellelinje som brukes, noe som tyder på en signifikant påvirkning av den molekylære bakgrunnen på miRNA mål valg. For å validere Illumina data, ble RT-PCR utføres på 8 gener funnet å være mål for
la-7F product: (
KIF1A, ASS, FDPS, NTS
i UCI-101 celler, og
TFF1, EEF1A2, ESM1, VIM
, i BG-1 celler) (figur 5). Vi har funnet at, mens de absolutte verdier var forskjellig, utviklingen var de samme.
KIF1A Hotell og
ASS
ble funnet forhøyet i UCI-101, mens
FDPS Hotell og
NTS
ble nedregulert i disse cellene.
TFF1 Hotell og
EEF1A2
ble bekreftet å være forhøyet i BG-1, mens
ESM1 Hotell og
VIM
ble nedregulert.
pre-
MIR-34c
,
Forhånds MIR-98
, pre-
MIR-424
, pre-
la-7F
ble overuttrykt i BG-en og UCI-101. Produktene for hver av mirnas er vist i duplikat for de to cellelinjene som ble brukt. Betydelig overekspresjon av miRNAs er bekreftet. RT-PCR av 18S RNA er vist for hver betingelse for å demonstrere lik belastning.
Avskrifter identifisert ved Illumina matriser til å bli endret ved la-7F overekspresjon er validert av RT-PCR. Brett endringer for gener
KIF1A, ASS, FDPS, NTS product: (i UCI-101 celler), og
TFF1
,
EEF1A2, ESM1, VIM product: (i BG-1 celler) blir vist, og bekrefte endringene identifisert av Illumina arrays.
ved hjelp av disse eksperimentelle målene som utgangspunkt (tabell 3 og tabell 4), brukte vi Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å avsløre mulige sykdommer , molekylære funksjoner, fysiologiske systemer, og kanoniske veier assosiert med ekspresjonen av disse mirnas i BG-1 (tabell 5) og UCI-101 (tabell 6). Ikke overraskende analyse identifiserte «cancer» som hovedsykdom assosiert med disse mønstrene av ekspresjon i begge cellelinjer. GI sykdom ble også ofte identifisert. Interessant, cellulær bevegelse, cellesyklus, og kardiovaskulære funksjoner ble systemer ofte funnet å være relatert til disse uttrykk mønstre. Det var lite konsistens i de kanoniske veier er identifisert gjennom IPA og med unntak av integrin-signalisering (funnet følgende miR34c eller miR98 ekspresjon i BG-1), vil ingen av de kanoniske banene ble funnet mer enn én gang i tabellene 5 og 6. Denne analysen tyder derfor på at mens de generelle trasé påvirket av
MIR-34c
,
MIR-98
,
MIR-424
, og
la-7F
uttrykk i disse to cellelinjer er relatert til kreft, de eksakte molekylære reaksjonsveier målrettet er variabel og avhenger av cellelinjen og på mirnas. Dette igjen peker på den høye kompleksiteten av miRNA mål utvalg og regulering.
Bilder
Diskusjoner
Tidligere arbeid har vist at spesifikke miRNA uttrykket signaturer i forskjellige humane kreftformer kan være forbundet med diagnose, prognose og behandling reaksjon [27]. Videre har det blitt foreslått at bestemte mirnas kan ha viktige roller i initiering og /eller progresjon av humane cancere gjennom deres effekter på ulike molekylære reaksjonsveier. En bedre forståelse av miRNA uttrykket i kreft kan avdekke nye molekylære stier, eller nye mekanismer for aktivering for kjente veier. Bruke Exiqon miRNA array, den mest omfattende miRNA utvalg tilgjengelig, har vi fått miRNA uttrykk signaturer i eggstokkreft og identifisert flere mirnas forskjellig uttrykt i ovarialcancer vev og cellelinjer, samt mulige mål for flere av disse miRNAs.
