Abstract
Transforming growth factor (TGF) -β /Smad signale spiller en viktig rolle i tykktarm kreft utvikling, progresjon og metastasering. I denne studien viste vi at mikroRNA-130a /301a /454 familien er oppregulert i tykktarm kreft vev i forhold til paret ved normal slimhinne, som har samme 3′-untranslational region (3′-UTR) binding frø sekvens og er betinget å målrette Smad4. I kolorektal kreft HCT116 og SW480 celler, overekspresjon av miRNA-130a /301a /454 ligner forbedrer celleproliferasjon og migrasjon, mens hemmere av disse mirnas påvirke celle overlevelse. Den biologiske funksjon av miRNA-130a /301a /454 på tykktarmskreftceller blir sannsynligvis formidlet ved undertrykkelse av Smad4, og den opp-regulering av mirnas er korrelert med Smad4 ned-regulering i humane tykktarmkreftformer. Sammen er disse resultatene tyder på at miRNA-130a /301a /454 er nye onkogene mirnas bidrar til kolon tumorigenesis ved å regulere TGF-β /Smad signalering, som kan ha potensiell anvendelse i kreftbehandling
Citation. Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Wu X, et al. (2013) The onkogen rolle mikroRNA-130a /301a /454 i Human tykktarmskreft via Targeting Smad4 Expression. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10,1371 /journal.pone.0055532
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 20 september 2012; Godkjent: 27 desember 2012; Publisert: 05.02.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet er støttet med tilskudd fra National Basic forskningsprogrammer (2012CB518103), Natural Science Foundation National of China (31100554, 31270820, 81230061, og 81121004), Nursery Foundation av PLA General Hospital (12KMM48) og Beijing Nova Program (Z12111000250000). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigste kreftformer og en vanlig årsak til kreft dødsfall [1]. På grunn av dårlig prognose og fjernt invasjon og migrasjon, den totale forekomsten av tykktarmskreft er ca 5% og 5-års overlevelse for tykktarmskreftpasienter er svært lav [2]. Dermed er identifisering av nye mål for utviklingen av ikke-konvensjonelle behandlinger haster og vil dra nytte av fremgang i bred og dyp forståelse av den molekylære patogenesen av tykktarmskreft.
microRNAs (mirnas) er en omfattende klasse av små ikke-kodende RNA (18-25 nt), med en betydelig innvirkning på en rekke biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, vekst, metabolisme, og tumorgenese, gjennom direkte binding til 3′-untranslational region (3′-UTR) av mål-mRNA [3] – [5]. MicroRNAs kan regulere genekspresjon av to moduser, avhengig av graden av komplementaritet med mRNA-mål, for å undertrykke oversettelse eller indusere mRNA degradering [6], [7]. MicroRNAs kan fungere som tumor suppressors eller onkogener basert på hvorvidt de mirnas spesifikt mot onkogener eller tumorsuppressorgener [8]. Både onkogene mirnas og tumor undertrykkende mirnas er vist og beskrevet i tykktarm kreftutvikling og progresjon, slik som oppregulert MIR-135, MIR-21, MIR-17-92, og MIR-196a, og nedregulert MIR-34, MIR-195, og MIR-365 [9] – [13]. Uttrykket profil mirnas er svært vev og celletype spesifikk, noe som viser den biologiske funksjonelle betydningen av et uttrykt miRNA [14]. Men belyse funksjonene i uttrykk og roller mirnas i kreft biologi, spesielt tykktarmskreft, er fortsatt en pågående prosess.
mikroRNA-130ac /301ab /454/721 familien har samme 3′-UTR bindende frø sekvens. Nylig har MIR-130a /301ab blitt rapportert å være oppregulert i flere typer kreft, såsom leverkreft, nonsmall celle lungekreft, kronisk myelogen leukemi, kreft i bukspyttkjertelen, og brystkreft [15] – [21]; Men MIR-130a /301a er nedregulert i kronisk lymfatisk leukemi og sigdcelleanemi [22], [23], noe som indikerer kompleksiteten og mangfoldet av rollene til MIR-130a /301a i tumorigenesis. Likevel mønsteret av uttrykk og rollen MIR-130a /301a /454 i kolon kreftutvikling er fortsatt ukjent.
