Abstract
Cetuximab, et kimært monoklonalt antistoff utviklet for målretting epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), har vært intensivt brukes til å behandle kreftpasienter med metastatisk kolorektalcancer og hode- og halskreft. Intakt antistoff immunglobulin G (IgG) som cetuximab har imidlertid noen begrensninger som høy produksjonskostnader og lav penetrasjonsrate fra blodkar i solid tumormasse på grunn av sin store størrelse. I forsøk på å overvinne disse begrensningene, utviklet vi cetuximab å skape enkelt kjede variable fragmenter (scFv-CH3; Minibody) som ble uttrykt i bakterie system. Blant tre konstruerte minibodies, fant vi at MI061 minibody, som er sammensatt av den variable tunge (V
H) og lett (V
L) region sammen med en 18-rest peptid-linker, viser høyere løselighet og bedre utvinning egenskaper fra bakterielysatet. I tillegg validert vi at renset MI061 forstyrrer ligand vesentlig binding til EGFR og blokkerer EGFR er fosforylering. Ved å bruke en protein microarray består av 16,368 unike menneskelige proteiner som dekker rundt 2400 plasma membran knyttet proteiner som reseptorer og kanaler, også viste vi at MI061 gjenkjenner bare EGFR, men ikke andre proteiner sammenlignet med cetuximab. Resultatene indikerte at Engineered MI061 beholder både bindende spesifisitet og affinitet av cetuximab for EGFR. Selv om det hadde relativt kort halveringstid i serum, ble det vist seg å være meget signifikant anti-tumor effekt ved å hemme ERK-reaksjonsveien i A431 xenograft modell. Til sammen gir vår studien overbevisende bevis for at konstruert minibody er mer effektive og lovende agent for
in vivo
målretting av solide svulster
Citation. Kim YP, Park D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et al. (2014) Effektiv terapeutisk tilnærming for hode- og nakkekreft etter en Engineered Minibody Targeting EGFR Receptor. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10,1371 /journal.pone.0113442
Redaktør: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 9 juli 2014; Godkjent: 23 oktober 2014; Publisert: 01.12.2014
Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT Future Planning (No. 2011-0030043 2012-R1A1A1013558). Dette arbeidet ble også støttet delvis av et stipend fra National R D program for Cancer Control, departementet for helse og velferd, Korea (131280). Sinil Pharmaceutical Company gitt støtte i form av lønn for forfattere YPK, SHL, WC, og JL. YL også mottatt lønn fra Samsung Advanced Institute of Technology (SAIT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk. YPK, SHL, WC, og JL er ansatte i Sinil Pharmaceutical Company og mottatt lønn fra dem. YL er ansatt i Samsung Advanced Institute of Technology (SAIT) og også mottatt lønn fra SAIT. Det er ingen produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er en av ErbB familie av reseptor tyrosin kinaser [1]. Ligand-mediert signalisering, for eksempel EGFR som enten PI3K /AKT eller RAS /ERK-reaksjonsveien regulerer diverse cellulære prosesser, inkludert celleoverlevelse, død, vekst, proliferasjon, og motilitet [2]. Dysregulering av EGFR ved dets overekspresjon eller mutasjon fører til utvikling av et bredt spekter av epiteliale cancere, f.eks bryst, tykktarm, hode og nakke, nyre, lunge, bukspyttkjertel, og prostatakreft [3] – [5]. Dette er en begrunnelse for utvikling av EGFR interferent som antitumormidler i cancerterapi [5]. Siste tiåret, to hovedklasser av EGFR-hemmer har blitt utviklet for å målrette EGFR. Den første klassen, tyrosinkinasehemmere inkludert gefitinib og erlotinib, virker ved kompetitiv binding til ATP lomme av EGFR. Den andre klassen, monoklonale antistoffer slik som cetuximab og panitumumabs kan interferere ligandbinding av EGFR [6], [7]. Begge klasser av midler vise signifikant anti-tumor-aktivitet i et område av EGFR-avhengige mus xenograft-modeller [7], [8]. Spesielt cetuximab, et monoklonalt antistoff rettet mot EGFR, har blitt nøye studert som et middel mot kreft godkjent av FDA for behandling av hode og nakke kreft [9].
målrettet behandling ved hjelp av intakte IgG som cetuximab har særlig forbedret dårlig prognose og total overlevelse hos kreftpasienter [10]. Men på tross av deres høye antitumor effekt, er bruk av intakte, hele IgG for kreftterapi begrenset på grunn av høye produksjonskostnader, på grunn av kravet til et pattedyr ekspresjonssystem, og dårlig inntrengningsraten inn i tumorvev [11]. Derfor har den bydende behovet for konstruert antistoff produsert fra bakteriell system er økt og en haug med studier har innført ulike strukturer konstruert minibody base på mangfoldet av intakt IgG [11], [12].
