Abstract
tumorigenesis er ledsaget av endringer i DNA metylering mønster. Vårt mål var å teste en ny tilnærming for identifikasjon av vitnemål på hele karakternivå som er regulert av DNA metylering. Vår tilnærming er basert på sammenligning av data fra transkriptomet profilering av primære humane prøver og in vitro cellekultur modeller. Epitelceller ble oppsamlet ved LCM fra normal, adenom, og tumor colonic prøver. Ved hjelp av genuttrykk analyse identifiserte vi downregulated gener i svulstene i forhold til normalt vev. Parallelt 3000 oppregulert genene ble bestemt i HT-29 colon adenokarsinom cellekultur modell etter DNA-demetylering behandling. Av de 2533 utskrifter som viser redusert uttrykk i tumorprøver, 154 hadde økt uttrykk som et resultat av DNA demetylering behandling. Omtrent 2/3 av disse genene hadde redusert uttrykk allerede i adenom prøvene. Uttrykk av fem gener (
GCG
,
nmes-en
,
LRMP
,
FAM161B Hotell og
PTGDR
), ble validert ved hjelp av RT-PCR.
PTGDR
viste tvetydige resultater, derfor ble ytterligere undersøkt for å bekrefte graden av DNA-metylering og dets virkning på proteinnivået. Resultatene bekreftet at vår tilnærming er egnet for genome-wide screening av gener som regulerer eller inaktivert av DNA metylering. Aktivitet av disse genene muligens forstyrrer tumorprogresjon, derfor gener er identifisert kan være viktige faktorer i dannelsen og i utviklingen av sykdommen
Citation. Spisak S, Kalmar A, Galamb O, Wichmann B, Sipos F , Peterfia B, et al. (2012) Genome-Wide Screening av gener reguleres av DNA Metylering i Colon Cancer Development. PLoS ONE 7 (10): e46215. doi: 10,1371 /journal.pone.0046215
Redaktør: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, USA
mottatt: 18 april 2012; Godkjent: 28 august 2012; Publisert: 01.10.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Folketrygdkontoret for forskning og teknologi, Ungarn (TECH_08-A1 /2-2008- 0114 stipend), ved å det ungarske nasjonal Innovation Office, og av den danske National Research Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
endringer av genuttrykk, inkludert aktivering av onkogener og inaktivering av tumordempere, er ansvarlig for dannelse og utvikling av tykktarmskreft (CRC) [1], [2]. Ved siden av det akkumulerende endringer i DNA-sekvensen, kan det dysfunksjon i epigenetisk reguleringssystemet også føre til avvikende dannelse av tykktarmen epitel langs den progressive prosessen med karsinogenese [3], [4]. Imidlertid er det ikke klart hvilke molekylære hendelser påvirker individuelle genet aktiviteter, og hvorvidt det er en direkte eller en indirekte effekt [5], [6], [7].
En av de epigenetiske prosesser som påvirker genekspresjon er DNA-metylering, en modifikasjon post-replikativ DNA som forekommer hovedsakelig i genomet områder med stor CG dinukleotider, såkalte CpG øyer [8]. Modifikasjon av baser ved tilsetning av en metylgruppe kan fysisk hemme binding av transkripsjonsfaktorer, og tillater også rekruttering av metyl-CpG-bindende domeneproteiner (f.eks .: MDB1-3, MeCP2) til promoter-regioner som kan undertrykke transkripsjon initiering [ ,,,0],9]. Avvikende endringer av vev-spesifikke metylering mønster ofte manifesterer seg på to måter: (i) den globale hypometylering, som forekommer i det hele genomet med aldring, og (ii) lokal hypermethylation av 5 «regulatoriske regioner i tumorgenese, noe som vanligvis fører til redusert eller opphørt transkripsjonen aktivitet av de aktuelle gener [10], [11], [12]. Hypermethylation mediert endringer i genregulering spiller en nøkkelrolle i utviklingen av flere tumortyper, inkludert kolorektal cancer, og viser også et tumorspesifikt mønster [13].
