Abstract
Magekreft (GC) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall i verden. Rollen av histon deacetylase 4 (HDAC4) i spesifikke celletyper og vev er blitt identifisert. Men dens biologiske roller i utviklingen av magekreft forblir stort sett uutforsket. Kvantitativ sanntids-PCR (QRT-PCR) og western blot ble anvendt for å analysere ekspresjon av HDAC4 i de kliniske prøvene. siRNA og overekspresjon av HDAC4 og siRNA p21 ble brukt til å studere funksjonelle effekter i en spredning, en kolonidannelsen, en adenosin-5′-trifosfat (ATP) assay og reaktive oksygenarter (ROS) generasjon, cellesyklus, celle apoptose priser, og autophagy analyser. HDAC4 ble oppregulert i mage kreft vev og flere mage kreft cellelinjer. Spredning, kolonidannelse evne og ATP-nivå ble forbedret i HDAC4 overekspresjon SGC-7901 celler, men hemmet i HDAC4 knockdown SGC-7901 celler. HDAC4 knockdown førte til G0 /G1 fase celle arrest og forårsaket apoptose og ROS økning. Videre HDAC4 ble funnet å hemme p21 uttrykk i magekreft SGC-7901 celler. p21 knockdown dramatisk svekket celleproliferasjon hemming, cellesyklus arrest, celle apoptose forfremmelse og autofagi oppregulering i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler. Vi viste at HDAC4 fremmer magekreft celle progresjon mediert gjennom undertrykkelse av p21. Våre resultater gir et eksperimentelt grunnlag for forståelse av pro-tumor mekanisme av HDAC4 som behandling for magekreft
relasjon:. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histondeacetylase HDAC4 Fremmer Gastric Cancer SGC-7901 Cells Progresjon via p21 undertrykkelse. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10,1371 /journal.pone.0098894
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 12 februar 2014; Godkjent: 08.05.2014; Publisert: 04.06.2014
Copyright: © 2014 Kang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Helse Institutt for Jilin-provinsen (No. 2012z119). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. Asiatiske og søramerikanske land har en høyere forekomst av GC enn USA og Vest-Europa [2]. Mest målrettede terapier fokusere på vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) relaterte indikasjoner i avansert GC. Forbindelsene mot nye mål, slik som mTOR [3], c-Met (hepatocytt-vekstfaktor-reseptor) [4], og HDACs, er også under undersøkelse.
histondeacetylase 4 (HDAC4), som er en klasse Ila HDAC, er kjent for å eksistere i forskjellige transkripsjonelle corepressor komplekser. HDAC4 er en kritisk komponent i DNA skade respons sti som virker gjennom 53BP1 [5]. HDAC4 undertrykker ekspresjon av cyclin-avhengige kinase inhibitor p21 (også kjent som p21WAF1 /Cip1) i humane kreftceller gjennom en Sp1-avhengige, p53-uavhengig mekanisme [6]. HDAC4 fremmer veksten av tykktarmskreftceller via undertrykkelse av p21 [7]. Inaktivering av HDAC4 av små interfererende RNA eller HDAC hemmere undertrykker nevroncelledød [8].