For å overvinne aktuelle saker, genererte vi enkelt kjede variable fragmenter (scFvs) uttrykt i
E.coli
basert på foreldrenes antistoff, cetuximab. De modifiserte scFv har ikke bare domenet orden V
H og V
L-regionen, men også fleksible polypeptidlinker sammensatt av 18 aminosyrerester mellom V
H og V
L-domener for effektiv produksjon og stabilitet. ScFv (heretter minibody) region var forbundet med C
H3
via
hengsel region. I denne studien, er konstruert minibody (V
H-18Linker-V
L-Hengsle-C
H3) ble karakterisert
in vitro Hotell og sammenlignet med cetuximab for sin
in vivo
søknad i xenograft modell.
Materialer og metoder
Bygging av MI045, MI053 og MI061 ekspresjonsvektorer
for å konstruere MI045 (VL-linker-VH ), DNA-fragmentene som koder for VL-domene og VH ble syntetisert basert på aminosyresekvensene (første til ett hundre og syvende aa) over kjede A av cetuximab Fab-fragment (GenBank tilgangsnummer. 1YY8_A) og aminosyresekvensene (første til ett hundre og nittende aa) av Chain B av cetuximab Fab fragment (GenBank tiltredelse no. 1YY8_B), henholdsvis. De klassiske (G4S) 3 sekvenser (GGGGSGGGGSGGGGS) ble anvendt som en linker [13]. Den MI053 ble laget ved en lignende fremgangsmåte med unntagelse av at lengden og sekvenser av linkeren, besto av 18 aa (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) avledet fra M218 Whitlow linker [14]. Den MI061 har samme struktur i sammenligning med MI053 bortsett domene rekkefølge av VH og VL. DNA-fragmentet som koder for et Hinge-CH3-domenet ble også syntetisert basert på aminosyresekvensene til human IgG-1. Hengselet sekvensen ble endret til 15 aa (EPKSPKSADKTHTAP). Kodonene var optimalisert for
E. coli
uttrykk. Hver scFv DNA-fragmenter ble fordøyd med
BamHI Hotell og
Hindi
og Hinge-C
H3 DNA fragment fordøyd med
Hindi Hotell og
XhoI
ble innsatt i pET26b. Disse konstrukter inneholdt pelB-ledersekvens ved N-terminal ende for periplasmisk ekspresjon i BL21 (DE3), og inneholdt 6-histidin-rester i C-terminale ende for affinitetsrensing.