Det er velkjent, at DNA-metylering påvirker genet aktiviteter uten å endre DNA-sekvensen i seg selv, og kan bli tilbakestilt ved demethylating midler som virker ved å hemme DNA-metylering, slik som 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza). Dette gir en teoretisk mulighet til å bremse eller å arrestere svulst utvikling ved tidlig deteksjon. Imidlertid, for bedre forståelse av DNA-metylering prosesser, og for muligheten for å bruke kolorektal kreft-spesifikk metylering biomarkører for screening av pasienter, eller til og med for å oppnå gen-rettet demetylering i fremtiden, de aktuelle genene må bli identifisert. Selv om flere metylering regulerende gener har blitt rapportert å være assosiert med kreft (inkludert kolorektal kreft) utvikling, gjenstår en detaljert prosess uklar [14], [15], [16], [17], [18], [19] .
Selv om mange strategier er tilgjengelige for å vurdere DNA metylering på hele genomet nivå, inkludert sekvensering [20], [21] og array-systemer [22], [23], disse metodene kan være tilstrekkelig bare i tilfelle vev eller cellekulturer, hvor forholdsvis stor mengde av utgangsmaterialet (genomisk DNA) kan oppnås, som forskjellige celletyper har forskjellige mønstre metylering [24], [25], [26]. Laser fange mikrodisseksjon (LCM) kan tjene som en tilfredsstillende celleseparasjonsmetoden [27]. Men den begrensede mengden av collectable prøveresultatene i en utfordrende ulempe ved metylering studier, fordi de tilgjengelige in vitro forsterkning teknikker kan ikke spare metylering mønster. I motsetning til dette, kan genekspresjon analyseres rutinemessig med laser microdissected celler, som kan kombineres med mikromatriseanalyse for å samle informasjon selv fra en enkelt celle ved hele genomet nivå.
I denne artikkelen presenterer vi et genekspresjon basert metode som er egnet for effektiv, high-throughput, genom-bred screening for metylering-regulerte gener, som har redusert ekspresjon kan være relatert til kreft progresjon. Potensialet i denne metoden ble demonstrert tidligere ved å identifisere 17 transkripsjoner som ble nedregulert i løpet av kolorektal kreft progresjon, og viste økt aktivitet i HT-29 kolorektal kreftceller etter 5-Aza behandling [28]. Utvide forrige undersøkelse, her rapporterer vi 154 gener, som trolig hemmet ved metylering under utviklingen av tykktarmskreft. Påliteligheten av fremgangsmåten er støttet av et bredt spekter av eksperimentelle og
in silico
metoder presenteres i denne artikkelen. Uttrykk for flere transkripsjoner ble validert ved RT-PCR. Vi har åpenbart forholdet mellom genekspresjon og metylering status i tilfelle av
PTGDR
-genet ved RT-PCR-analyse, immunhistokjemi, bisulfitt sekvensering, og HRM analyse. I PCA-analyser normal, adenom, og CRC prøvene kunne med hell separeres basert på uttrykk mønstre av disse 154 utskrifter, både i vårt eget prøvesett og i uavhengige prøvesett hentet fra GEO databasen.
Resultater
Mikromatriser av LCM vevsprøver og HT-29 celler
Hypermethylation av flere genomiske regioner ble tidligere vist seg å være assosiert med onkogene transformasjon. På grunn metylering av CpG øya (e) i et gens promoter region kan redusere transkripsjonen av genet, søkte vi gener med avtagende ekspresjon i humane colon tumorprøvene sammenlignet med normale colonic epitelvev. Expression endringer i tumorprøver kan skyldes ulike molekylære arrangementer, inkludert de direkte og indirekte effekter av mutasjoner [29], [30], [31]. Imidlertid kan endringer i ekspresjon mønsteret observert i en cellekulturmodell demetylerte forutsi hvilke gener som er regulert av DNA-metylering (figur 1). Genuttrykk i vevsprøver ble studert av HGU133 Plus2.0 mikromatriser, og de oppnådde data ble analysert ved SAM (Betydningen Analyse av mikromatriser) algoritme. Rundt 2000 transkripsjoner, som tilhører ca 2500 probe sett, ble identifisert som hadde redusert uttrykk i tumorprøver (tabell S1).