Rollen HDAC4 i spesifikke celler (HeLa (livmorhalskreft), U373 (gliomer), OVCAR (eggstokkene), T98G ( glioma), HCT116 (kolorektal), NHA (astrocytic) og SKBR3 (bryst)) og vev (hjernebark, testikler, prostata, og den epidermale lag av huden) blir mer tydelig [9]. Imidlertid har den eksakte mekanismen for HDAC4 i magekreft ikke fastslått. Derfor er hensikten med denne studien var å vurdere første uttrykket nivåer av HDAC4 i human gastrisk cancer vev og cellelinjer. For det andre, ble effekten av HDAC4 på mage kreft cellelinjer undersøkt ved hjelp av overekspresjon og knockdown. Til slutt, vi undersøkt om HDAC4 hadde et forhold til p21 i mage kreftceller. Sammen vårt mål var å finne ut om HDAC4 har en biologisk rolle i GC utvikling og for å klargjøre den underliggende mekanismen.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Twenty-ni sammenkoblet primære magekarsinom vev og fjerne normale mage vev ble samlet fra pasienter (alder: 58.46 ± 9.17 år) under rutine terapeutisk kirurgi ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, det første sykehuset i Jilin University. Alle prøvene ble oppnådd med informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen og godkjent av Human Etisk komité i første sykehuset i Jilin-universitetet og Jilin University, Kina. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Cellelinjer og kultur
Den menneskelige magekreft cellelinjer SGC-7901, AGS, og BGC-823 og normal gastrisk epitel cellelinje GES var erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
Stabilt transfekterte cellelinjen og forbigående transfeksjon
full-lengde HDAC4 fragment ble amplifisert ved revers transkripsjon PCR fra GES celler ved hjelp av de spesifikke primere som tidligere beskrevet [10] og ført inn i BamH i og Hind III områder av pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). Den pcDNA3.1 (+) – HDAC4 plasmid ble verifisert ved sekvensanalyse for å bekrefte fraværet av mutasjoner. SGC-7901-celler ble sådd i 6-brønners plater og transfektert med pcDNA3.1 (+) – HDAC4 og pcDNA3.1 (+) – vektorer, henholdsvis ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til instruksjonene gitt av produsenten i 24 timer uten antibiotika utvalg. Deretter ble cellene dyrket i medium inneholdende 400 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO) inntil alle cellene i den ikke-transfekterte kontrollkultur ble drept.
SGC-7901 celler ble sådd på seks-brønns plater og deretter transfektert med ikke-måls siRNA eller siRNA rettet mot humant HDAC4 eller p21 (Santa Cruz) med Lipofectamine 2000 i henhold til instruksjonene fra produsenten. Strekk eksperimenter ble utført på celler 48 eller 72 timer etter transfeksjon.
RNA isolering og kvantitativ real time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert fra vev eller celler ved TRIzol reagens ( Invitrogen), og omvendt transkripsjoner ble utført ved hjelp av Takara RNA PCR kit (Takara, Dalian, Kina) etter produsentens anvisninger. Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av en SYBR Grønn Premiks Ex Taq (Takara, Japan) i en real-time PCR system (Eppendorf, Tyskland). Den relative uttrykk forholdet i hver sammenkoblet tumor og ikke-svulstvev ble beregnet ved 2
-ΔΔCT metode.
Celletelling kit-8 (CCK-8) assay
proliferations av SGC-7901 celler ble vurdert ved hjelp av en CCK-8 analysen (Beyotime, Jiangsu, Kina) i henhold til protokollen som anbefales av produsenten. I korthet ble cellene dyrket i et 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 2000 celler per brønn. På 0, 1, 2 og 3 dager etter transfeksjon, celle proliferasjonsanalyse ble utført ved tilsetning av 10 ul CCK8 løsning til hver brønn, fulgt av inkubering ved 37 ° C i 2 timer. Absorbans ble målt ved en ELISA-leser med en bølgelengde på 450 nm.
kolonidannelse assay
I korthet ble HDAC4-overekspresjon og -knockdown SGC-7901-celler sådd i tre eksemplarer (1000 celler per 60 mm kulturskål) og inkubert ved 37 ° C i to uker for å danne kloner. Cellene ble vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, og farget med krystallfiolett (0,5% krystallfiolett, 1% paraformaldehyd og 20% metanol i PBS) i 30 min. De kolonier på hver plate ble telt, og celleoverlevelse ble uttrykt som en prosent av antall overlevende kolonier på kontrollplatene.
cellesyklusanalyse
Cellene ble høstet og forsiktig resuspendert i enkeltcellesuspensjoner i Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) buffer (PBS inneholdende 2% FBS). Cellene ble vasket to ganger med PBS og fiksert i kald 70% etanol over natten. Cellene ble deretter vasket to ganger med kald PBS, resuspendert i RNase A løsning og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Suspensjonen ble tilsatt til 0,05 mg /ml propidiumjodid (Beyotime) etterfulgt av inkubering ved 4 ° C i 30 minutter og analyse ved hjelp av FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
celle apoptose assay
Propidiumiodide (PI, 1 pg /ml) og Annexin V-FITC (1 pg /ml) ble anvendt for bestemmelse av celle apoptose. I korthet ble cellene trypsinert og inkubert med PI og Annexin V-FITC i 15 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble påvist ved anvendelse av en FACS Calibur strømningscytometer. Alle eksperimenter ble utført in triplo.