I denne studien undersøkte vi uttrykket og roller i MIR-130a /301a /454 i tykktarm kreft utvikling. Vi viste at MIR-130a /301a /454 er oppregulert i klinisk-resected menneskelige kolon kreft vev og tykktarmskreft cellelinjer, og disse mirnas utviser onkogene egenskaper i tykktarm kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Mekanismene bak rollene MIR-130a /301a /454 i tykktarm kreft utvikling ble også undersøkt. Dermed våre data fremheve betydningen av MIR-130a /301a /454 /familie i kreft patogenesen og foreslå en potensiell anvendelse i kreftbehandling.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Kirurgisk-fjernet tykktarm kreft vev og sammenkoblede tilstøtende normal slimhinne vev ble samlet inn fra 35 tykktarmskreftpasienter ved General Hospital i PLA (Beijing, Kina), og ble brukt for kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT- PCR) og immunblotanalyse. De kirurgisk-resekterte vev ble raskt frosset i flytende nitrogen inntil de skulle analyseres. Alle prøvene ble oppnådd med informert samtykke fra pasientene og forsøkene ble godkjent av etikkomiteen av General Hospital i PLA. Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien.
RNA ekstraksjon og QRT-PCR
Total RNA, inkludert miRNA, ble isolert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger . For miRNA analyse ble poly-A real-time QRT-PCR brukt. Det isolerte RNA ble polyadenylert ved bruk av poly-A-polymerase (New England Biolabs) i henhold til produsentens protokoll. Deretter poly-A tailed RNA var revers transkribert ved hjelp ImProm revers transkriptase (Promega), etter produsentens protokoll, og MIR-RT primer (Invitrogen). Mir-RT primer var: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T) 18VN-3 «. Sanntids PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn PCR-Mix kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll [12], med de følgende primere: Mir-130a, 5»-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 «; MIR-301a, 5»-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 «; MIR-454, 5»-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 «; universal primer, 5»-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 «; U6-F, 5»-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 «, U6-R, 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3». Den relative nivået av uttrykk for MIR-130a /301a /454 ble normalisert til den interne kontrollen (U6) ved hjelp av to
-ΔΔCt syklus terskel metode.
Cell kultur og transfeksjon
den humane koloncancer cellelinjer HCT116, HCT15, HT29, LoVo, og SW480 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og holdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin, i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. De mirnas ligner og miRNA hemmere ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Mirnas transfections ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Analyse av celle levedyktighet
in vitro
celleviabilitet av HCT116 eller SW480 celler ble vurdert ved hjelp av Cell Counting Kit -8 (CCK-8, Dojindo, Japan) -metoden. I korthet ble brukt medium erstattet med friskt medium inneholdende 10 ul av CCK8 reagens ved den angitte tidsperioder posttransfection. Cellene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 1 time, og antallet levedyktige celler ble bestemt ved måling av absorbansen ved 450 nm.
Cellemigrering assay
HCT116 transfektanter ble serum-sultet i 12 timer i RPMI-1640 medium inneholdende 0,1% FBS. Serum-sultet celler ble trypsinisert og resuspendert i RPMI-1640 inneholdende 0,1% FBS, og 1 x 10
5-celler ble tilsatt til det øvre kammer (8 um porestørrelse; Corning) på 24-brønners plater i serum-fritt medium (500 mL). Etter inkubering i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2, de migrerte celler på den nedre overflate av membranen ble farget med 0,1% fiolett farging løsning i 30 minutter, og tellet ved bruk av et invertert mikroskop.