Gener som aktiveres av hypermethylation kan reaktiveres ved fjerning av metyl grupper fra CPG øyene i deres promotorregioner, som kan oppnås ved å dyrke cellene i nærvær av DNA-metyltransferase-inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin. Genekspresjon nivåer i 5-Aza-behandlede og ikke-behandlede HT-29 tykktarm adenokarsinomceller ble sammenlignet. Fordi 5-Aza behandling forårsaker dose-avhengig hemming av celleproliferasjon [32], [33], [34], MTT-analyser ble brukt for å optimalisere behandlingen konsentrasjon. Basert på resultatene 10 uM 5-Aza ble påført i demetyleringen behandling av HT-29 celler. Fordi 5-Aza behandling ikke kan aktivere gener helt, vurderte vi de beste 3000 probe sett har den høyeste log
2FC verdier ved signifikansnivå på p 0,025 for å være potensielt oppregulert. Blant de ca 2000 utskrifter som viste redusert transkripsjon i colontumorer, ble 154 gener funnet som viste økt uttrykk i de 5-Aza-behandlede HT-29 celler ved hjelp av de ovennevnte kriteriene. Basert på microarray analyse disse er kandidat gener som trolig forstummet i tykktarmssvulster ved DNA hypermethylation enten direkte eller indirekte (tabell S2). Interessant, 108 av de 154 transkripter hadde signifikant redusert nivå allerede i adenom prøvene (figur S1) (tabell S3). Arrangøren region prediksjon ble utført ved hjelp av preging CpG Plot verktøy. Basert på prediksjon resultater og analyser av uavhengig offentlig microarray data, ble 6 transkripsjoner valgt for videre analyse. Disse transkripsjoner hører til
GCG plakater (glukagon),
nmes-en product: (normal slimhinnene i spiserøret spesifikke 1, også kalt
C15orf48
),
LRMP
(lymfoid-begrenset membran protein),
FAM161B plakater (familie med sekvenslikhet 161, medlem B), og
PTGDR plakater (prostaglandin D2 reseptor) gener, som også viste differensial uttrykk i vår tidligere pilotstudie [35], men har ikke vært knyttet til CRC før, og for å
CDKN2B
, en kjent tumor suppressor genet. Figur 2 representerer de uttrykk mønstre av dette settet av 6-gener med vår LCM datasett. Heatmap viser forholdsvis høy ekspresjon av genet satt i normale vev som avtar i løpet av kreftutvikling.
Ekspresjon av tumor-suppressor-gen
CDKN2B
er vist for sammenligning. Probe satt identifikasjonskoder og genet navn er angitt til høyre. De seks kolonner indikerer microarray resultatene fra seks individuelle prøver for hver type vev. Svarte firkantene indikerer at genekspresjon var uendret i det eksperimentet. Graden av intensitet av rødt eller grønt indikerer nivået av genuttrykk høy eller lav, henholdsvis.
RT-PCR Validerings Analyser
I microarray analyser transkripsjon av alle disse genene ble inhibert i de tumorprøver, men viste ulik grad av heterogenitet i adenom prøvene (figur 2). Videre ble disse genene reaktivert i forskjellig grad som et resultat av 5-Aza behandling i HT-29-celler. I microarray analyse GCG, nmes-en, og LRMP transkripsjoner viste sterke reaksjoner ( 2,5 ganger økning), mens FAM161B og PTGDR mRNA viste svakere svar ( 1,5 ganger økning). Uttrykk for
CDKN2B
, som et velkjent metylering regulert tumor suppressor genet, ble validert ved RT-PCR før [36]. Videre uttrykk for fem utvalgte gener,
GCG
,
nmes-en
,
LRMP
,
FAM161B
, og
PTGDR
ble også testet på uavhengig laser microdissected colonic og også på demetylerte HT-29 celler ved real-time PCR. De anvendte PCR-primer-sekvenser er gitt i tabell S4.