Intracellulær adenosin-5′-trifosfat (ATP) nivåer assay
Intracellulær ATP-nivåene ble analysert ved hjelp av bioluminescens [11]. I korthet ble cellene lysert og sentrifugert ved omtrent 15.000 g i 10 min ved 4 ° C. Supernatantene ble deretter blandet med en ATP-testblanding arbeidsløsning (Sigma), og mengden av lys som sendes ut umiddelbart ble målt med et luminometer (Thermo Scientific Luminoskan oppstigning, Walthan, MA). De luminescens data ble normalisert ved prøven protein mengder (målt ved hjelp av en BCA assay).
reaktive oksygenforbindelser (ROS) måling
Generering av intracellulær ROS ble undersøkt ved hjelp av 6-karboksy-2 « , 7 «-dichlorofluorescein diacetate (H
2DCFDA). I korthet, 5 x 10
4 celler ble sådd ut i 60-mm skåler og fikk feste seg over natten. Cellene ble farget med 5 uM H
2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C og deretter oppsamlet, og fluorescensen ble analysert med en fluorescens-spektrometer (Flex StationII 384, Molecular Devices) ved 485 nm (eksitasjon) og 538 nm ( utslipp). Cellular oksiderende nivåer ble uttrykt som relativ DCF fluorescens per sample protein mengder (BCA-metoden). I noen forsøk ble celler forbehandlet med 10 mM
N
acetylcysteine (NAC) forut for analysen av ROS generasjon.
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i IP- lysis buffer (Beyotime), denaturert i 10 minutter ved 95 ° C, skåret med en insulinsprøyte, og vedtok SDS /PAGE-geler. Etter immunoblotting ble membranene blokkert og inkubert med primære antistoffer i PBS /0,1% Tween-20 med 5% fettfri tørrmelk. Antistoffer rettet mot HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, Atg 7, Caspase 3, 9, Bcl-2, Bax og anti-β-aktin ble alle innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Kjemiluminescens deteksjon ble analysert ved hjelp av en ECL deteksjon kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Resultatene ble analysert ved anvendelse av Mengde En programvare for å oppnå den optiske tetthetsforhold av målproteinet p-aktin.
Immunofluorescence
Cellene ble sådd ut på dekkglass, fiksert med 4% paraformaldehyd (Sigma- Aldrich) i 10 minutter og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 /PBS. Cellene ble blokkert med 1% BSA i 1 time, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C med anti-LC3 antistoff, og deretter ble cellene inkubert med FITC-konjugert sekundært antistoff (Beyotime) i 1 time. Kjernene ble farget med 4,6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Sigma). Fluorescensen avbildning ble visualisert ved anvendelse av en konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Statistisk analyse
Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. Statistisk signifikans ble beregnet ved en-veis analyse av varians (ANOVA) eller ved t-test mellom de to gruppene ved bruk av GraphPad Prism 5 statistisk programvare.
P
verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
HDAC4 uttrykk var oppregulert i mage kreft vev og cellelinjer
Først må vi analysert HDAC4 uttrykk i tjueni paret magekreft og tilstøtende ikke-tumorvev ved QRT-PCR-analyse og western blot. Vi fant ut at HDAC4 var signifikant oppregulert i gastrisk karsinom vev (figur 1A, B og C,
** P
0,01,
*** P
0,001). I tillegg flere magekreft cellelinjer ble også analysert. Vi observerte høyere uttrykk av HDAC4 i tre magekreft cellelinjer (AGS, BGC-823 og SGC-7901), sammenlignet med en normal gastrisk epitel cellelinje (GES) (Tall 1D og E,
* P
0,01). Derfor våre resultater viste at HDAC4 uttrykk var oppregulert i både mage kreft vev og cellelinjer.
