Abstract
Utviklingen av dendrittiske cellen basert vaksiner er en lovende tilnærming i kreft immunterapi. For deres vellykkede bruk i klinikker, er utbredelsen og funksjonaliteten til DC avgjørende. Vi har tidligere etablert en to-trinns fremgangsmåte for storskala produksjon av DC fra navlestrengsblod avledet MNCer /CD34 + -celler. Dette arbeidet tar sikte på å forbedre sin funksjonalitet basert på følgende observasjoner:
in vitro
generert DC kan være mindre effektiv i migrasjon og andre funksjonelle aktiviteter på grunn av lavere eicosanoid nivåer. Produksjonen av eikosanoider fra arakidonsyre (AA) kan bli hemmet på grunn av undertrykkelse av enzymet fosfolipase A2 ved hjelp av IL-4, et viktig cytokin som er nødvendig for differensiering av DC. Vi antok at eksogen tilførsel av AA til kultur media under DC generasjon kan resultere i DC med forbedret funksjonalitet. DC ble generert med og uten AA. De to DC settene ble sammenlignet med fenotypeanalyser, morfologi og funksjonelle analyser som antigen opptak, MLR, CTL analyse og
in vitro Hotell og
in vivo
migrasjon. Selv om det var ingen forskjell mellom de to typer DC i form av morfologi, fenotype og antigen opptak, AA
+ DC utstilt en forbedret
in vitro Hotell og
in vivo
migrasjon, T celle stimulerende kapasitet, CTL aktivitet og betydelig høyere transkripsjonsnivåer av COX-2. AA
+ DCs også viser en gunstig Th1 cytokin profil enn AA
– DC. Således tilsetning av AA til kulturmediet er skrå DCS mot sekresjonen av mer IL-12 og mindre av IL-10 sammen med gjenopprettelse av eicosanoids nivåer i en COX-2 mediert reaksjonsvei for derved å øke funksjonaliteten til disse cellene til å bli brukt som en potent cellevaksine. Til sammen vil disse funnene være nyttig i bedre forgodtbefinnende av DC baserte vaksiner mot kreft immunterapi
Citation. Kumar J, Gurav R, Kale V, Limaye L (2014) Eksogene Tilsetting av arakidonsyre til kulturhuset Media forbedrer funksjonaliteten av dendrittiske celler for Deres mulig bruk i Cancer Immunterapi. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10,1371 /journal.pone.0111759
Redaktør: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Nederland
mottatt: 13 juni 2014; Godkjent: 30 september 2014; Publisert: 04.11.2014
Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor Saksdokumenter filene
Finansiering:. Prosjektet fikk midler fra Institutt for bioteknologi (DBT), Government of India via stipend no. BT /PR13565 /MED /31/89/2010. JK fikk sin fellesskap fra Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR) India og fra DBT (PR 4930/31). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
dendrittiske celler (DCS) er mest effektive antigenpresenterende celler (APC) som anerkjenner univers av antigener og kontrollerer forskjellige typer tiltak [1], [2]. DC er i stand til å fange antigener, behandle dem, og presentere dem med egnede ko-stimulering molekyler og igangsette immunrespons [3], [4]. DC er ikke bare viktig for induksjon av både primære og sekundære T- og B-celle-medierte immunresponser, men er også viktig for induksjon av immunologisk toleranse. DC er i sentrum av immunsystemet og modulering av immunresponsen er viktig i terapeutisk immunitet mot kreft [5]. Den unike evne til DC i antigenpresentasjon og regulering av immunresponsen har gjort dem til et attraktivt adjuvant i cancer immunoterapi [6]. Fremskritt i
in vitro
DC generasjon protokoller og bedre forståelse av DC biologi har resultert i deres bruk som DC-vaksiner i klinikkene. Siden sin første rapport i 1995, har et stort antall kliniske studier er utført for å evaluere DC-baserte vaksiner mot mer enn et dusin forskjellige typer svulster [7], [8], [9]. Klinisk bruk av DC krever gjentatt vaksinering for å indusere relativt høye frekvenser av tumor antigen spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og en fullstendig respons. Dette igjen krever et stort antall DC, genererte
ex vivo product: [10].