5-Aza behandlet HT-29 celler.
For å studere effekten av demetylering, ble HT-29 celler ble behandlet med 10 uM 5- aza og ekspresjonsnivået for den valgte genet gruppen ble undersøkt i sammenligning med acetat-behandlede (løsningsmiddel for 5-aza) kontrollprøver (figur 3). Etter demetylering,
GCG
,
nmes-en
, og
LRMP
gener viste økende uttrykk, mens transkripsjon av
FAM161B
gen ikke endres vesentlig . Lignende resultater ble oppnådd med en 20 uM 5-Aza-behandling (data ikke vist).
Data-analyse ble utført med sammenlignings Cp-metoden (se Materialer og Metoder). Gener som ble ansett å være nedregulert med verdier som er lavere enn 0,5 (50% reduksjon, horisontal stiplet linje), og oppregulert med verdier høyere enn 2 (to-gangers økning). GAPDH ble anvendt som en kontroll husholdningsgenet. Lys grå og mørk grå søylene viser genuttrykk nivåer i adenom og i tumorprøver i forhold til normale prøver, henholdsvis. Skraverte søyler angir sammenligning av 5-Aza behandlede og kontrollcellene. Standardavvikene for de målte transkripsjonsnivåer ble beregnet og er angitt for hvert transkript. Housekeeping genet intensiteter ble i gjennomsnitt for hver gruppe.
LCM vevsprøver.
RT-PCR resultatene ble sammenlignet på vanlig kolon slimhinne-adenom og normal kolon slimhinne-svulst relasjoner i individuelle vevsprøver. Disse fem normal epitel, fem adenom og fire tumorprøver var uavhengig av de som brukes i microarray analyse. Resultatene viste god overensstemmelse med microarray analyse,
GCG
,
nmes-en
, og
FAM161B
gener ble nedregulert i både adenom og tumorprøver, mens
LRMP
viste redusert uttrykk bare i tumorprøver (figur 3).
PTGDR
uttrykk viste tvetydige resultater i RT-PCR eksperimenter. Det viste ikke en sterk reaksjon for 10 mm 5-Aza behandling, men hadde omtrent 1,7 ganger økt uttrykk når cellene ble behandlet med 20 mikrometer 5-Aza. Også PTGDR RNA-nivå viste heterogenitet i vevsprøver (figur 4A), derfor utførte vi videre analyser for å avdekke bakgrunnen for disse observasjonene. Expression verdier for 215894_at PTGDR sonde innstilt ble testet på uavhengige GEO sett (figur 4 B, C). I disse uavhengige prøvesett, redusert PTGDR mRNA nivåer ble funnet allerede i adenom prøvene, noe som ytterligere redusert i CRC prøver.
Real-time PCR og dataanalyse ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Gener som ble ansett å være nedregulert med verdier som er lavere enn 0,5 (50% reduksjon, horisontal stiplet linje) (A) Ekspresjon verdi fordeling av 215894_at probeset (for
PTGDR
genet) i GSE8671 (B) og GSE18105 ( C) GEO datasett. P-verdier: Normal vs. Adenom P = 0.000712; CRC vs. Normal P = 0.0003797; LCM CRC vs. Normal P = 0.0000004; LCM CRC vs. CRC P = 0,834.