Ekspresjon og rensing av minibody
Hver konstruere koding for MI045, MI053 og MI061 ble forvandlet til
E. coli
BL21 (DE3). Dyrkede kolonier ble dyrket ved 37 ° C over natten under kraftig omrøring, og deretter 1 ml av denne pre-kulturen ble inokulert i frisk 1 liter LB-næringsløsning. Protein-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av IPTG til en sluttkonsentrasjon på 0,4 mM når den optiske tetthet ved 600 nm nådde 0,5-0,6. Kulturene ble høstet og resuspendert med 100 ml PBS-buffer inneholdende 1 mM PMSF, 0,2 mg /ml DNase I, og 0,2 mg /ml RNase A, og deretter avbrutt ved sonikering. De løselige proteinekstrakter ble oppnådd ved sentrifugering ved 20 000 rpm i 20 min ved 4 ° C og inkubert med Ni
2 + -NTA resin kolonne (GE Healthcare Life Science, USA) i henhold til leverandørens manual. Kolonnen ble vasket med 30 kolonnevolumer PBS inneholdende 50 mM imidazol, og deretter bundne proteiner ble eluert med 10 kolonnevolumer PBS inneholdende 400 mM imidazol. De rensede proteiner ble analysert ved 12% SDS-PAGE. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt av bicinchoninic syre-metoden (Pierce, Rockford, IL, USA)
Menneske protein microarray
HuProt Menneskelig Proteome Microarray ble kjøpt fra CDI laboratorier (http:. //www.cdi-lab.com). Den Chip inneholder 16,368 unike full-lengde humane rekombinante proteiner i duplikat sammen med flere kontroll proteiner, slik som IgG, GST, BSA-biotin, og histoner som tidligere beskrevet [15]. Antigenbindende spesifisitet for både minibody og cetuximab (erbitux, Merck, Darmstadt, Tyskland) ble målt ved hjelp av Alexa-Fluor 546 eller 647-konjugert anti-humant IgG-antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mus anti-GST-monoklonalt antistoff (Invitrogen) ble anvendt som kontroll. I korthet proteinet brikken ble først inkubert med blokkeringsbuffer (5% BSA i PBS med 0,05% (v /v) Tween 20) i 30 min ved RT og deretter minibody (32 nM), cetuximab (32 nM) eller mus anti GST-monoklonalt antistoff ble videre inkubert under lifterslip (Thermo Scientific, USA) i 1 time ved RT. Etter vasking tre ganger med 1 x PBS inneholdende 0,05% Tween 20 ved forsiktig risting i 10 minutter hver, ble den microarray inkubert med Alexa-Fluor konjugert antistoff. Deretter ble microarray vasket tre ganger og deretter verdiene av sonde signal ble oppnådd ved hjelp av en GenePix Pro 6.0-programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Cell kultur og reagenser
A431 (KCLB, Seoul, Korea) celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( Sigma, St. Louis, MO, USA). Cellene ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 i en fuktig atmosfære.
flowcytometrisk analyse for antistoffbindingsanalysen
For å bekrefte cetuximab, MI053 og MI061 binding til EGFR , flow cytometri ble utført ved anvendelse av A431-cellelinjen som uttrykker høye nivåer av EGFR. Totalt 1 x 10
5-celler ble inkubert med cetuximab, MI053 eller MI061 ved 2 pg /ml i 30 minutter på is og vasket to ganger med fargebuffer (1% BSA /PBS), etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon med 4 ug /ml av et FITC-merket geite-anti-humant Fc-mAb (Sigma). Cellene ble analysert ved en Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Konkurransebindingsbestemmelse
A431 celler ble justert til 1 × 10
5 celler /rør og inkubert inneholdende 6 nM FITC-merket EGF-ligand (Molecular Probes, Leiden, Nederland) pluss de relevante kalde konkurrenter, som er cetuximab og MI061 (2 ug /ml) i 30 minutter ved 4 ° C. Følgende vasket tre ganger for å fjerne ubundne materialer, ble celler analysert ved hjelp av en Accuri C6 strømningscytometer (BD Biosciences) for å bestemme den relative mengde av bundet FITC-merket EGF.
Immunologiske måle
96 brønner Immunoplate (SPL, Seoul, Korea) ble belagt med sEGFR (Fitzgerlad Industries International, MA, USA) rekonstituert i 200 mM Na
2CO
3 (pH 9,6). Platen ble blokkert med 200 ul /brønn av 1X Blokkering oppløsning (Sigma), forseglet og lagret 4 ° C inntil bruk. Fortynninger av cetuximab (fra 2 mg /ml) ble fremstilt i en rekke 1:10-1:4096000 ved seriell fortynning med PBS for standardkurve. For immunoassay av minibody aktivitet, ble den fortynnet plasma (1:50) tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble hver brønn vasket tre ganger med PBS-T (fosfatbufret saltvann med 0,05% Tween 20) og 100 ul /brønn av 1:100 mus anti-humant IgG (C
H3 domene) antistoff (Thermo Scientific, Rockford , IL, USA) ble tilsatt. Den hver brønn ble inkubert i 1 time og deretter anti-muse-IgG-HRP (Sigma) sekundært antistoff ble tilsatt. For å evaluere minibody konsentrasjon i plasma, ble hver brønn vasket tre ganger med PBS-T og kanin-anti-human IgG Fab-spesifikke antistoff (Sigma) ble inkubert i 1 time sammen med anti-kanin IgG-HRP (Sigma) sekundær. Etter vasking med PBS-T, ble 100 ul /brønn TMB-substrat (Sigma) tilsatt til hver brønn og inkubert i 10 minutter ved RT. Reaksjonen ble stoppet av en MH
2SO
4 og platen ble deretter lese på en plateleser ved 450 nm.