mRNA og proteinnivåer HDAC4 ble analysert ved kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og western blot i normalt vev (NOR) eller magekreft vev (GC) (A) og (B) (n = 29). Densitometrisk analyse av HDAC4 i fig. 1B (C). MRNA og proteinnivåene av HDAC4 ble analysert i normale gastriske epitel-celler (GES celler) og flere gastrisk kreft-cellelinjer, blant annet AGS, BGC-823 og SGC-7901-celler (D) og (E) (n = 4). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
* P
0,05,
** P
0,01,
*** P .
0,001
Den HDAC4 uttrykk var vellykket ned- eller oppregulert i SGC-7901-celler
A pcDNA3.1 (+) ekspresjonsvektor ble brukt til å overuttrykke HDAC4 i SGC-7901-celler for å undersøke dens effektivitet som en vekstregulator. Etter stabil transfeksjon, uttrykk for HDAC4 mRNA nivåer var mer rikelig i pcDNA3.1 (+) – HDAC4 celler enn i de ikke-transfekterte celler eller negativ kontroll (NC) SGC-7901 celler (figur 2A,
** * P
. 0,001), som var i samsvar med resultatet av western blot analyse (figur 2B)
HDAC4 uttrykk ble bestemt i SGC-7901 celler transfektert med tom vektor (NC) eller HDAC4 (A ) og (B). HDAC4 ble bestemt i SGC-7901 celler transfektert med siRNA oligos målgruppe HDAC4 (si-HDAC4) eller egge siRNA (SI-NC) ved QRT-PCR og western blot (C) og (D) (n = 4). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
*** P .
0,001
For å vurdere gen-lyddemping effekt av menneskelig HDAC4-siRNA, ble omfanget av HDAC4 protein uttrykk målt etter HDAC4-siRNA transfeksjon og en 48-timers inkubasjonstid i human magekreft cellelinje SGC-7901. Real-time PCR-analyse viste at HDAC4 siRNA infeksjon resulterte i 36,3% knockdown av HDAC4 mRNA nivåer (figur 2C,
*** P
0,001). Western blot analyse viste at HDAC4 protein ble signifikant redusert (figur 2D), i samsvar med dens mRNA-reduksjon. Samlet utgjør disse resultatene at det HDAC4 siRNA kunne gi en betydelig undertrykke endogen HDAC4 uttrykk.
HDAC4 fremmet celleproliferasjon og kolonidannelse
Deretter undersøkte vi effekten av HDAC4 på cellevekst. Celleproliferasjon ble undersøkt ved hjelp av celletelling kit-8 (CCK-8) på tidspunkter på 24, 48 og 72 timer. Vekstkurvene viste at når HDAC4 var overekspresjon i SGC-7901-celler, ble celleveksten økte med 1,5 ganger sammenlignet med kontrollgruppen på dag 3 (figur 3A,
* P
0,05,
∧∧P
0,01). I tillegg vises det kolonidannelsesbestemmelsen en dramatisk økning på 2 ganger i koloninummer ved SGC-7901-celler ble transfektert med pcDNA3.1 (+) – HDAC4 i forhold til NC gruppen (figurene 3B og C,
** P
. 0,01)
vekstkurve (
* P
0,05 og
∧∧P
0,01 sammenlignet med NC-gruppen) (A), klon formasjon (B) og (C) og den relative ATP-nivå og ROS generasjonen (G) i SGC-7901-celler transfektert med tom pcDNA3.1 (+) – vektor (NC) eller HDAC4. Vekstkurven (
∧P
0,05 sammenlignet med SI-NC gruppe) (D), klone dannelse (E) og (F) i SGC-7901 celler transfektert med siRNA oligos målgruppe HDAC4 (si-HDAC4) eller med egge siRNA oligo (si-NC). Effekten av antioksidant
N
acetylcysteine (NAC) på relativ ATP-nivå og ROS generasjon i SGC-7901-celler transfektert med si-NC eller Si-HDAC4 (H). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
* P
0,05,
** P
0,01,
∧P
0,05,
∧∧P.
0,01
Vi undersøkte også effekten av HDAC4 ned-regulering i SGC-7901 celler. CCK-8-analysen og kolonidannelse analysen viste at HDAC4 nedreguletrykt spredning evne (Figur 3D,
∧P
0,05) og kolonidannelse antall SGC-7901 celler (figur 3E og F,
** P
0,01). Oppsummert disse dataene antydet at HDAC4 kan være en vekst promoter i SGC-7901 celler.
HDAC4 økt ATP nivåer og redusert ROS generasjon
En økning i ATP nivåer i HDAC4 overekspresjon celler var observerte forhold til NC SGC-7901 celler (figur 3G,
* P
0,05). Videre ble ATP nivået redusert i HDAC4 knockdown celler (figur 3 H,
* P
0,05).