DC kan genereres fra CD34
+ celler ved hjelp av en ett-trinns eller en totrinns kultur-systemer . I den første typen av kultursystem CD34
+ celler dyrkes med en kombinasjon av vekstfaktorer, der om de er direkte differensiert som dendrittiske celler [11], [12], [13]. På den annen side, i to trinn kultursystemet CD34
+ celler blir først ekspanderes i stor skala som DC-forløpere. Disse ekspanderte celler blir ytterligere differensiert som DC [14], [15], [16], [17]. Til tross for full forståelse av den komplekse DC-mediert regulering av verts responser,
in vitro
generert DC kan ikke representere det samme som vandrende DC
in vivo
, og dermed begrense deres bruk som magiske kuler for å forbedre presisjonen og effektivitet i cancer immunoterapi. Nyere eksperimentelle bevis viser at human monocytt-avledet DC (MoDC) kan bli hemmet i deres evne til å migrere i respons til inflammatoriske samt homeostatiske chemotaxins [18]. Tidligere rapporter viser at IL-4, som er et viktig cytokin for
in vitro
DC generasjon, inhiberer mange av de nedstrøms veier av arakidonsyre (AA) metabolismen resulterer i nedsatt produksjon av eikosanoider og blodplateaktiverende faktor ( PAF). Prostaglandin E
2 (PGE
2) er et medlem av eicosanoid familien av oksygen AA derivater. Det første trinn i PGE
2 biosyntese er frigjøring av AA fra membran-fosfolipider av fosfolipaser som for eksempel fosfolipase A2 (PLA
2). Siden eikosanoider og PAF er kjent for å spille en viktig rolle i prosesser såsom leukocytt-migrering, naturlig drepecelleaktivering, og type 2 T-hjelpercelle differentiations, kan mangel på biosyntesen av disse faktorene være ansvarlig for de observerte handicap av MoDCs [19] .
Vi tidligere etablert en to-trinns plast tilslutning fremgangsmåte for storskala produksjon av DC avledet fra både navlestrengsblod CD34 + celler [17] og MNCer (mononukleære celler) [20]. DCS generert av vår metode har en moden fenotype og er funksjonelt aktive. Men et av cytokinene som brukes til å generere DC ved vår fremgangsmåte er IL-4, og som nevnt ovenfor, IL-4 kan påvirke frigivelse av arachidonsyre fra membrane.We hypotese at eksogen tilsats av AA til våre kulturer under differensieringstrinn kan hjelpe i ytterligere forbedring av funksjonene til DC. Begrunnelsen for å tilsette eksogent AA var at det kan bli omdannet til prostaglandiner i et cyklo-oksygenaser-1 (COX-1) og cyklo-oksygenaser-2 (COX-2) avhengig måte. For å sjekke denne hypotesen, i denne studien testet vi effekten av AA tillegg på
in vitro
DC generasjon. Våre data viser at faktisk AA
+ DC er overlegen i funksjoner som forbedret
in vitro Hotell og
in vivo
migrasjon, T-celle stimulerende kapasitet, antigen opptak, CTL aktivitet, betydelig høyere transkripsjonsnivåer av COX-2 og et gunstig Th1 cytokin enn AA
– DC. Dermed våre funn ta oss ett steg nærmere mot å generere bøte formen for kreft vaksine DC basert.
Materialer og metoder
Cytokiner
De rekombinante humane cytokiner som brukes for studien var FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Flt-3L), trombopoietin (TPO), stamcellefaktor (SCF), interleukin-4 (IL-4), granulocytt monocytt -colony stimulerende faktor (GM-CSF), tumor nekrose faktor-α (TNF-α), CD40-ligand og ligand kjemokin-19 (CCL-19). Alle rekombinante humane cytokiner ble kjøpt fra Peprotech Asia, Revohot Israel
Antistoffer
De antistoffer som brukes for flowcytometri var musen anti menneskelige mAbs:. CD1a, CD34, CD11c, CD40, CD8 -APC merket ; CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, CD45RA -PE merket; CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC -FITC tagget, anti murine CD 45.1 -PB merket og CCR-7 (renset antihuman rotte mAb). Alle monoklonale antistoffer og respektive isotype kontroller som brukes for studien ble kjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, California).