For å bestemme halveringstiden for MI061, blodprøver ble samlet på ett , 3, 6, 24 og 48 timer etter den første injeksjon (ip, 0,3 mg /mus) og hepariniserte plasmaprøver ble separert umiddelbart etter sentrifugering (13.000 rpm i 5 min ved 4 ° C). Konsentrasjonen av minibody ble beregnet ved hjelp av ikke-kompartment metoder med BA beregnet: 2007 (KFDA, Seoul, Korea).
Fosforylering assay
fosforylering ble utført på A431-celler i nærvær av enten cetuximab fab (30 ug /ml) eller minibody (30 ug /ml). Etter dyrking i 8 timer ble cellene stimulert med 10 ng /ml EGF i 20 min ved 37 ° C. Cellene ble lysert og de fosforylerte EGFR protein nivåer ble målt ved hjelp av PathScan Phospho-EGF reseptor (Tyr845) Sandwich ELISA Kit (Cell signalering) i henhold til produsentens instruksjoner.
Xenotransplantat modell
seks- til sju uker gammel mannlig atymiske (nu /nu) mus ble kjøpt fra Nara biotech (Seoul, Korea). Musene ble holdt under patogen-frie forhold i mikroisolatorbur med laboratorie mat og vann tilgjengelig
ad libitum
. A431 xenotransplantater ble etablert av subkutant injisere mellom 5 × 10
6 celler /100 mL PBS i den venstre flanken av atymiske mus. Tumor volum ble beregnet etter 2-3 dager med en digital caliper og bruker følgende formel: Volum = lengde × bredde × høyde. Tumorene fikk vokse til et volum på 100 mm
3, og musene ble randomisert i grupper på seks dyr hver. Mus ble behandlet med saltvann Q3D, cetuximab ved 0,25 mg /mus (Q3D), cetuximab Fab på 0,25 mg /mus (Q3D), og MI061 på 0,25 mg /mus (q7d). Alle legemidler ble administrert av i.p. injeksjon. Behandling av dyr ble fortsatt under hele studien. Ved slutten av hvert tidspunkt ble musene bedøvet med CO
2 kvelning. Statistisk analyse av tumorvekst for hver av studiene ble bestemt av en
Student
«
s t test
bruke dataprogrammet SigmaStat (Jandel, San Rafael, CA, USA). Mus ble opprettholdt i samsvar med politikken til Konkuk University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Studien ble utført her ble godkjent av Konkuk University IACUC (Godkjenning nr .: KU14024).
Immunohistochemisry (IHC)
skåret tumorvev ble bevart i 10% nøytral bufret formalin for IHC farging. IHC fargingsfremgangsmåter for total EGFR var som følger: Paraffin ble tømt fra et lysbilde og inkubert med pepsin løsning i 15 min ved 37 ° C. Vevssnitt ble dekket med 3% H
2o
2 for å blokkere endogen peroksidase i 10 minutter ved romtemperatur. Lysbilder ble inkubert med anti-EGFR-antistoff ved 1:100 (Cell Signaling Technology, IL, USA) i 18 timer ved 4 ° C. Etter vasking med TBS, ble platene inkubert med et sekundært antistoff (DAKO Japan, Kyoto, Japan) i 30 minutter ved romtemperatur. Tissue farging ble visualisert ved hjelp av en DAB (3,3’diaminobenzidine) substrat kromogen løsning. IHC-farging for fosforylert EGFR-proteinet ble utført som følger: Etter den samme pre-prosessering av anti-EGFR-antistoff som beskrevet ovenfor, ble vevssnitt blokkert med protein blokk serumfritt for å forebygge ikke-spesifikke reaksjoner i 10 minutter ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med primært p-EGFR (Tyr845) antistoff ved 1:50 (celle signalisering) i 18 timer ved 4 ° C. Platene ble deretter inkubert med sekundært antistoff (DAKO Japan) i 15 min ved romtemperatur. Tissue farging ble visualisert ved hjelp av en DAB-substrat kromogen løsning. Glassene ble deretter kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert.