Fordi intracellulær ROS generasjon kan være relatert til mitokondriell dysfunksjon, vi videre undersøkt om HDAC4 kan stimulere ROS generasjon i SGC-7901 celler. Resultatene viser at en betydelig reduksjon av ROS generasjon ble observert i pcDNA3.1 (+) – HDAC4 SGC-7901 celler i forhold til NC SGC-7901 celler (Figur 3G,
∧P
0,05). I mellomtiden stanse av HDAC4 aktivert robust ROS generasjon i SGC-7901 celler (figur 3 H,
** P
0,01). Blokkering ROS produksjon ved hjelp av antioksidanten NAC betydelig hemmet ROS generasjon (figur 3 H,
∧P
0,05). Denne blokkering av ROS generasjon ved forbehandling av cellene med NAC også markert forhindret ATP tap i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (Figur 3 H,
∧P
0,05).
Ned -regulated HDAC4 uttrykk arrestert celler i G0 /G1 fase
nedregulering av HDAC4 viste en klar økning i andelen av celler i G0 /G1 fase (78,74% mot 49,92% i NC-siRNA gruppe). Det var også en tilsvarende reduksjon i antallet av celler i S-fasen (12,94% mot 34,61% i NC-siRNA gruppe) (figur 4A). De kvantifisere cellesyklusdistribusjons resultatene ble vist at HDAC4 knockdown betydelig indusert SGC-7901 celler G0 /G1 arrest og S fag hemming (figur 4B,
* P
0,05,
** P
0,01). Derfor er disse funnene tyder på at det HDAC4 nivået kunne regulere cellesyklusprogresjon.
Strømningscytometri-analyse avbildet cellesyklusprogresjon SGC-7901 celler etter knockdown av HDAC4 (A) og cellesyklus profiler ble analysert for å kvantifisere celle syklus fordeling (B). De SGC-7901-celler transfektert med egge kontroll (Si-NC) eller HDAC4 siRNA oligoer (Si-HDAC4) apoptose ble evaluert ved flow cytometri ved hjelp av Annexin V-FITC /PI (C). Ekspresjon av pro- og anti-apoptotiske proteiner og caspaser 3 og 9 ble analysert ved Western blot (D). Cellene ble immunfarget med anti-LC3 antistoff (FITC, grønn), og kjerner ble merket med DAPI (blå) og analysert ved konfokal mikroskopi (E). Western blot-analyse av Atg7, Beclin 1 og LC3 protein ekspresjonsnivåene i SGC-7901-celler transfektert med egge kontroll (Si-NC) eller HDAC4 siRNA oligoer (Si-HDAC4) behandlet med eller ikke med 3-MA (F). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
* P
0,05,
** P .
0,01
Den nedregulert HDAC4 uttrykk indusert apoptose og autofagi
For å studere hvorvidt den nedregulert HDAC4-indusert cellevekst inhibering ble relatert til celle apoptose, ble effekten av nedregulert HDAC4 på celle apoptose evaluert ved flow cytometri ved hjelp av Annexin V-FITC /PI dobbel farging. Det ble observert at apoptose økte markert i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA gruppe (Figur 4C). Vi bekreftet videre induksjon av apoptose gjennom aktivering av kaspase-3 og 9 ved western blot. Analysen viste at nedregulert HDAC4 øket spaltning av caspaser-3 og 9, sammenlignet med NC-siRNA-gruppe. Ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2 og den pro-apoptotiske protein Bax ble også kvantifisert. Forholdet Bax /Bcl-2 var signifikant økt i HDAC4-siRNA SGC-7901-celler når sammenlignet med NC-siRNA gruppe (figur 5D).
Ekspresjon av p21 ble analysert ved hjelp av western blot i SGC-7901-celler transfektert med tom pcDNA3.1 (+) – vektor (NC) eller HDAC4 og egge siRNA kontroll (Si-NC) eller HDAC4 siRNA oligoer (Si-HDAC4) henholdsvis (A). Den p21 mRNA-nivået ble analysert ved QRT-PCR i SGC-7901-celler transfektert med Si-NC, si-HDAC4 alene eller i kombinasjon med siRNA p21 (Si-P21) (B). Cellevekstkurven ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse (
* P
0,05 sammenlignet med Si-NC-gruppe,
∧∧P
0,01 sammenlignet med Si-HDAC4 gruppe) (C) . De relative ATP-nivåer og ROS generasjon (D). Den cellesyklusanalyse (E, F). Apoptose ble analysert ved western blot (G) og strømningscytometri ved bruk av henholdsvis Annexin V-FITC /PI (H). Autophagy ble vurdert ved immunofluorescens (I) og western blot (J) i henholdsvis SGC-7901-celler transfektert med Si-NC, si-HDAC4 alene eller i kombinasjon med si-P21. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
* P
0,05.