Andre reagenser som brukes
Arachidonic syre- (kat. Nr er A3555) fra Sigma Aldrich, en vev kultur testet produktet stammer fra svin leveren. Renheten av produktet var ≥99% som analysert ved kapillær gasskromatografi
Ficoll Hypaque-Histopaque (densitet 1,007 g /ml).; Fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket dextran (40 kDa); Wright Stain, Giemsa Stain, Lipopolysaccharide, DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) og IMDM (Iscove modifiserte Dulbeccos Medium) alle var fra Sigma Aldrich; ELISA kit (BD OptEIA); Heparin fra SRL Pvt. Begrenset, Mumbai; Hydroxy Ethyl (HES), Rosette september for T-celle isolasjon (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada); [
3H] tymidin (240 GBq /milli mole, BRIT, Navi Mumbai, India); Dimetylsulfoksid (MP biomedisinsk, Ohio, USA); Dynal kit for mRNA isolert (Dynal ASA, Oslo Norge).
innsamling og behandling av ledningen blodprøver
Ledningen blod (CB) prøver ble innhentet fra de lokale sykehusene i henhold til Institutional Review Board [Institutional etisk komité (IEC) and Institutional komité for Stem Cell Research (IC-SCRT)] -godkjent etiske retningslinjer som er i tråd med Helsinkideklarasjonen. En tidligere informert skriftlig samtykke fra moren ble oppnådd. Samtykket Prosedyren ble godkjent av IC-SCRT. Den harde kopier av den signerte samtykkeerklæringer er nummerert og sendt inn til oss. Prøvene ble samlet i sterile beholdere inneholdende konserveringsmiddel-fri heparin (40 IU heparin /ml blod) i vanlig IMDM. Prøvene ble bragt til laboratoriet på kjøleelementer og ble behandlet for å isolere mononukleære celler (MNC).
Isolering av MNC
Ledningen blod MNCer ble separert ved Ficoll- Hypaque-gradientsentrifugering. Cellene på interfase ble oppsamlet og vasket for å fjerne Ficoll-Hypaque. Med kjerne legemer (krystallfiolett farging) ble tatt og MNCs ble brukt til DC generasjon.
Isolering av T-celler fra perifert blod
Tilleggs blod ble samlet fra friske donorer i henhold til institusjonelle gjennomgang borde. [Institutional etisk komité (IEC) and Institutional komité for Stem Cell Research (IC-SCRT)] -godkjent etiske retningslinjer som er i tråd med Helsinkideklarasjonen. En tidligere informert skriftlig samtykke fra frisk donor ble oppnådd. Samtykket Prosedyren ble godkjent av IC-SCRT. Den harde kopier av den signerte samtykkeerklæringer er nummerert og sendt inn til oss. T-celler ble isolert fra blodet ved hjelp av negativ seleksjon kit (Rosette september) i henhold til produksjon instruksjon (Stem Cell Technologies). Etter Ficoll- Hypaque gradientsentrifugering celler på inter Ficoll og medium ble samlet, vasket deretter brukt i forsøkene.
In Vitro
generasjon og kultur DC
Utvidelse kulturer og plast tilslutning.
MNCer (fersk eller frossen) ble ekspandert i 3 uker, og deretter anriket for CD14 + -celler ved plastisk tilslutning og deretter differensiert som tidligere beskrevet [17], [20]. I korthet, etter 21 dager med vekst ble cellene vasket og sådd med en tetthet på 3 x 10
5-celler /brønn i seks-brønns plate inneholdende 2 ml IMDM supplert med 1% autologt plasma. Cellene ble holdt i 1,5 time ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator og den ikke-klebende, og de løst adherente celler ble fjernet ved vasking med IMDM. De adherente celler ble brukt til DC generasjon
Differensiering av DC fra forløpere i nærvær av AA (AA
+ DC) og fravær av AA (AA
– DC)..