Western blot analyse
For western blot analyse av renset MI045 (0,23 mikrogram /kjørefelt), MI53 (0,55 mikrogram /kjørefelt) og MI061 (1,30 ug /fil), ble proteinprøvene opprinnelig separert på 12% SDS-PAGE-geler og overført på en nitrocellulosemembran (Thermo Scientific, USA). Membranen ble immunoblottet med primær anti-C
H3 domene antistoff A567H (Thermo Scientific, USA) og hvert protein ble visualisert ved hjelp av inkubering med sekundær HRP-konjugert anti-muse-IgG-antistoff. For å sjekke uttrykket nivåer av EGFR, p-EGFR, p-AKT, ERK og p-ERK i tumorceller ved hjelp av Western blot-analyse, tumormasser ble fjernet fra flanken av mus og homogenisert. Proteinprøver som inneholdt den samme mengde av totale proteiner (40 ug /brønn) ble ekstrahert og separert på 12% SDS-PAGE-geler og deretter overført på en nitrocellulosemembran. De primære antistoffer, EGF reseptor (celle signalisering), fosfor-EGF reseptor (Tyr1068) (Cell signalering), AKT pS473 (Rockland), P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Cell signalering), og fosfor-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) antistoff, ble anvendt for immunblotting i henhold til produsentens anbefalte forhold (1:1000). Membranen ble utviklet og visualisert ved hjelp av Pierce ECL Plus Western blotting substrat (Thermo Scientific, USA).
Resultater
Expression og karakterisering av konstruerte minibodies
Dette minibody utgangspunktet består av V
H og V
L domener sammen med en fleksibel peptidlinker, noe som kan påvirke stabiliteten og løseligheten av antistoff, og de ble koblet med C
H3
via
hengsel region. Her genererte vi tre minibodies bestående forskjellig lengde på linker eller omvendt bestilles V
H og V
L domener (fig 1A). Den første minibody som har forholdsvis kort linker ble navngitt MI045 og en annen minibody het MI053 at de har 15 eller 18-rester som en linker, respektivt. Sist en består av byttet V
H og V
L domene, og heter MI061. For å utforske naturen av tre konstruerte minibodies, uttrykk for hver minibody ble testet i
E. coli
som beskrevet av Hu et al. [16]. Løselig brøkdel av
E. coli
lysat anvendes affinitetskromatografi og resulterte i utvinningen av høyt foredlede minibodies uten fragmentations i western blot (fig 1B). Hver minibody viste forventede molekylvekt, og utvinningsgraden av MI053 og MI061 viste 3,4 eller 4,4 kaster høyere enn MI045, henholdsvis. Disse dataene tyder på at 18 rester av linkeren er faktisk tilstrekkelig strukturelt modell enn 15 rester for å beholde oppløseligheten. Interessant, fant vi at utvinning effektiviteten av MI061 er større enn MI053 (fig 1B). Disse data antyder at lengden på linker og domene orden av variable kjeder, som i sin tur påvirker løseligheten av antistoff, er forbundet med naturen av minibody.
(A) Skjematisk illustrasjon av konstrukter som koder hver minibody. (B) Rensing av His-merket minibody fra
E. coli
celler. BL21 (DE3) celler ble transformert med hver konstruksjon og minibody produksjonen ble indusert ved tilsetning av IPTG. Hans-merket minibodies ble renset ved hjelp av en Ni-NTA kolonne. De eluerte proteiner ble løst i 12% SDS-PAGE og visualisert ved enten Coomassie Brilliant Blue (CBB) eller immunoblot-analyse med et anti-CH3-domene-antistoff. Tallene indikerer utvinningsgrad sammenlignet med MI045. M; molekylær størrelse markør, 1; råekstrakt, 2; oppløselige proteiner, 3; pellet, 4; strømme gjennom, 5; vasking med 50 mM imidazol, 6; eluering med 400 mM imidazol, WB; western blot.