** P
0,01,
*** P .
0,001
For å undersøke om nedregulert HDAC4 indusert autofagi i SGC-7901 celler, vi først undersøkte den intracellulære lokalisering av LC3 i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler ved immunfluorescens analyse ved hjelp av fluorescerende antistoffer mot LC3. Den spesifikke Punktum fordeling av endogen LC3 ble observert som punctate prikker av grønn fluorescens i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA gruppe (figur 4E), noe som indikerer at autofagi ble indusert som et middel for å overleve. Den subcellulære fordeling av LC3 ble betydelig hemmet av autofagi-spesifikk hemmer 3-MA i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (Figur 4E). Deretter ble Autophagy relaterte proteiner Atg7, Beclin 1 og forholdet mellom LC3-II til LC3-I ble analysert ved western blot. Vi observerte at uttrykket nivåer av Atg7, Beclin en og LC3-II var alle signifikant økt i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA gruppe (Figur 4F). Den Atg7, Beclin 1 og forholdet mellom LC3-II til LC3-I avtatt betydelig i HDAC4-siRNA SGC-7901-celler som ble behandlet med 3-MA sammenlignet med NC-siRNA gruppe (figur 4F).
den nedregulert HDAC4 ekspresjon hemmet cellevekst gjennom p21 oppregulering
på grunn av at behandling av humane cancerceller med HDAC-inhibitorer konsekvent fører til oppregulering av p21-ekspresjon, en cyklin-avhengig kinase-inhibitor som er et veletablert mål av HDAC hemmere [6], [7], [12], forsøkte vi å finne ut om overekspresjon eller knockdown av HDAC4 kan påvirke p21 regulering og å spekulere mekanismen for HDAC4-mediert vekst opprykk i magekreftceller.
Som vist i figur 5A, opp-regulering av HDAC4 dramatisk førte til redusert p21-protein ekspresjon. I motsetning til dette, HDAC4 nedregulering førte til økt p21-ekspresjon (figur 5A). Vi undersøkte om p21 knockdown kan påvirke cellevekst og apoptose i SGC-7901 celler der HDAC4 ble slettet. De SGC-7901 celler ble ko-transfektert med siRNA HDAC4 og siRNA p21. Den p21 mRNA nivået ble betydelig redusert i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler etter p21 knockdown (figur 5B,
** P
0,01,
*** P
0,001). p21 knockdown dramatisk svekket celleproliferasjon hemming i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (figur 5C,
* P
0,05, ∧∧
P
0,01). ATP-nivået ble øket, men intracellulær ROS generasjon redusert i siRNA-p21-HDAC4 gruppen sammenlignet med siRNA HDAC4 gruppen (figur 5D,
* P
0,05,
** P
0,05). Immunoblotting viste at mengden av Bcl-2 var betydelig høyere, men Bax var lavere i siRNA-p21-HDAC4 celler (Figur 5G). Cellen apoptose avtatt betydelig i siRNA-p21-HDAC4 SGC-7901 celler sammenlignet med siRNA HDAC4 gruppen (Figur 5H). Det ble også observert at p21 knockdown kunne redde økt autofagi krydres fluorescerende flekker (figur 5i) og ATG 7, Beclin en og LC3II proteiner uttrykk i SGC-7901 celler indusert av siRNA HDAC4 (Figur 5J). Sammen er disse dataene indikerte at nedregulering av p21 kan etterligne effekten av HDAC4 overekspresjon og kan være en viktig mediator i HDAC4-mediert SGC-7901 cellevekst opprykk.