Vi har identifisert totalt 70 mirnas deregulert i eggstokkene vev og 14 av disse ble også abnormt uttrykt i eggstokkreft cellelinjer (figur 3A). Totalt sett var det relativt få mirnas funnet i felles mellom denne studien og tidligere studier (Figur 3B). Det er flere mulige forklaringer på dette avviket. Først matrisen plattformen som brukes for identifikasjon av miRNA er forskjellige og kan gi forskjellige mønstre. For det andre materialet vi anvendes som normal kontroll er annerledes enn det som ble brukt i tidligere studier, og valget av normal er kjent for å påvirke utfallet av genet profilering analyse [28]. Vi brukte udødelig eggstokkene overflaten epitelceller mens to av de tre andre miRNA eggstokkene studier brukt hele eggstokkene. Vi tror at hele ovarian bulk vev er ikke den mest hensiktsmessige normal kontroll som eggstokk er sammensatt av flere celletyper, og at epitelet utgjør bare en liten brøkdel av den ovarievev. Bruken av en immortalisert celle belastningen har også ulemper, men vi tror det skal være en bedre tilnærming av normale eggstokkene epitelvev enn blandingen til stede i hele eggstokkene. I alle fall er det uavhengig validering av uttrykk mønstre avgjørende, uavhengig av kilden til normalt vev eller svulster brukt i studien.
Vi identifiserer
la-7F
som svært nedregulert i både celle linjer og tumorer. Uttrykk av ulike
la-7
mirnas har blitt rapportert å bli nedregulert i brystkreft [7], lunge kreft [29], skjoldbruskkjertelkreft [11], prostata kreft [13], og eggstokkreft [15 ] – [17]. En sammenheng mellom
la-7
downregulation og dårlig prognose har blitt rapportert i human lunge [29] og brystkreft [7]. Oppdagelsen av at
la-7
familie av miRNAs regulerer uttrykket av RAS onkogen familien gir en potensiell molekylære grunnlaget for rollen som
la-7
mirnas i human kreft [20].
la-7
anses derfor å være en svulst suppressor miRNA og interessant,
la-7
gener kart til loci slettet i flere typer kreft, inkludert kreft i eggstokkene [20]. I tillegg
la-7f
er blitt rapportert å fremme angiogenese ved å målrette mot anti-angiogene gener [30]. Den nåværende arbeid samt en tidligere rapporter [15] – [17] viser at medlemmer av
la-7
familien er endret på eggstokkreft tyder på at
la-7
kan representere en viktig spiller i denne sykdommen. Det vil være viktig å identifisere
la-7
nedstrøms mål som er relevante for eggstokkreft tumorigenesis.
Den mest konsekvent og høyt oppregulert miRNA i både vev og eggstokkreft cellelinjer var
MIR-221 product: (tabell 2).
MIR-221
har vist seg å være sterkt oppregulert i bukspyttkjertel kreft [12], i glioblastom [31] og er implisert i kreft i skjoldbrusk [32].
MIR-221
har vist seg å målrette onkogen KIT [33] samt tumor suppressor p27kip1 [34].
Mens
MIR-21
overekspresjon har vært observert i en rekke kreftformer, inkludert glioblastom [31], brystkreft [7], [35], lungecancer [8], bukspyttkjertelkreft [36], humane ondartede cholangiocyte cellelinjer [37] og tykktarmskreft [38], har vi funnet dette genet sterkt nedregulert i våre prøver. Som et spørsmål om faktum,
MIR-21
var den mest betydningsfulle downregulated miRNA i eggstokkreft når våre data ble gjennomsnitt på tvers av alle prøvene og cellelinjer. Våre funn er bakvendt siden det har blitt funnet at
MIR-21
nedregulering var assosiert med økt apoptose og nedsatt celleformering [35].
MIR-21
ble foreslått å fungere som et onkogen moduler tumorigenesis gjennom regulering av gener som BCL2 [35], PTEN [37] og PDCD4 [39]. Vi undersøker de mulige målene for
MIR-21
i våre celler, samt de mulige årsakene bak sin downregulation i vårt system. Det er mulig at målene for visse mirnas kan være vev-spesifikk, som skulle forklare forskjeller i rollene som ulike miRNA i ulike vev.