Aktivitet og spesifisitet av konstruerte minibodies
Basert på gjenvinning utbyttet av hvert minibody fra bakterielysatet, både MI053 og MI061 ble valgt for ytterligere studier. For å måle sin aktivitet avhengig domene orientering av variable regioner, vurderte vi i utgangspunktet deres bindingsaktivitet til EGFR. A431-celler som uttrykker høyt nivå av EGFR ble inkubert med antistoffer, og den etterfølgende endring i fluorescens-signalet ble målt ved hjelp av en laserbasert strømningscytometri-analyse. Følgelig er alle behandlede antistoffer fremkalt en endring i fluorescens-signalet er større enn den til den ubehandlede kontroll (figur 2A). Blant dem, cetuximab viste den høyeste bindingsaktivitet til EGFR. Spesielt fikk vi bekreftet at MI061 og MI053 også beholdt høy affinitet og var i stand til sterk binding til EGFR. Slektskapet mellom MI061and EGFR var sterkere enn affinitet mellom MI053 og EGFR. Disse data indikerte at domeneorden variable kjedene er forbundet med affinitet minibody. En alternativ tilnærming for å oppnå spesifisitet, ble det konkurranseanalyse utført ved bruk av et FITC-merket EGF-ligand med konseptet at forstyrrelser av interaksjonen mellom EGF og EGFR kan inhibere EGFR-aktivering og dens nedstrøms signalveien. Som et resultat ble cetuximab helt konkurrerte med EGF, mens behandling av MI061 delvis inhiberte binding med EGFR (figur 2B). For å bekrefte hemmende evne MI061, analyserte vi relativ fosforylering frekvensen av EGFR (Fig 2C). Fosforylering frekvensen av EGFR indusert av EGF ble analysert i A431-celler i nærvær av enten cetuximab Fab fragment (CT Fab), EGFR bindende regioner av cetuximab, eller MI061. Behandlingen av EGF med CT Fab undertrykket i forhold fosforylering til omtrent 50%. Tilsvarende behandling av EGF med MI061 viste også samme effekt sammenlignet med CT Fab. Selv om deres bindende affinitet og spesifisitet ble relativt lavere sammenlignet med cetuximab, MI061 var i stand til å sterkt gjenkjenne EGFR og undertrykke EGFR er fosforylering i cellesystem. For å validere antigenbindende spesifisitet MI061, brukte vi den menneskelige protein microarray chip, som inneholder 16,368 unike GST-merket full-lengde humane proteiner (fig 3A). Proteinet brikken ble behandlet parallelt med enten MI061 eller cetuximab i like molare forhold i 1 time ved RT. Proteinene bindende med antistoff ble påvist ved hjelp av Alexa-Fluor konjugert sekundært antistoff. Brikken ble deretter skannet med en GenePix 4100A skanner. For å normalisere Alexa-Fluor-signal, ble proteinet brikken deretter probet med et anti-GST-antistoff, etterfulgt av scanning. I hvert protein microarray chip, både MI061 og cetuximab viste lignende binding mønster i to eksemplarer med samme intensitet, henholdsvis (figur 3B). Også, i en høy drevet vis, at de bare bundet EGFR-proteinet, unntatt til kontroll proteiner slik som GST (fig 3B, nedre panel).
(A) EGFR-bindingsanalyse. Hvert antistoff ble inkubert med EGFR-overexpressed A431cells og deretter bindingsaffinitet til EGFR ble analysert ved FL1-H intensitet ved hjelp av strømningscytometri (FACS) (B) EGFR konkurranseanalyse. FITC-merket EGF ble inkubert med A431-celler, og dets bindingsaktivitet til EGFR ble overvåket ved FACS. For konkurransen analysen, ble EGF inkuberes cellene sammen med enten cetuximab (venstre panel) eller MI061 (høyre panel). (C) EGFR fosforylering assay. Den relative hastighet fosforylering av EGFR indusert av hvert antistoff ble evaluert ved ELISA ved anvendelse av et anti-EGFR fosfo-antistoff. EGF ble brukt som en kontroll for fosforylering av EGFR som angitt. Kvantifiserte data er uttrykt som middelverdi ± s. e. m.
* P 0,05. n.s, ikke signifikant.