De forløper-cellepopulasjoner ble delt i to sett. Celler ble indusert til å differensiere som DCS ved å dyrke dem i GM-CSF (50 ng /ml) og IL-4 (30 ng /ml) i 3 dager, på dag 3
rd GM-CSF (50 ng /ml) pluss TNF-α (30 ng /ml) tilsatt til kulturene og ytterligere holdt i 4 dager i IMDM supplert med 5% autologt plasma. For å vurdere effekten av AA, ble ett sett av kultur opprettholdt med 100 uM av AA i tillegg til de betingelser som er nevnt ovenfor. På dag 7 ble cellene underkastet modning med en kombinasjon av TNF-α, lipopolysakkarid, og CD40L, ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i hver, i 48 timer. Det eksperimentelle oppsettet er vist i form av et flytskjema fig. S1. I alle forsøkene DCs generert uten AA ble ansett som kontroll sett og med AA ble ansett som testsett
Morfologisk analyse:.. Wrights og Giemsa Farging
De følges celler i kulturplater ble fikset i metanol i 10 minutter ved romtemperatur og farget med Wright Giemsa og flekk. Observasjoner ble gjort i henhold invertert mikroskop og bildene ble tatt (Olympus IX70)
fenotypeanalyser: Flowcytometri
Moden AA
+ og AA
– DC ble vasket og suspendert.. ved 2 x 10
5-celler i 100 ul kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og farging ble utført i henhold til protokollen beskrevet [17], [20]. For CCR-7-farging, ble celler inkubert med primært etterfulgt av sekundære og tertiære antistoffer i 25 minutter hver. Cellene ble vasket to ganger, etter hvert antistoff-inkubasjoner og til slutt resuspendert i 1% paraformaldehyd. Cellene ble analysert på et strømningscytometer (FACS Canto II fra BD Pharmingen- San Jose, California). Celleavfall ble fjernet fra analysen ved hjelp av en gate på fremover og side scatter, og de totale celler ble analysert. Data ble analysert og histogram overlegg ble fremstilt ved bruk dataprogrammer FACS Diva og Cell quest Pro (Beckon Dickinson San Jose California), henholdsvis.
Funksjonell karakterisering
Endocytose analysen med FITC-dekstran.
Umodne DC høstet på dag 5 ble inkubert med FITC-dekstran (20 mg /ml), enten ved + 4 ° C (internkontrollen) eller ved + 37 ° C, i 30 og 60 minutter. Cellene ble deretter vasket tre ganger med kald PBS inneholdende 0,01% natriumazid og 1% BSA. Celler ble re suspendert i 1% paraformaldehyde og ble kjøpt på et flowcytometer (Canto II, BD).
Chemotaxis.
Den chemotaxis av
in vitro
generert DC mot CCL-19 ble undersøkt i 24-brønners cellekultur plater med BD Falcon
™ celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP 0,8 mikrometer innstikk. 500 ul IMDM med eller uten rhCCL-19 (sluttkonsentrasjon, 500 ng /ml) ble tilsatt til det nedre kammer i henhold til protokollen beskrevet [17], [20]. For å undersøke spesifisiteten av kjemokinreseptor (CCR) interaksjon, i noen eksperimenter DC ble forbehandlet med CCR-7 blokkerende antistoff i 1 time i 1 x PBS og deretter deres vandring mot CCL -19 ble undersøkt som beskrevet ovenfor. De migrerte celler ble farget ved trypan blå fargestoff, og de levedyktige celler ble telt ved bruk av hemocytometer. Resultatene er uttrykt som det gjennomsnittlige antall celler som migrerer ± standard avvik (SD).
blandede leukocyttkultur-reaksjon (MLR).
Allogen T-celler ble fordelt i 10
5 celler per godt inn i rundbunnede 96-brønners mikroplater (Greiner Bio-One) og ble cocultured i nærvær av graderte mengder bestrålte DC (2500 Rad, Co kilde) i 200 ul medium inneholdende 10% oppsamlet navlestrengsblod AB + plasma. Tymidin inkorporering ble målt på dag 3 etter en 18-timers puls med [
3H] tymidin (1 pCi /brønn) ved hjelp av standard prosedyrer [17], [20].
cytokin måling.
Supernatanter fra
in vitro
generert DC kulturer ble samlet inn på 48 timer etter tilsetting av modning stimuli og ble holdt frosset ved -20 ° C. Supernatantene ble deretter analysert med hensyn på innhold cytokin (IL-10 og IL-12 p70) ved ELISA ved anvendelse av et ELISA-kit i henhold til produsentens instruksjoner. Mengde interleukiner stede i supernatantene ble beregnet ved standardkurve metode.