Andre mirnas funnet forskjellig uttrykt i både vev og cellelinjer er
MIR-146b
,
MIR-508
,
MIR-106b
,
MIR-134
,
MIR-155
,
MIR-346
,
MIR-422A
,
MIR-424
,
MIR-519a
,
MIR-648
,
MIR-662
. Flere av disse mirnas har vært innblandet i den andre ondartede sykdommer, eller ved regulering av vekst og apoptose. For eksempel
MIR-134
downregulated cellevekst, og
MIR-155
økt cellevekst i lungekarsinom celler, A549 [40]. Bidrag av hver av disse spillere til ovarial tumorigenesis gjenstår å bli bestemt.
MIR-34c
er nylig blitt vist å være en transkripsjons mål av p53 [41], [42] og kan undertrykke spredning og kolonidannelse i soft agar i neoplastiske epitelovarialcancer celler [42]. Interessant, fant vi
MIR-34c
deregulert i eggstokkreft vev og dette funnet tyder på at
MIR-34c
kan spille en rolle i eggstokkene tumorigenesis gjennom sin rolle i p53 veien.
på grunn av den vev-spesifisitet av de mirnas, forskjellige sett av mirnas er sannsynlig å være oppregulert eller nedregulert i kreft i forskjellige cellulære opprinnelse, selv om det har blitt rapportert at miRNA signaturer av forskjellige krefttyper, spesielt epitelceller ville dele noen individuelle mirnas [ ,,,0],38]. Av de mirnas som ble rapportert her for å bli forskjellig uttrykt i eggstokkreft, flere har blitt tilsvar deregulert i andre kreftformer. Overall, 31 mirnas identifisert i denne studien har også blitt rapportert de-regulert i annet kreft (data ikke vist). Videre 16 mirnas identifisert her, er blitt rapportert å bli forandret i kreft i eggstokkene (figur 3b). Mer interessant, identifiserer vi 56 mirnas som ikke tidligere har blitt funnet forskjellig uttrykt i eggstokkreft. Disse miRNA kan spille en rolle i eggstokkene tumorigenesis og blir nå etterforsket.
For å identifisere potensielle mål av forskjellig uttrykt mirnas i eggstokkreft vi søkte to store databaser, PicTar og Target Scan. Vi fant ut at det var svært lite overlapping mellom de antatte målene for hver algoritme. Faktisk, bare 7 (FAM44B, bach1, BCL6, HMGA2, Calu, FGF2, og TNKS2) predikerte mål ble delt mellom disse to databasene. Dette resultatet viser de veldokumenterte problemer med å forutsi mål for miRNA [43]. Dessuten er det mulig at målene kan være avhengig av mobilnettet miljø, (relative prosenter av ulike potensielle mål kan påvirke de mest sannsynlig til å bli nedregulert) legger til et annet lag av kompleksitet i miRNA mål utvalg. For å eksperimentelt undersøke endringer i mRNA nivåer, vi over-uttrykt 4 forskjellige miRNA kandidater (
MIR-98
,
MIR-424
,
MIR-34c Hotell og
la-7F
) i 2 cellelinjer og utlignet transkripsjonsnivåer ved hjelp av en Illumina oligonukleotid array. Åpenbart kan denne metoden bare identifisere miRNA mål som har endret mRNA-nivåer (i motsetning til oversettelse hemming mål), men det har tidligere vært vist at mirnas kan nedregulere nivåene av et stort antall transkripter [44]. Mens noen av vitnemål endrede kan ikke representere direkte mål for den tilsvarende miRNA, kan ytterligere analyse av enkeltkandidat mRNA gi bevis om hvorvidt de representerer ingen direkte eller sekundære mål. Oppfinnsomhet Pathway Analyse av målene avdekket en rekke stier og system potensielt regulert av overuttrykte mirnas (Tabell 5 og Tabell 6). Interessant, den anslåtte trasé var ikke konsekvent mellom de 2 cellelinjer og igjen foreslo at miRNA målet valg, og derfor er miRNA funksjon svært vev avhengig.