(A) Skjematisk illustrasjon av protein microarray prosessen. (B) Protein Flisen ble inkubert med enten MI061 eller cetuximab, og antigen-antistoffinteraksjoner ble påvist ved hjelp av Alexa-Fluor konjugert sekundært antistoff. Etter vask ble hver brikke skannet av GenePix Scanner på 532 nm (Cy3) og 635 nm (Cy5). Hver verdi av sondesignaler ble oppnådd ved hjelp av GenePix Pro 6.0 programvare. Red signal indikerer antigen bindende intensitet både MI061 og cetuximab. Alle GST-fusjonsproteinene ble påvist ved hjelp av anti-GST-antistoff og visualisert ved grønn fluorescens som angitt. Hvite rektangler indikere forstørrelsesområde for bunnpanelet.
Antitumoreffekt av konstruerte minibody
For å evaluere og karakterplasma farmakokinetikk (PK) av MI061, ble farmakokinetiske parametre undersøkt i xenograft dyr. Etter intraperitoneral (ip) injeksjon av MI061 med 0,3 mg /injeksjon, C (maks), T (maks), areal under kurven (AUC) og t
1/2 ble målt som 14,4 mg /l, 1t , 24,8 mg • h /L og 4,3 timer, respektivt (figur 4A). Ifølge PK data fra MI061, ble antitumoreffekt av MI061 overvåket i A431-xenotransplantater modell. Hver av musene ble behandlet i 22 dager fra 13
th etter transplantasjon dag gjennom i.p. injeksjon med cetuximab, CT Fab etter 3 dager, eller MI061 ved daglig base på PK aktivitet. Injeksjon av antistoffer ikke påvirke kroppen vektøkning på A431 tumor xenopodet mus (Fig S1C). Tumorstørrelsen ble målt av målepunkter ved overflate tilnærming. Tumorstørrelse i bærergruppen viste en lineær økning i løpet av 22-dagers perioden og nådde størrelse omtrent 1200 mm
3 (figur 4B). Injeksjon av cetuximab eller MI061 undertrykte tumorvekst til 300 mm
3. Selv om MI061 ble injisert flere ganger enn andre antistoffer, viste det signifikant antitumoreffekt som cetuximab. Hver tumormasse hevet fra xenograft ble ekstrahert fra musene for å måle relativt tumorvolum (figur 4C). Interessant, injeksjon av MI061 inn i xenopodet mus bemerkelsesverdig undertrykket tumorvolumet til 25% sammenlignet med bærer-behandlede gruppe (figur 4D). Dermed viste MI061 lignende anti-tumor effekt sammenlignet med cetuximab-treat gruppe
in vivo
. Samlet disse dataene understøttet at renset MI061 fra bakterielt system kan anvendes for klinisk anvendelse som et anti-tumormiddel.
(A) Farmakokinetikk av MI061 minibody. Blodprøver for farmakokinetikk MI061 ble oppsamlet ved 1, 3, 6, 24 og 48 timer etter den første intraperitoneal injeksjon (i.p., 0,3 mg /mus) og deres konsentrasjon ble beregnet ved hjelp av ikke-kammer metoder. (B) tidsforløpet av endringen i tumorstørrelse. Atymiske nakne mus ble behandlet med kjøretøy eller med cetuximab eller med cetuximab Fab hver 3. dag, eller med minibody daglig i 10 dager ved i.p. injeksjon (0,25 mg /mus). Behandlingen ble startet når svulsten størrelse nådde 100 mm
3 etter xenograft. Tumorstørrelsen ble målt av målepunkter i løpet av eksperiment dager. (C) Representative resultatene av A431 tumormasser. (D). Relativ tumorvolumet. Størrelsen på A431-tumormasser som fjernes fra atymiske mus behandlet hvert antistoff ble målt av målepunkter og er angitt som relative volum sammenlignet med cetuximab behandlede gruppen. Kvantifiserte data er uttrykt som middelverdi ± s. e. m.