In vitro
CTL (cytotoksiske T-lymfocytter) assay
Utarbeidelse av cellelysat.
MCF-7 er en HLA-A2 begrenset cellelinje og ble benyttet som mål-cellelinje CTL analysen. Lyse av MCF-7-celler ble gjort ved gjentatt frysetining deretter etterfulgt av sonikering. Etter filter sterilisering protein estimering ble gjort, og lysatet ble lagret ved -80 ° C for antigen pulserende til DCS.
Generering av effektor-celler og CTL analysen.
HLA-A2 positive ledning blod MNCs ble brukt til å generere DC. Umodne DC ble inkubert med lysat av MCF-7 ved en sluttkonsentrasjon på 100 pg /ml protein sammen med KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 25 ug /ml for 48 timer som modnings stimuli i dyrkningsmediet for kryss presentasjon av tumor antigen til autologe naive T-celler. For kontroll settet med DC, modningen stimuli består av 100 ng /ml hver av LPS, CD40L og TNF-α. De autologe naive T-celler ble oppnådd ved sortering av CD3, CD8, og CD45RA positive celler på FACS Aria (BD). De naive T-celler ble co dyrket med MCF-7 lysat pulset DC som ble generert fra samme UCB prøven med eller uten AA. DC-T-celle ko kulturen ble opprettholdt i 3 uker med tillegg av cytokiner IL-2 (0,1 ug /ml) og IL-7 (5 ug /ml) og ukentlig re stimulering med frisk antigen pulsert DC å generere effektor Cytotoksisk Killer Cells . CTL dermed generert fra LPS pulset og lysat pulset AA
+ DC /AA
– DC ble co dyrket med målcellene MCF-7 for 18 timer. Cellene ble deretter vasket med vanlig papir og deretter pulset med [3H] tymidin i 8 timer. Prosent drapet på MCF-7 ble beregnet ved P-JAM analyse [21], [22] med formel-% drapet = CPM [Target alene – Target + Killer]. X 100 /CPM Target Alene
RT PCR-analyse
mRNA ble isolert fra AA
+ DC og AA
– DC bruker Dynabeads mRNA DIREKTE kit i henhold til produsentens anvisninger. De eluerte mRNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av revers transkriptase (Sigma Aldrich) og oligo-dT primere (Invitrogen) som per instruksjonene og PCR ble utført med spesifikke primere. Den termiske syklusen som ble benyttet var (95 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 45 sekunder, annealing (i henhold til forskjellige gener) i 45 sek, forlengelse 72 ° C i 2 minutter) for 35 sykluser og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Primersekvensene som brukes er beskrevet i fig. S2.
Homing av modne DC i NOD-SCID-mus
NOD /LtSZ-SCID /SCID-mus ble innhentet fra Jackson Laboratories og ble avlet i dyre innretningen av vårt institutt. Studien ble gjennomført holde institusjonens retningslinjer for husdyrhold og har blitt godkjent av IAEC-NCCer /CPCSEA (Institutional dyreetiske komité-NCCer /Utvalget for hensikten med kontroll og tilsyn med dyreforsøk Godkjenningsnummer:. IACUC-Institutional Animal Stell og bruk komité, EAF-Experimental Animal Facility /2004 /B-71). Animal prosedyrer som involverer intra-venøse infusjon ble utført under bedøvelse. Mus på 4-6 ukers alder ble utsatt for sub dødelig dose på 300 rads helkroppsbestråling fra en
60Co kilde (Gamma Chamber 5000, BRIT, Navi Mumbai, India). 10
6 AA
+ DC og AA
– DC ble tilført gjennom halevenen inn i sub lethally bestrålte mus (n = 43; infusjon av AA
+ DC – 20 mus, AA
– DC – 20 mus og PBS – tre mus). Musene ble avlivet etter 18 timer for å vurdere homing av menneskelige DC i benmargen. Omplassert celler ble identifisert som like ved farging med human CD11c mAb. Murine CD 45,1 mAb ble brukt til å negere tilstedeværelse celler av muse opprinnelse
Statistisk analyse
Ulike variabler av AA
+ DC og AA
-. DCs ble sammenlignet. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av Sigma Stat (versjon-2.03) og grafer ble utarbeidet etter Sigma Plot programvare (versjon 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) og GraphPad Prism 5 programvare (San Diego, California, USA). Statistiske analyser av forskjeller mellom de to gruppene ble utført ved anvendelse av en t-test. Sannsynlighetsverdi: P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***) ble vurdert som statistisk signifikant.