Diskusjoner
Mange HDAC -inhibitorer, som har vært vist å hemme proliferasjon og indusere differensiering eller apoptose i tumorceller, blir undersøkt i kliniske forsøk, enten som anti-kreftmidler, eller i forbindelse med annen behandling [13]. Høy ekspresjon av HDAC1 /2 ble funnet i magekarsinom vev [14]. I vår studie, viste vi at HDAC4 uttrykk var oppregulert i mage kreft vev og cellelinjer
in vitro
. HDAC4 ned-regulering i SGC-7901-celler undertrykkes den celleproliferasjon og de kolonidannelsen tall, stanset cellesyklus og indusert celle apoptose avhengig av aktivering av kaspaser 3 og 9, som er i samsvar med de anti-proliferative og proapoptotiske virkninger av HDAC-inhibitorer i humane kreftcellelinjer [15] og med den tidligere rapportert observasjonen at HDAC4 nedregulering reduserer klonogene overlevelses og induserer apoptose i HeLa-celler [5]. Den proproliferative effekten av HDAC4 i mage kreftceller er i samsvar med det som er rapportert tidligere for klasse I HDACs, HDAC1, -2 og -3 [16]. Dermed rettet mot hemming av HDAC4 aktivitet kan være en potensiell terapeutisk tilnærming for å behandle magekreft.
Autophagy er egentlig et protein degradering system av cellens egne lysosomer. En rekke av spenningssignaler, slik som nærings sult eller behandling med andre anticancermidler, stimulerer autophagy prosessen [17]. Autophagy er generelt karakterisert ved nærvær av autophagosomes og en økning i kløyving av LC3 [18]. Rollen til autophagy i prosessen med celledød er kontroversiell, men det er blitt bekreftet at krysstale mellom apoptose og autofagi er viktig i programmert celledød [19]. I vår studie ble induksjon av autophagy i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler dokumentert av Punktum mønster av LC3 farging og akkumulering av biokjemiske kjennetegn proteiner av autofagi (Atg7, Beclin en og LC3) av western blot analyse. Autophagy hemming av inhibitor 3-MA svekket den autophagy induksjon i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler. Således, spekulerte vi autophagy oppstått kan beskytte SGC-7901 cancerceller apoptose indusert ved HDAC4 knockdown.
p21 protein, også kjent som cyklin-avhengige kinase (CKD) inhibitor 1, regulerer G1 fase progresjonen av cellesyklusen . p21 er ofte mis-regulert i humane kreftformer, og det kan fungere som en tumor suppressor eller som et oncogen [20]. De med p21-positive og p53-negative kreftformer har betydelig høyere overlevelseskurver i gastrisk karsinom [21], mens tapet av p21 ekspresjonen sammen med økt p53 deteksjon er assosiert med dårlig prognose og redusert total overlevelse i magekreft [22]. I samsvar med det resultat at p21-protein ble nedregulert i magekreft vev [23], observerte vi at HDAC4 fremmer gastrisk cancer celleproliferasjon og vekst mediert av undertrykkelse av p21 i magekreftceller, og er ledsaget av en økning i ATP-nivåer og undertrykkelse av ROS generasjon. Derfor har vi undersøkt om p21 var en viktig mediator for HDAC4-mediert SGC-7901 cellevekst opprykk. I denne studien HDAC4 knockdown signifikant induserte økt ekspresjon av p21-proteinet, mens HDAC4 overekspresjon betydelig redusert ekspresjon av p21-proteinet i SGC-7901-celler. Disse data underforstått at p21 kan være et nedstrøms mål for HDAC4. Funksjonelle analyser viste nedregulering av p21 kunne etterligne virkningen av HDAC4 overekspresjon på SGC-7901 cellevekstfremming. Samlet utgjør disse resultatene antydet at HDAC4 nedregulering kan fremme SGC-7901 celle apoptose med opp regulerende p21 uttrykk. p21 kan være en tumor suppressor i utvikling og progresjon av magekreft, kan ekspresjonen av hvilken hjelpe til i å kontrollere en rekke ondartede atferd av magekreft. Men potensialet relevansen av HDAC4 regulering av p21 uttrykk må også ses i sammenheng med at det er flere viktige faktorer og stier som potensielt modulerer uttrykk for p21 i magekreft.
Til sammen våre funn har avslørte en viktig rolle for HDAC4 i å kontrollere SGC-7901 utvikling humane magecancercellelinje via regulering av p21, noe som antyder at endring av HDAC4 ekspresjon og /eller aktivitet, kan være en viktig hendelse i løpet av magekreft. I konklusjonen, disse funnene identifisere HDAC4 som en viktig regulator av spredning av magekreft gjennom undertrykkelse av p21
in vitro
.