tumorgenisiteten analysen i nakne mus
Alle forsøk med dyr ble foretatt i samsvar med National Institute of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, med godkjenning av den vitenskapelige undersøkelsen styret i General Hospital PLA. Den tumorgenisitet Analysen ble utført som tidligere rapportert [12]. Negativ kontroll eller MIR-130a /301a /454 ligne-transfektert HCT116 eller SW480-celler (1 x 10
7) ble suspendert i 0,1 ml PBS, og deretter injisert subkutant i hver side av den bakre flanke av den samme fire-uke- gamle BALB /c atymiske nakne mus. Åtte nakne mus ble inkludert i hver gruppe og tumorvekst ble målt daglig ved hjelp av målepunktene. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til følgende formel: volum = lengde x bredde
2 x 0,5. Uttrykket av MIR-130a /301a /454 i tumorprøver på de angitte tider ble oppdaget ved hjelp av en QRT-PCR-analyse.
3’UTR luciferase reporter analysen
Den menneskelige Smad4 3’UTR luciferase reporter plasmid og plasmid som inneholder MIR-130a /301a /454 målområde slettet eller mutert Smad4 3’UTR ble konstruert som beskrevet tidligere [13]. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Luciferase reporter-analyser ble utført som tidligere rapportert [13]. Kort fortalt ble luciferase aktiviteter målt til 48 timer etter transfeksjon med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega), etter produsentens anvisninger. Data ble normalisert ved å dele
ildflue
luciferase aktivitet ved
Renilla
luciferase aktivitet.
Immunoblotting
De lyserte proteinekstrakter ble utsatt for natriumdodecylsulfat-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), overført på nitrocellulosemembraner, deretter blottet, som rapportert tidligere [24]. Anti-Smad4 antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. GAPDH-antistoff og de sekundære antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology.
Statistisk analyse
Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. Statistiske sammenligninger mellom eksperimentelle grupper ble analysert ved Student
t
-UNDERSØKELSER, og en to-tailed p-verdi 0,05 ble ansett for å være betydelig. Korrelasjonen mellom MIR-130a /301a /454 uttrykk og Smad4 proteinnivå ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient analyse med r og p-verdiene, som indikert.
Resultater
MiR-130a /301a /454 er oppregulert i tykktarm kreft vev og cellelinjer
for å utforske rollene til MIR-130a /301a /454 i menneskelig utvikling tykktarmskreft, vi har oppdaget nivåene av uttrykk i 35 par av menneskelige tykktarmskreft og tilstøtende normal slimhinne vev. Ifølge QRT-PCR-analyse, ble nivåene av MIR-130a /301a /454 ekspresjon betydelig øket i tumorvev sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne vev (Fig. 1 A-C). I tillegg ble MIR-130a /301a /454 økte i tykktarm kreft cellelinjer (HCT116, HCT15, HT29, SW480, og LoVo Fig. 1 D-F). Dessuten var det en positiv korrelasjon mellom hver to mirnas blant MIR-130a /301a /454 (Fig. 1G-I), som viser et vanlig uttrykk profil i denne miRNA familien i tykktarmskreft. Disse resultatene tyder på at MIR-130a /301a /454 er oppregulert i tykktarm kreft celler, som kan være relevant for menneskelig utvikling tykktarmskreft.
uttrykk for MIR-130a /301a /454 ble undersøkt ved QRT -PCR i 35 parede human tykktarmskreft og tilstøtende normal slimhinne vev (A, B, C), og i tykktarmskreft cellelinjer som vist (D, E, F). Uttrykket av MIR-130a /301a /454 ble normalisert til U6 i hver prøve. Data er vist separat i humane prøver (A, B, C), eller som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3) i cellelinjer (D, E, F). **,
p 0,01
. (G, H, I) Statistisk analyse på sammenhengen mellom hver to mirnas blant MIR-130a /301a /454 ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient analyse.
r Hotell og
p
verdiene er vist som angitt.