Når de antatte mål (oppnådd med PicTar og Target Scan) ble sammenlignet med de eksperimentelle målene oppnås ved Illumina microarray, observerte vi ingen overlapping. Dette kan skyldes en rekke årsaker. For det første kan algoritmene for identifikasjon av miRNA mål fortrinnsvis identifisere mål som resulterer i translasjonsbevegelse undertrykkelse, som åpenbart ikke ville bli identifisert ved vår microarray eksperiment. Dessuten, som diskutert tidligere, er det sannsynlig at miRNA målene er vev-spesifikke. Etter avtale med denne muligheten er det faktum at de målene vi identifiserte eksperimentelt var helt annerledes i de to cellelinjene vi brukte. Interessant nok har de fleste av de høyt opp regulert og nedregulert (top 10) gener er allerede blitt rapportert å ha roller i kreft eller andre cellulære aktiviteter relatert til kreft (Tabell 3 og 4), så som GSTP1 [45], [46], HIF-1 [47], [48], og SGK [49].
i denne studien har vi identifisert mirnas forskjellig uttrykt i eggstokkreft. Som et første skritt i å bestemme sine roller i eggstokkene tumorigenesis, har vi begynt å identifisere mål av disse miRNAs. Vi viser at de forutsagte målene er forskjellig fra den eksperimentelle og den eksperimentelle mål varierer i henhold til den cellulære bakgrunn hvori mirnas er uttrykt. Det vil derfor være viktig å metodisk studere hver mirnas i flere modeller for å avklare sine roller i eggstokkreft. I tillegg er en kombinasjon av overekspresjon /konsentrert seg av miRNA sammen med protein array-teknologi vil være avgjørende for å identifisere miRNA: mRNA spillere av eggstokkreft. Bildet som sannsynligvis vil dukke opp er en svært komplisert sett av interaksjoner mellom miRNAs og målet mRNA. En bedre forståelse av disse banene vil bringe oss enda nærmere en forståelse av den molekylære mekanismen bak denne sykdommen, og forhåpentligvis til nye metoder for deteksjon og behandling.
Materialer og metoder
cellelinjer og vev Prøver
eggstokkreft linjer BG-1, UCI-101, HEY, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR2, OVCAR3 og OVCAR5 celler ble dyrket i McCoys 5A vekstmedium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum ( FBS) og antibiotika (100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin). Eggstokkreft cellelinje OV90 ble dyrket i MCBD 105 medium (Sigma) + Medium 199 (Invitrogen) supplert med 15% FBS og antibiotika. HOSE-B, en ovarial overflate epitelcellelinje udødeliggjort med E6 og E7 [50], ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, antibiotika og 5 ng /ml EGF. Atten frosne primære eggstokkreft ble oppnådd gjennom Samarbeids menneskelig vev Network gynekologisk Oncology Group (Barnas Hospital, Columbus, OH). I tillegg ble ni frosne primære eggstokkreft prøver og syv RNA prøver (fra primær eggstokkreft vev) hentet fra Avdeling for patologi ved Johns Hopkins Medical Institutions (Baltimore, MD). Histologisk klassifisering av alle vev er presentert i Tabell 1, og samtlige prøver ble funnet å inneholde større enn 80% kreftceller
RNA-ekstraksjon kvantifisering
Total RNA ble oppnådd ved bruk Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert og vurdert ved hjelp av RNA 6000 Nano Kit og 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, UK).
miRNA microarray hybridisering
miRCURY ™ LNA miRNA Arrays (Exiqon), bestående av kontroll sonder, mismatch prober og 1458 oppfangingsprober, perfekt matchet prober for alle miRNA i alle organismer som kommenterte i miRBase Slipp 8,1 juli 2006 (human miRBase 8.2 er også dekket) ble brukt i denne studien. De oppfangingsprober dekke 92,3% av miRNAs kommenterte i miRBAse 9.0. Kontroll sonder omfatter 10 pigg i kontroll sonder for å sikre optimal merking og hybridisering, åtte negative oppfangingsprober og tolv fange prober som hybridiserer til små kjernefysiske RNA. RNA merking og hybridisering ble gjennomført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, RNA fra hver prøve ble merket med Cy3 hjelp miRCURY ™ LNA miRNA Array merking kit. Etter merking ble prøvene lastet inn på microarray lysbilde og inkubert 16-18 timer ved 60 ° C.