* P 0,05
Effekten av konstruerte minibody på EGFR nedstrøms signalveien
uttrykk nivåer av EGFR og fosforylert-EGFR (p-EGFR) ble analysert fra A431 tumorsnitt som vist i fig 5A. I sammenligning med kjøretøygruppe, ble fargeintensitetene av både EGFR og p-EGFR bemerkelsesverdig redusert i alle grupper behandlede antistoff. For å få den MI061 effekt på EGFR nedstrøms signalveien, ble hver tumormasser lysert. De ble analysert for aktiveringsstatusen til nedstrøms signalmolekyler, etterfulgt av EGFR aktivering. I likhet med immunhistokjemi data mot EGFR og p-EGFR, fant vi at uttrykket nivået av EGFR ble betydelig redusert i gruppen behandlet enten CT Fab eller MI061 (Fig 5B). I tillegg nivåene av både p-EGFR og p-ERK bare ble fullstendig undertrykket i den MI061-behandlede gruppen, men ikke i den andre gruppen (figur 5B). I motsetning til dette, CT Fab bare hemmet fosforylering av AKT (figur 5B). Disse data antydet at CT Fab og MI061 kan være involvert i forskjellige nedstrøms signalveien, til tross for en tilsvarende inhiberende effekt på fosforylering av EGFR
in vivo
. Samlet utgjør disse resultatene viste at høyere anti-tumor effekt av MI061 sammenlignet med cetuximab i A431 xenopodet modell, støtte relevansen av videre studier for bruk av MI061 å levere antikreftmiddel
in vivo
.
(A) Fosforylering av EGFR. Det fosforylerte EGFR av frosne delen av A431-tumor-vev ble analysert ved immunhistokjemisk farging under anvendelse av p-EGFR (Tyr 845) antistoff. Målestokk = 200 um (B) EFGR nedstrøms signalveien i tumor Lysatet ble analysert ved western blot ved anvendelse av hvert antistoff som angitt. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Tumor-målrettet terapi ved hjelp intakt hele IgG har blitt nøye studert for kreftpasienter i en rekke forskere og førte til en bølge av FDA-godkjente antistoffer [6] – [10]. Derfor har bemerkelsesverdige resultater blitt oppnådd i kreftterapi, men det er fortsatt noen begrensninger ved bruk hel IgG for behandling av cancerpasienter. Disse inkluderer ekstremt høye produksjonskostnader og farmakokinetikk versus vevspenetrasjon [17], [18]. For å overvinne disse ulemper, har forskere vært forsøkt for å redusere størrelsen av antistoffet for den effektive produksjon i bakteriesystemet og forbedre inntrengningshastigheten av antistoff for effektiv terapi [16], [19]. I denne studien har vi også generert tre minibodies avledet fra Cetuximab og undersøkt egenskaper og anti-tumor effekt av dem
in vitro
og
in vivo
.
Mange forsøk har vært foretas for å danne antistoffer for human terapeutisk anvendelse i pattedyrceller. Imidlertid er transfekterte pattedyrceller ikke foretrukket som et ekspresjonssystem som følge av lave nivåer, langsom vekst og dyre næringsmedier [20]. Disse problemene kan løses ved å bruke en
E. coli
ekspresjonssystem for å produsere store mengder av rekombinant protein. Selv om det er noen begrensninger som intracellulære akkumuleringen, samtidig faren for nedbrytning og produksjon av endotoksin, har mye vært benyttet for rekombinant proteinproduksjon på grunn av sin evne til å vokse raskt, ved høy tetthet på billig substrater og forholdsvis enkel håndtering [20] . Dessuten har de forskjellige rekombinante teknikker aktivert produksjon av antistoff-fragmenter med forskjellige størrelser [11], [16], [19], [21]. Minibody (scFv-C
H3), en av dem, kan uttrykkes i bakterie system og deres lille størrelse og lave molekylvekter tillate rask og enkel vevspenetrasjon [22]. På tross av forbedret teknologi og tung forskning, men det er fortsatt begrensninger når det gjelder produktivitet og termisk stabilitet av minibody [22]. Vanligvis scFv vis lav termisk stabilitet og har en tendens til å denaturere eller aggregat under betingelsene for kliniske anvendelser på grunn av den forholdsvis svake V
H-V
L interaksjon [22]. For å erobre lav stabilitet, noen forskere fokusert på lengden på linker, forlengelse av rester i linker litt forbedret stabilitet scFvs [23]. Vi testet også termiske stabilitet for både MI045 og MI053 og fant at MI053, som har 18 rester som en linker, er mer stabil i stedet for MI045 i løpet av 48 timer (fig. S1D og Materialer og metoder S1). Noen studier har rapportert at domene orientering V
L-V
H regionen på scFvs er strukturelt viktig til høyere utvinningsgrad av løselig protein [24].