MiR-130a /301a /454 forbedrer celle levedyktighet og migrasjon i tykktarm kreft cellelinjer
den høye uttrykk for MIR-130a /301a /454 i tykktarm kreft vev og cellelinjer bedt oss om å undersøke den biologiske funksjonen til disse miRNAs i tykktarmskreft. Den CCK8 analysen viste at restaurering av MIR-130a /301a /454 betydelig forbedret spredning av kreft i tykktarmen HCT116 eller SW480 celler (Fig. 2A og B), mens over-uttrykk for enten inhibitor mot MIR-130a /301a /454 redusert celle levedyktighet i både tykktarm kreft celler (fig. 2C og D) Disse tre mirnas utstilt lignende vekstfremmende effekter i tykktarm kreft, og ingen felles regler blant MIR-130a /301a /454 ble observert (fig. 2E og F). Videre MIR-130a /301a /454 fremmes cellemigrering i HCT116-celler, som analysert ved hjelp av transwellcellemigrering analysen (fig. 2G, venstre panel). I kontrast, knockdown av MIR-130a /301a /454 trykt cellemotilitet i tykktarm kreft celler (Fig. 2G, panel til høyre). Disse observasjonene tyder på at MIR-130a /301a /454 fremmer tykktarmskreft cellevekst og migrasjon, og dermed fungerer som onkogene mirnas i tykktarmskreft.
(A, B) HCT116 og SW480 Colon kreft celler ble transfektert med kontroll RNA eller MIR-130a /301a /454 ligne som angitt. Celleviabilitet ble oppdaget på angitte tidspunkter etter transfeksjon hjelp CCK8 analyser. *,
p
0,05. (C, D) hemmer av MIR-130a /301a /454 ble transfektert i HCT116 og SW480 celler og cellelevedyktigheten ble oppdaget på angitte tidspunkter ved hjelp CCK8 analyser. *,
p
0,05. (E, F) Nivåene av ekspresjon av hver to mirnas blant MIR-130a /301a /454 ble påvist ved QRT-PCR-analyser når den etterligne eller hemmer av den andre miRNA ble transfektert i HCT116-celler. (G) HCT116-celler ble transfektert med kontroll RNA, MIR-130a /301a /454 ligne, eller MIR-130a /301a /454-hemmer. Antallet migrerte celler ble beregnet og vist. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3) av en representativ eksperiment. Lignende resultater ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. *,
p
. 0,05
MiR-130a /301a /454 fremmer tumorigenecity
in vivo
Vi ytterligere bekreftet svulsten -promoting effekter av MIR-130a /301a /454
in vivo
. Negativ kontroll RNA, MIR-130a /301a /454 etterligner eller inhibitor transfektert tykktarmskreftceller, ble injisert inn i åtte nakne mus, som beskrevet. Som vist på fig. 3, MIR-130a /301a /454-transfekterte HCT116 og SW480 celler hadde rask svulstdannelse i forhold til negative kontroll transfektanter, mens knockdown av MIR-130a /301a /454 forårsaket forsinket tumordannelse (Fig. 3A-F). Nivåene av MIR-130a /301a /454 uttrykk ble validert ved QRT-PCR-analyser fra tumorprøver på de angitte tider (Fig. 3G og H). Disse resultatene indikerer at MIR-130a /301a /454 betydelig forbedret tumorigenicity av tykktarmskreftceller i en naken mus xenograft modell.
Effekt av MIR-130a /301a /454 på tumorigenicity i en naken mus xenograft modell. Kontroll RNA, MIR-130a /301a /454 etterligner eller MIR-130a /301a /454-inhibitor-transfektert tykktarmskreft HCT116-celler (A, B, C) og SW480-celler (D, E, F) ble injisert subkutant inn i begge sider av den bakre flanke av de samme nakne mus, henholdsvis (n = 8 per gruppe). Tumorvekst-kurven er vist som angitt. *,
p
0,05. (G, H) tumorvev ble samlet inn fra to mus i hver gruppe på angitte tider, og nivåene av uttrykk for MIR-130a /301a /454 ble undersøkt ved QRT-PCR-analyser.