Resultater
morfologiske og Fenotypisk Karakterisering av DC
The AA
+ DC og AA
– DCs viser lignende morfologi
DC forløpere generert etter 21 dager med utvidelse av MNCs ble beriket av plast etterlevelse metoden og videre differensiert som DCs [20].. Det var marginal forskjell i det absolutte antall DC som genereres av de to metodene fra samme antall utgangspopulasjon (ca. 3 x 10
7 AA
+ DC og 2,5 x 10
7 AA
– DC per 10
7 inngangs MNCs). Morfologi av AA
+ DC og AA
– DC var sammenlignbare. Det ble funnet at DCS fra begge settene oppviste den karakteristiske tilslørte morfologi og DC klynger; Fig. S3. Fase kontrast viste typiske adherente umodne DC, i begge settene [S-3 (A)]. Etter tilsetning av modnings stimuli ble observert typiske ikke-adherente DC klynger i begge kulturene [S-3 (B)]. Wright-Giemsa farging av modne heftende celler viser tilstedeværelse av DC med dendritter i de to settene [S-3 (C)]
The AA
+ DC og AA
-. DCs viser lignende DC fenotype.
In vitro
generert DCs ble farget for et panel av DC spesifikke og DC tilhørende markører og analysert på flowcytometeret. Fig. 1A viser strømningscytometrisk profilen for en representativ prøve med prosent positive celler og MFI-verdiene i parentes. AA
+ DC og AA
– DCs viste en høy og en tilsvarende andel av celler som uttrykker forskjellige samtidig stimulerende molekyler som CD40, CD80, CD86, DC-assosiert inte CD11c, adhesjonsmolekyler som CD54 og CD58, MHC klasse II molekyler som HLA ABC og HLA DR. Fig. 1B og 1C viser den fenotypiske profil i form av prosent positivitet og MFI henholdsvis av tre prøver (gjennomsnitt ± SD, n = 3). Ekspresjonen av myeloide cellelinjen spesifikk markør CD 33 ble funnet signifikant høyere på AA
+ DC (67,4%) sammenlignet med AA
– DC (38,7%) Fig. 1B. MFI-verdiene for adhesjonsmolekylet CD 58 ble funnet signifikant høyere på AA
+ DC (1423) sammenlignet med AA
– DC (1048) fig. 1C. Til sammen AA
+ DC og AA
– DC viser lignende morfologi og typisk interstitiell DC fenotype
(A) FACS histogram profilen til et representativt eksperiment.. Fylt histogrammer viser isotypekontrollantistoff og åpne de viser det spesifikke fenotype med respektive MFI verdier i parentes. (B) Det er sett at fullt modne DC ble generert, og det var ikke mye forskjell i uttrykket nivåer av ulike overflatemarkører, bortsett CD33 (myeloid avstamning) var høyere i AA
+ DC settene (gjennomsnitt ± SD, n = 3, P≤0.05 *). (C) Søylediagram for DC-spesifikke og assosierte markører i form av MFI, for CD 58 (adhesjonsmolekyl) den forskjell ble funnet signifikant høyere (gjennomsnitt ± SD, n = 3, P≤0.05 *). (D) Receptor mediert antigen opptak av AA
+ DC og AA
– DC: Dextran-FITC opptak av DC (n = 3, gjennomsnitt ± SD). Kontrollverdien (opptak ved 4 ° C) trekkes fra den respektive testverdi (opptak ved 37 ° C).