Bisulfite spesifikk PCR og HRM (High Resolution Smelte) Analyse
For å bekrefte at den regulatoriske regionen
PTGDR
er faktisk hypermethylated, utførte vi bisulfitt-spesifikke PCR og høy oppløsning smelte analyse på genomisk DNA [37]. Standarden fortynningsserie ble brukt for å teste sensitiviteten av våre HRM analyser. I henhold til de normaliserte kurvene smelte, vår analyse var i stand til å detektere 2% denaturert DNA i 98% unmethylated bakgrunn. Metyleringen prosent av vevsprøver ble estimert i henhold til deres normaliserte smeltekurver i forhold til standard fortynningsserie. Alle normale tykktarmsslimhinnen prøver normalisert smeltekurve falt mellom områdene avgrenset av 0% -2% standard prøver. I tilfelle av tumorprøver, 1 prøven var på 0% -2% metylering rekkevidde, 2 mellom 2-25%, og to prøver viste metylering andel høyere enn 25% (figur 5). Analyse av den valgte
PTGDR
regionen fra HT29 cellelinjen viste nesten 100% metylering. For validering, ble bisulfite sekvensering utført for å bestemme metylering status for denne regionen. (Figur S2.)
stiplede linjer representerer standard fortynningsserie fra kunstig denaturert DNA (0%, 25%, 50%, 75% og 100%). Den solide svarte linjen viser resultatene fra en normal prøve. Solid grå linjer representerer resultatene fra 5 uavhengige tumorous vevsprøver. HRM Analysen kan skille metylering av de normale og tumorøse vev basert på den forskjellige G: C-innhold i bisulfitt-konvertert promotorsekvens. Arrangøren regioner som inneholder mer denaturert cytosines, som ikke kan konverteres til uracil ved bisulfit behandling, har høyere smeltetemperatur. Smeltetemperaturen er proporsjonal med forholdet av ikke-konverterte cytosines.
Tissue Microarray Analysis, PTGDR Immunhistokjemi
prostaglandin D2-reseptoren ble ytterligere undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi TMA glir for å bestemme effekten av DNA-metylering på proteinnivået. Normale kolon slimhinner prøvene viste sterk epitel cytoplasma farging, som sekvensielt redusert i adenom scene nær luminal overflaten. Den farging intensitet ble ytterligere redusert i løpet av progresjon og bare moderat ekspresjon kan bli observert i tumorprøver (figur 6 venstre panel). Selv om det i noen adenom og tumorprøver protein ekspresjon ble funnet å være lik det som ble detektert i normal epitel (figur S3). En tendensiøs PTGDR protein uttrykk nedgang ble observert i adenom-karsinom-sekvensen progresjon (Figur 6 panel til høyre).
I normale prøver (øverst), hovedsakelig sterk, diffus cytoplasma farging ble oppdaget, som moderat redusert i adenom prøver (midten), og bare svak cytoplasma farging ble observert i kolorektal kreft prøver (nederst). Høyre panel viser foreningen tomter som representerer tendentiously mink PTGDR protein uttrykk langs adenom-karsinom-sekvensen. For å måle foreningen av to variabler (uttrykk og sykdom scenen), ble Chi-kvadrat test benyttet. Høyden (og fargedybde) av boksene er proporsjonal med forskjellen mellom den observerte og forventede hyppighet av skårer. Nedover rødfargede bokser indikerer at den observerte frekvensen er lavere enn forventet. De oppover, blå objekter representerer det motsatte. PTGDR farging score:
–
2 = ingen flekker; 0 = svak farging; 1 = moderat farging; 2 = sterk diffuse epitel cytoplasma farging.