MiR-130a /301a /454 undertrykker direkte uttrykk for Smad4
på bakgrunn av miRNA mål prediksjon (https://www.targetscan.org), over hundre gener er mulige målgener for MIR-130a /301a /454. Ettersom disse mirnas er i stand til å forbedre tumorigenecity av tykktarmskreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
, målet genet reguleres av MIR-130a /301a /454 kan fungere som en tumor suppressor. Blant de antatte målgener, Smad4, en viktig tumor suppressor involvert i TGF-β /BMP-signalering, ble vist å inneholde en konservert antatt MIR-130a /301a /454 målstedet basert på TargetScan prediksjon (Fig. 4A). For å avgjøre hvorvidt Smad4 er direkte målrettet av MIR-130a /301a /454 uttrykk, bygget vi luciferaserapportørplasmid plasmider som inneholder Smad4 3′-UTR eller peiling sletting /mutasjon av den antatte MIR-130a /301a /454 målområde. Ved kotransfeksjonen med MIR-130a /301a /454 ligne, viste vi at luciferase aktiviteten av villtype Smad4-3’UTR reporter ble undertrykt, mens målet nettstedet slettet eller mutert reporter klarte å bli målrettet av MIR-130a /301a /454 ko-transfeksjon (fig. 4B). Av notatet, immunblotanalyse viste at MIR-130a /301a /454 markant reduserte nivået av endogent protein uttrykk for Smad4 forhold til negativ kontroll RNA i HCT116 og SW480 celler (fig. 4C). Smad4 fungerer som en sentral transduser av transformerende vekstfaktor (TGF) -β og benmorfogenetisk protein (BMP) signalering, fordi R-Smad danner et heteromert kompleks med Smad4 og translocates inn i kjernen for å regulere gentranskripsjon. Vi søkte derfor å identifisere hvorvidt disse mirnas påvirke TGFB og BMP signal aktiviteter. MIR-130a /301a /454 inhibitor ble innført i HCT116-celler transfektert med TGF-β reporter CAGA12-lux eller BMP rapportør BRE-lux. Som vist på fig. 4D, MIR-130a /301a /454 inhibitor markant forbedret TGFB og BMP svar når konstitutivt aktive formen av TGF-β /BMP-reseptor I (TβRI-ca /BMPRI-ca) var co-uttrykt, ledsaget av Smad4 oppregulering Dette tyder på at MIR-130a /301a /454 kan undertrykke TGF-β /BMP signalering ved å hemme Smad4 uttrykk.
(A) Menneskelig Smad4 kan være en molekylære mål av MIR-130a /301a /454. De sekvenssammenstillinger av MIR-130a /301a /454 og dets målse i 3’UTR av Smad4, ned fra TargetScan (https://www.targetscan.org) vises. (B) HCT116-celler ble ko-transfektert med human Smad4 3’UTR
ildflue
luciferase reporter plasmid, MIR-130a /301a /454 målse slettet eller mutert reporter konstruere, sammen med RL plasmider, kontroll RNA, eller MIR-130a /301a /454 ligne, som angitt. Etter 48 timer,
ildflue
luciferase aktivitet ble målt og normalisert etter
Renilla
luciferase aktivitet. (C) HCT116 og SW480 celler ble transfektert med kontroll RNA eller MIR-130a /301a /454 ligne. Etter 48 timer, ble human Smad4 og internkontroll GAPDH påvist ved immunoblotting (øvre panel), og nivåene av MIR-130a /301a /454 ekspresjon ble målt ved QRT-PCR-analyse (nedre panel). Den densitometry ratio for immunoblotting ble vist. (D) HCT116-celler ble ko-transfektert med TGFB reporter CAGA12-lux eller BMP reporter BRE-lux, sammen med RL plasmid, kontroll RNA, eller MIR-130a /301a /454-hemmer, og TβRI-ca eller BMPRI-ca , som angitt. Etter 48 timer,