Funksjonell karakterisering av DC
Evnen endocytose av AA
+ DC var høyere i forhold til AA
-. DCs
Umodne DC kjennetegnes ved evnen til antigen opptak ved hjelp av ulike mekanismer. Vi analyserte enes evne til
in vitro-genererte
DC for deres reseptor-mediert opptak antigen ved måling av FITC-merket dekstran-opptak. AA
+ DC og AA
– DC var like effektiv i reseptor-mediert opptak på 30 min og 60 min tidsintervaller testet. AA
+ DC utstilt høy og sammenlignbar FITC-dekstran opptak i forhold til AA
– DC Fig. 1D (gjennomsnitt ± SD, n = 3).
In vitro
generert DCs utstilt flere opptak på 60 min intervall sammenlignet med 30 minutter, som viser at de er funksjonelt aktive og viser en økt opptak med økning i tid.
Økt
in vitro
kjemotakse av AA
+ DCs mot CCL19.
migrasjon av DCs mot en chemokin gradient er en viktig funksjonell eiendom fordi de immunterapi protokollene må de være i stand til migrasjon fra injeksjonsstedet mot lymfeknuter, hvor de samhandler med T-cellene og initierer immunresponsen. Fig. 2A viser, cellene suspendert i IMDM tilsatt til det øvre kammer i brønn ved 0 timer. Ingen spontan migrering ble observert i brønnene etter 3 timer, hvor CCL-19 ikke ble tilsatt (Fig. 2B). Mer antall AA
+ DC (Fig 2D.) Migrerte mot CCL-19 i forhold til AA
– DC (Fig 2C.) Og forskjellen var statistisk signifikant (* p≤0.05, ** p≤0.01 ; n = 3; fig. 2E). Migrasjon mot CCL19 er hovedsakelig fordi DCs uttrykke CCR7 reseptoren. Når vi farget DCS av de to settene for CCR-7 reseptor antistoff, AA
+ DC og AA
-. DCs viste 93,25% og 91,89% positive celler henholdsvis sammen med MFI-verdier i parentes (Fig 2F ). Mener MFI verdier av 3 prøver for AA
– DC var 821 ± 156 og AA
+ DC var 1089 ± 392. Dermed begge settene viste høy og tilsvarende nivå av CCR7 uttrykk. Spesifisiteten til CCR7-CCL19 reseptor-ligand-reaksjon ble ytterligere bekreftet ved å blokkere reseptoren med CCR-7 blokkerende Ab og deretter teste den vandrende evne. Som vist i fig. 2G var det en signifikant reduksjon i migrering av celler forbehandlet med blokkerende antistoffer i de to kulturer. Vandringen av testcellene var igjen signifikant høyere enn kontrollceller. Dette indikerte at tillegg av AA under differensiering trinn i DC forbedrer sin vandrende evne betydelig.
Etter 3 timer (B) ble ikke observert noen spontan migrasjon i brønnene, der CCL-19 ikke ble tilsatt. Mindre nei. AA
– DC (C) migrerte mot CCL-19 enn AA
+ DC (D). (E) AA
+ DC viste statistisk effektiv migrasjon mot CCL-19 i forhold til AA
– DC (n = 3, gjennomsnitt ± SD). (F) FACS histogram profil av et representativt eksperiment som viser ekspresjon av kjemokinreseptoren CCR-7 sammen med MFI-verdier i parentes. Fylt histogrammer viser isotypekontrollantistoff og åpne de viser det spesifikke fenotype. (G) Blokkering med CCR-7 Ab forårsaker betydelig reduksjon i migrering av både AA
+ DC og AA
– DC (n = 3, middelverdi ± SA). [P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].
AA
+ DC utstilt overlegen T-Cell stimulerende funksjon.
DC er preget av sin evne til å stimulere allogene T-celler . Denne evne ble vurdert ved MLR. MLR ble utført ved å blande AA
+ DC og AA
– DC med allogene T-celler fra perifert blod i forskjellige proporsjoner. Triplo ble tatt for hver konsentrasjon som testes. Proliferasjon av T-celler ble målt ved hjelp av tymidin-opptaksanalyse som beskrevet i metodene. Data fra fig. 3 (gjennomsnitt ± SD, n = 3) indikerer at AA
+ DC har høyere allostimulatory kapasitet. Forskjellene var statistisk signifikante ved fire av seks DC: T-celle-forhold testet. På 1:10 ratio, thymidine i AA
+ var høyere enn AA
-. Sett
AA
+ DC viste bedre T-celle stimulering enn AA
– DC , forskjellene var signifikante på fire av seks DC: T-celle-forhold testet (* P≤0.05, ** P≤0.01). Representative data fra tre uavhengige eksperimenter er vist. TdR = tymidin.
cytokin Profilen til AA + DC er mer gunstig for adoptiv immunterapi.