Testing av Metylering regulerte gener på Independent Sample /uttrykk Sett av PCA
For å teste diskriminerende effekt av de 154 utvalgte gener, som trolig regulert ved metylering under kreftutvikling, har vi testet dem på to uavhengige prøvesett fra Gene Expression Omnibus (GEO) offentlig microarray arkivet. En av de prøvesett, GSE8671 [38], inneholder normalt og adenom, og den andre, GSE18105 [39], normale og tumorprøver. Sistnevnte Prøvesettet er spesielt egnet for validering, siden den inneholder både homogeniserte og LCM tumorprøver. Aktiviteter for alle de 154 genene i vår liste ble sammenlignet med en standard dimensjon reduksjon metoden, prinsipal komponent analyse (PCA) [40] som forvandler multivariate log
2-uttrykk data inn i 2 dimensjoner. PCA velger retninger med størst varians roterer deretter og prosjekter dataene inn i dette rommet. Vi beregnet transformasjonsmatrise ved å bruke vår 6 normal og 6 LCM CRC prøver (adenom prøvene ble ikke brukt ved beregning av transformasjonsmatrise) og brukt resulterte transformasjonsmatrise for å projisere alle prøvene inn i rommet utspent av de første 2 hovedkomponentene . De første to komponentene inneholder 81% av den kumulative totale varians; dermed kan man forvente at de skal trofast representere den multivariate distribusjon. Figur 7A viser at de normale og LCM CRC prøvene er klart adskilt, og når adenom prøvene blir projisert inn i PCA plass, de befinner seg i mellom normale og CRC prøver, støtter hypotesen om at adenom er en overgangstilstand mellom normal og CRC faser [2], [41]. Lignende resultater ble oppnådd ved å bruke bare de seks genene er angitt i figur 2 (data ikke vist). Den diskriminerende effekt av de valgte 154 gener ble ytterligere bekreftet ved hjelp av tidligere publiserte datasett. PCA projeksjon som ble beregnet ved hjelp av utelukkende vår LCM CRC og normale prøver kan også helt skille normale og adenom undergrupper av den GSE8671 studien (se figur 7C). For det andre GEO datasettet, GSE18105, er separasjon nesten perfekt for både den homogeniserte CRC og LCM CRC prøver, bare ett punkt, markert med en pil på figur 7B er feilklassifisert. For å finne årsaken til feilklassifisering euklidsk avstand analyse ble utført der denne prøven ble vist seg å være en avvikende (Supplementary figur S4).
Hovedkomponentene ble beregnet ut fra loggen
2-uttrykk verdier av de 154 utvalgte probe sett for normal-CRC prøvene i vår LCM sett, og deretter alle 3 sett ble projisert inn i hovedkomponent koordinere plass. Merk at denne metoden kan betraktes som en styrt klassifikasjon, siden vi ikke bruker eksplisitt kategoriene i dataanalyseprosessen. Figur 7.A viser at PC transformasjon skiller svært godt normale og LCM CRC prøver og plasserer adenom prøvene mellom normale og CRC prøver. For å validere vår liste over potensielle markørgener, forvandlet vi data fra to andre uavhengige studier inn i de samme PC-koordinater. De to studier fra Gene Expression Omnibus microarray arkivet var GSE18105 med normale, CRC og LCM CRC prøver og GSE8671 med normale og adenom prøver. For begge setter separasjon av kategoriene er bra bortsett fra én avvikende punkt i B merket med en pil (se diskusjon i teksten).
Diskusjoner
I denne studien presenterer vi en roman high-throughput screening for valg av et gen gruppe, som forandret genekspresjon på grunn av den avvikende DNA-metylering mønsteret kan være relatert til kreft. Aktivitet av slike gener kan hemme kreft progresjon, derfor deres identifikasjon kan forbedre bestemmelse av prognose.
I et tidligere arbeid, har vi utviklet en eksperimentell system for identifikasjon av metylering regulert gener basert på undersøkelse av genuttrykk nivåer i kliniske prøver LCM og i 5-aza behandlet HT-29 celler. 110 transkripter viste redusert ekspresjon i tumorutvikling og 71 oppregulert transkripter ble identifisert, og et resultat av det 5-aza-behandling. 17 transkripsjoner tilhørte begge grupper, og disse transkripsjonene ble antatt å være regulert av DNA metylering [28].