ildflue
luciferase aktivitet ble målt og normalisert etter
Renilla
luciferase aktivitet. Den endogene ekspresjon av Smad4 og GAPDH ble påvist ved immunblotting. TβRI-ca, konstitutivt aktiv form av TGF-β-reseptor I; BMPRI-ca, konstitutivt aktiv form av BMP-reseptor I. (E) Smad4 ekspresjon i tom vektor pcDNA eller Smad4-uttrykkende plasmid stabilt transfekterte-HCT116-celler ble påvist ved immunblotting. (F, G) Kontroll eller Smad4 stabilt-transfekterte HCT116-celler ble transfektert med kontroll RNA, MIR-130a /301a /454 ligne (F), eller MIR-130a /301a /454 inhibitor (G), som angitt. Celleviabilitet ble oppdaget 96 timer etter transfeksjon hjelp CCK8 analyser. *,
p
. 0,05
Videre fant vi ut hvorvidt de vekstfremmende effekter av MIR-130a /301a /454 er hovedsakelig gjennom målretting Smad4 uttrykk. Smad4-uttrykkende plasmid stabilt transfekterte-HCT116-celler ble fremstilt, som transkriberes mRNA Smad4 uten 3’UTR sekvensen. I disse cellene ble Smad4 uttrykk bekreftet å være økt sammenlignet med kontrollceller (Fig 4E.); Men MIR-130a /301a /454 ikke lenger er målrettet Smad4 uttrykk, som disse cellene transkriberes Smad4 mRNA uten 3’UTR. Spesielt, vekstøkende effekt av MIR-130a /301a /454 ble betydelig undertrykt i Smad4-transfekterte HCT116-celler (fig. 4F). Videre MIR-130a /301a /454 hemmer ikke klarte å undertrykke celle levedyktighet i disse cellene (Fig. 4G). Disse resultatene videre vist at vekstfremmende roller MIR-130a /301a /454 var hovedsakelig ved å hemme Smad4 uttrykk.
Klinisk sammenheng mellom MIR-130a /301a /454 nivåer og Smad4 uttrykk
for å forstå den kliniske betydningen av MIR-130a /301a /454 og sitt mål i tykktarmskreft, vi fast bestemt på nivåene av MIR-130a /301a /454 og protein uttrykk for Smad4 i 14 par med matchet tykktarmskreft eksemplarer av qRT- PCR og immunoblotting, henholdsvis (fig. 5A og B). Som forventet, Pearson korrelasjonskoeffisient analyse antydet at Smad4 uttrykk ble omvendt korrelert med MIR-130a /301a /454 uttrykk i tykktarm kreft vev (Fig. 5C-E). Disse dataene støtter forestillingen om at overuttrykk av MIR-130a /301a /454 fører til Smad4 nedregulering, og dermed hemme TGF-β signale-mediert cellevekst undertrykkelse, noe som bidrar til utvikling av tykktarmskreft.
(A, B) ble Ekspresjon av Smad4 og GAPDH i prøver av matchet tykktarmskreft og ikke-neoplastiske vev slimhinne påvist ved immunoblotting (A). MIR-130a /301a /454 uttrykk ble undersøkt ved QRT-PCR (B). Fire representative tilfeller vises. (C) Den relative nivået av Smad4 eller MIR-130a /301a /454 uttrykk ble normalisert til den interne GAPDH eller U6 uttrykk. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av Pearson korrelasjonskoeffisient analyse. Normaliserte MIR-130a /301a /454 og Smad4 protein nivåer av uttrykk er vist som standardiserte verdier.