IL-12 ikke bare signaler for utviklingen av effektorfunksjoner i T-celler, men også programmer de celler for å overleve som funksjonelle minneceller [23].
In vitro
generert DC var i stand til å utskille et høyt nivå av IL-12 p70 og et lavt nivå av IL-10. AA
+ DCs viste en bedre IL-12 p70 sekresjon profil i forhold til AA
– DCS (Fig. 4). AA
– DC på Derimot hadde et høyere nivå av IL-10-sekresjon sammenlignet med AA
+ DC (n = 3). Forholdet IL12 /IL10 var høyere i AA
+ DC, som vist i fig. S4. Disse observasjonene tyder på at AA
+ DC har en bedre Th1 gunstig cytokin profil i forhold til AA
– DC, gjør dem til et bedre valg for klinisk anvendelse
Resultatene viser at DCs generert av begge. dyrkningsbetingelser var i stand til sekresjon av IL-12 p70 og IL-10. (A) AA
+ DCs viste en bedre IL-12 p70 sekresjon i forhold til AA
– DC. (B) På tilsvarende måte, AA
+ DC har lavt nivå av IL-10 sekresjon profil sammenlignet med AA
– DC. Dataene fra tre uavhengige prøver er vist (n = 3, middelverdi ± SA). [P≤0.05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].
AA
+ DC demonstrere høyere
in vitro
CTL aktivitet
Figur 5A viser CTL data fra en representativt utvalg. Det er tydelig at AA
+ DC er mer effektive i effektor funksjon av T-celler, dvs. å bringe om å drepe av MCF-7-celler i CTL analyse sammenlignet med AA
– DC. Drapet er betydelig høyere på fire forholdstall på effektor målcellen konsentrasjoner. De andre to prøvene viste også lignende trend (fig. S5). CTL avledet fra AA
+ DC utstilt en forbedret effektorfunksjon dvs. forbedret den generelle drap sammenlignet med CTL avledet fra AA
– DC. For den negative kontrollen sett, AA
+ DC og AA
– DCs settene ble modnet med LPS, TNF-α og CD40L [20]. Den CTL generert på denne måten var ikke effektive i å drepe målet MCF-7-cellelinjen. Ingen dreping ble observert i noen av disse settene (data ikke vist). Som en ekstra negativ kontroll for target spesifisitet, CTL hentet fra MCF-7 lysat primet DC ble brukt i CTL assay mot H1299 cellelinje, men ikke drap effekt ble sett i disse settene, så vel (CPM verdier for tymidin inkorporering i tilfelle kontroll var 12649,33 ± 30,73 SD. for pulset og unpulsed gruppe på høyeste mål til T-celle forholdstall var 12405,66 ± 36,35 SD og 12537,33 ± 27,47 SD henholdsvis).
(A) CTL data for en representativ prøve dvs. drapet på målet ( MCF-7) celler ved CTL generert av AA
+ DC /AA
– DC pulsert med MCF-7 cellelysat. CTL avledet fra AA
+ DC utstilt en forbedret effektorfunksjon dvs. forbedret den generelle drap sammenlignet med CTL avledet fra AA
– DC. Drapet er betydelig høyere på fire forholdstall på effektor målcellen konsentrasjoner. (* P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001). (B) Gene uttrykk profilen til tre viktige enzymer assosiert med AA sti sammen med husholdningsgenet GAPDH. Det er en betydelig oppregulering av transkripsjon nivå viktig enzym COX-2 i DCS dyrket i nærvær av AA.
De mRNA nivåer av viktige enzymer involvert i AA metabolisme er høyere i AA
+ DC
transkripsjonsnivåer av tre enzymer som er forbundet med arakidonsyre svei, som for eksempel COX-1, COX-2, PLA
2 ble påvist ved RT-PCR utført i henhold til standardmetoder. Gel bilder av RT-PCR er vist i fig. 5B. Fig.