I dette arbeidet et langt bredere analyse strategi ble brukt, noe som resulterer i identifisering av 2533 downregulated transkripsjoner under svulst utvikling og 3000 oppregulert transkripter som et resultat av 5-aza behandling av HT-29-celler (figur 1). Metylering relatert 154 transkripter var tilstede i begge grupper, dvs. var redusert ekspresjon i tumorer sammenliknet med normal tykktarmsslimhinne-celler og viste økt aktivitet etter demetylering behandling av HT-29 colon cancerceller. Derfor er disse transkripsjonene sannsynligvis hemmet av metylering, direkte eller indirekte under utviklingen av tykktarmskreft. Gyldigheten av denne listen er støttet av (i) tilstedeværelsen av mange gener som tidligere ble funnet å være nedregulert i tykk- og endetarmskreft (f.eks
CHGA
,
FCGBP
,
GSN
,
LPP
,
MYH11
,
PLCG2
,
SST
,
NBL1
) [42], [43], (ii) tilstedeværelse av flere kjente tumorsuppressorgener (f.eks
CDKN2B
,
MTUS1
,
RASSF6
,
PDCD4
,
KLF5
,
CDS1
), og (iii) av resultatene av prinsipal komponent analyser utført på tidligere publiserte datasett. Det finnes ulike genetiske og epigenetiske faktorer som kan bidra til redusert ekspresjon av gener i tumorceller. Vi var interessert i gener som kan slås av ved DNA metylering. Tidligere studier har vist at mange gener er inaktivert i kolorektale cancercellelinjer, men det er store variasjoner mellom de forskjellige cellelinjer [16], [17], som tyder på at ikke alle de inaktiverte gener som er knyttet til tumorgenese. Ifølge vår hypotese, kan aktiviteten til flere gener identifisert ved vår tilnærming forstyrre tumor progresjon. Denne hypotese støttes av tilstedeværelsen av den cyklin-avhengige kinase inhibitor 2B (
CDKN2B
) og 2C (
CDKN2C
) tumorsuppressorgener i den identifiserte genet settet.
CDKN2B
genet ligger på kromosom 9p21, et locus der slettinger ofte forekommer i mange primære humane tumorer, inkludert esophageal carcinoma [44] og endetarmskreft [45].
CDKN2B
, som ble nedregulert i våre adenom og kolorektale tumorprøver er også brakt til taushet av DNA metylering i en rekke av hematologisk kreft [46].
CDKN2C
ble tidligere rapportert å bli inaktivert av arrangøren hypermethylation i Reed-Sternberg celler i Hodgkins lymfomer, og tap av CDKN2C viste negativ korrelasjon med total overlevelse av pasientene [47]. Retinsyrereseptor responder 1 (
RARRES1
) er også en tumor suppressor genet. Dets ekspresjon er ofte nedregulert gjennom DNA-hypermethylation i flere typer ondartede vev. Nedregulering av
RARRES1
ble foreslått til å være relatert til scenen D progresjon av tykktarmskreft [48]. Underexpression av flere andre gener, identifisert av vår tilnærming, ble tidligere beskrevet å være assosiert til tykktarmskreft. For eksempel er metyl-CpG bindende domene protein, MBD4, som er involvert i mismatch reparasjon på CpG-områder, påvirket av rammeskiftmutasjoner i over 40% av mikro ustabil sporadiske coloncancere [49]. Den humane immunoglobulin polimeric reseptor (PIGR) ble funnet å være underexpressed i colontumorer og også i kolon tumorcellelinjer [50]. I likhet med våre resultater, Efrin-A5-genet (
EFNA5
) ble også rapportert før som en downregulated genet i tykktarm kreft [51]. Uttrykket av POU domene klasse 2 transkripsjonsfaktor 3 (POU2F3) ble redusert i adenom og tumorous colonic epitel. CpG øyer i
POU2F3
reguleringsområdet er ofte abnormt metylert i livmorhalskreft [52].
For å evaluere nøyaktigheten av vår tilnærming, målte vi uttrykket av fem gener ved RT-PCR i uavhengige vevsprøver. Disse genene ble også identifisert i vår forrige pilotstudie, men de har ikke vært knyttet til CRC før. Ved to gener,
GCG Hotell og
nmes-en
, en bemerkelsesverdig nedgang ble funnet i genuttrykket allerede i adenom scenen. Begge gener viste en sterk aktivering som et resultat av en demetylering behandling av HT-29-celler, noe som tyder på at disse genene er inaktivert av promoter hypermethylation.
nmes-en
genet (også navngitt som
C15orf48
) uttrykkes langs sunn mage-tarmkanalen, og det er ofte nedregulert i spiserøret plateepitelkarsinom [53]. Avvikende metylering av
nmes-en
promoter-regionen ble også påvist i invasiv livmorhalskreft (ICC), men ikke i normale livmorhalsprøver [54]. Proteinet som kodes for av glukagon (GCG) -genet er et preproprotein som spaltes inn i fire forskjellige modne peptider. Disse peptidene er involvert i å opprettholde nærings homeostase, og er regulatorer av celleproliferasjon, differensiering og apoptose [55].