r Hotell og
p
verdiene er vist som angitt.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at MIR-130a /301a /454 er oppregulert i tykktarmskreft, og ytterligere demonstrert spredning fremmende effekten av MIR-130a /301a /454 i tykktarm kreft celler. MikroRNA-130a /301a /454 er indisert som onkogene miRNA i tykktarm kreft utvikling og progresjon, noe som er konsistent med roller i andre kreftformer, som for eksempel leverkreft, nonsmall celle lungekreft, kronisk myelogen leukemi, kreft i bukspyttkjertelen, og brystkreft [15 ] – [21]. Men MIR-130a er nedregulert i kronisk lymfatisk leukemi, og kan modulere celle overlevelse ved begrenser autofagi programmet [22]. I tillegg er plasmanivået av MIR-301a nedregulert i pasienter med sigdcelleanemi, sammenlignet med normale kontroller, som er relatert til PAI-1 undertrykkelse [23]. De kjente mønstre av uttrykk, potensielle mål og biologiske funksjoner av denne MIR-130a /301a /454 familie er oppsummert i tabell 1 [15] – [23], [25] – [29]. De ulike uttrykk funksjonene i MIR-130a /301a kan gjenspeile de ulike rollene til MIR-130/301 familien i ulike typer kreft. Derfor finnes deregulering av MIR-130a /301a /454 i forskjellige typer kreft, og rollene til denne miRNA familien i kreftutvikling og progresjon kan ikke bare konkludert som en tumor suppressor eller onkogen. Utforske uttrykk profiler og roller MIR-130a /301a /454 i tykktarmskreft vil i stor grad utvide vår forståelse for dette viktige miRNA familien på tumorigenesis.
TGF-β signalveien spiller viktige roller i en rekke biologiske prosesser. Smad4, dreiesvingeren av TGF-β og BMP signalveien, fungerer som en viktig tumor suppressor. Smad4 mutasjoner eller delesjoner har vært mye observert i forskjellige typer av cancer, slik som kolorektal, bukspyttkjertel, bryst kreft og [30] – [32]; imidlertid, er den detaljerte mekanisme for inaktivering Smad4 begrenset. Vi viste at MIR-130a /301a /454 undertrykker Smad4 uttrykk gjennom direkte binding til 3’UTR, mens vi også registrert at det finnes andre miRNA konsensus nettsteder i Smad4 3′-UTR (f.eks nettsteder for MIR-34a, speil 146a, og MIR-199A, som har blitt identifisert som negative regulatorer av Smad4 i magekreft og glioblastom) [33] – [35]. Derfor kan vi ikke utelukke muligheten for at disse mirnas også delta i nedregulering av Smad4 uttrykk i utviklingen av tykktarmskreft. Vi kan heller ikke utelukke at andre potensielle mål av MIR-130a /301a /454 kan styre ytterligere kreft stier og fremme utvikling av tykktarmskreft, som en enkelt miRNA er kjent for å målrette flere mRNA. Disse hypotesene indikere behov for ytterligere studier for å avdekke hele «targetome» av MIR-130/301/454 familie i tykktarm kreftutvikling og progresjon.
Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) kan genereres ved tvungen uttrykk av transkripsjonsfaktorer, inkludert Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc [36]. Spesifikke mirnas har vist seg å være involvert i IPSC generasjon, så som MIR-290 og MIR-302 [37] – [39]. Nylig Pfaff et al. [25] viste at miRNA familien (MIR-130/301/721) fungerer som en viktig regulator av IPSC induksjon ved å målrette den homeobox transkripsjonsfaktor, Meox2. Genereringen av iPSCs innebærer en prosess med mesenchymale-til-epitelial overgang (MET), derfor faktorer som induserer MET eller blokkering av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) ved å inhibere TGF-β signalering spiller en viktig rolle i celle omprogrammering [40] . Vi har oppdaget en ny mål for MIR-130/301/454 familien (Smad4), som har nøkkelfunksjon i TGF-β signalering, som gir den mulighet at MIR-130/301/454 familie kan styre omprogrammering ved å undertrykke TGF-β /Smad4 aktivitet. Dermed har våre studier kaste nytt lys over den molekylære mekanismen og crosstalk stamcelle regulering og tumorigenesis.
I konklusjonen, bekrefter våre resultater at MIR-130a /301a /454 familien er en viktig determinant i forskjellige typer av kreftutvikling og progresjon. Dermed blir MIR-130a /301a /454 familien kan representere en lovende molekylære mål for tidlig deteksjon av kreft.