FAM161B
er en spådd gen, hvis bidrag til kreftutvikling har ikke blitt rapportert ennå. Det ble underexpressed i begge trinn i våre forsøk, men det gjorde ikke viser en bemerkelsesverdig aktivering som et resultat av fem-Aza behandling.
prostaglandin D2 reseptor (
PTGDR
) genet er lokalisert i prostaglandin reseptoren klyngen. I tidligere studier metylering status av
PTGDR
ble funnet å være korrelert omvendt proporsjonalt med dets ekspresjon i neuroblastom-cellelinjer [56]. Våre microarray Resultatene antydet at PTGDR mRNA nivået synker langs adenom-karsinom-sekvensen i gjennomsnitt. Imidlertid analyse av PTGDR mRNA nivå ved RT-PCR og PTGDR proteinnivå ved immunhistokjemi i de enkelte vevsprøver viste heterogenitet. Lignende resultater ble oppnådd ved å analysere de tidligere publiserte GSE8671 og GSE18105 genekspresjon datasett (figur 4). HRM analyser oppdaget ulike nivåer av CpG metylering i PTGDR promoter-regionen i enkelt tykktarm kreft prøver. Disse observasjonene tyder på at
PTGDR
genet er brakt til taushet av DNA hypermethylation under utviklingen av visse kolorektal tumorer. Imidlertid må det ytterligere undersøkelser om PTGDR lyddemping viser en sammenheng med utviklingen av sykdommen.
microarray data sammen med validerings resultatene tyder på at DNA metylering delvis inaktiverer visse gener allerede i tidlig adenom scenen. Denne observasjonen kan være viktig i fremtiden, fordi etter tidlig deteksjon av tykktarmskreft, gen-spesifikk terapi eller målrettede genet aktiveringsmetoder kan ha relevant betydning. Interessant, gener som er nedregulert i adenom trinnet ikke alltid vise en gradvis avtagende aktivitet langs adenom-karsinom sekvens, dvs. at de kommer til uttrykk ved et lavere nivå i adenom enn i tumorprøver. Dessuten observerte vi høyere ensartethet av adenom prøvene enn kolorektal kreft prøvene i PCA-analyser av genuttrykk datasett (Figur 7C vs 7B). Denne observasjonen tyder på at visse gener som er nødvendig for å bli inaktivert for adenom formasjonen, blir reaktivert i tumoren. Det er lettere å få tak i slike mønstre av genaktivitet ved reversibel epigenetisk regulering enn ved mutasjoner. Metylering-mediert regulering kan påvirke om lag 60% av de menneskelige arrangører [11], og tillater finjustering av genet aktiviteter for å oppnå en optimal kombinasjon av uttrykk. Denne optimale kombinasjonen kan avhenge av flere faktorer, og kan endres i løpet av tumorprogresjon. Men på grunn av det begrensede antallet prøver i dette arbeidet, er ytterligere studier for å bekrefte denne konklusjonen.
nedregulering av mange gener identifisert ved vår tilnærming er relatert til tumorigenesis. Men videre studier er nødvendig for å svare på om det sett av underexpresed gener som presenteres i denne studien er spesifikke for tykktarmskreft. Bruk av vår tilnærming til andre tumormodeller ville tillate undersøkelse av svulsten-spesifisitet hypermethylation mediert genet inaktive mønstre.
Materialer og metoder
Prøvetaking
Vevsprøver innhentet fra kirurgisk fjernet kolon vev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret på -80 ° C inntil bruk.
