Abstract
Mange studier vist unike mikroRNA profiler i lungekreft. Likevel, rolle og tilhørende signalveier fra Mir-375 i lungekreft er i stor grad ukjent. Vår studie undersøkte sammenhengen mellom kreftutvikling og MIR-375 i adenokarsinom, plateepitelkarsinom og småcellet lungekreft for å identifisere nye molekylære mål for behandling. Vi evaluerte 723 microRNAs i microdissected kreftceller og tilstøtende normale celler fra 126 snap-frosset lunge prøver ved hjelp av mikromatriser. Vi validert uttrykket profiler av MIR-375 og dets 22 mulige mål mRNA i en uavhengig kohort av 78 snap-frosset lungekreft vev ved hjelp av kvantitativ revers-transkriptase PCR. Videre utførte vi dobbelt luciferase reporter analysen og Western blot på 6 målrettede gener (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
LRP5
,
PIAS1 Hotell og
RUNX1
) i småcellet lungekreft cellelinje NCI-H82. Vi oppdaget også effekten av MIR-375 på celleproliferasjon i NCI-H82. Vi fant ut at Mir-375 uttrykk var signifikant oppregulert i adenokarsinom og småcellet lungekreft, men nedregulert i plateepitelkarsinom. Blant de 22 mulige målgener, 11 viste signifikant forskjellige uttrykk nivåer i minst 2 av 3 parvise sammenligninger (adenokarsinom vs normal, plateepitelkarsinom vs. normal eller småcellet lungekreft vs. normal). Seks målrettede gener hadde sterk negativ korrelasjon med uttrykket nivået av MIR-375 i småcellet lungekreft. Videre undersøkelser viste at MIR-375 direkte målrettet 3’UTR av
ITPKB
mRNA og over-uttrykk for MIR-375 førte til betydelig redusert ITPKB protein nivå og fremmet cellevekst. Dermed vår studie demonstrerer differensial uttrykk profiler av MIR-375 i 3 undergrupper av lungekarsinom og finner thatmiR-375 direkte rettet mot
ITPKB Hotell og fremmet cellevekst i SCLC cellelinje
Citation.: Jin Y, Liu Y, Zhang J, Huang W, Jiang H, Hou Y, et al. (2015) uttrykk for MIR-375 er forbundet med Karsinogenese i tre undergrupper av lungekreft. PLoS ONE 10 (12): e0144187. doi: 10,1371 /journal.pone.0144187
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 19 juni 2015; Godkjent: 13 november 2015; Publisert: 07.12.2015
Copyright: © 2015 Jin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 81472174 og 81401879), Science and Technology Commission av Shanghai kommune (nr 14411965900 og 14ZR1406100 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft har lenge vært den ledende årsak til kreft dødsfall hos menn over hele verden [1]. Histologisk er lungekreft klassifisert i to hovedklasser, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). NSCLC er en heterogen gruppe som består av 2 vanligste subtyper, dvs. plateepitelkarsinom (SQ) og adenokarsinom (AC) [2] .Despite forbedringene i tidlig diagnose og nyere gjennombrudd i chemo /målrettet terapi, den generelle fem års overlevelse av lungekreft er fortsatt lav og tilbakefall er høy [3] .Poor prognose er på grunn av sen sykdom presentasjon, hetrogeniteter, og relativt begrenset forståelse av tumorbiologi. Derfor ville oppdagelsen av nye molekylære markører og mål for diagnostisering og behandling av lungekreft spille sentrale roller i bedre prognose.
mikroRNA (miRNA) er en klasse av endogent uttrykt, ikke-kodende små RNA med rundt 22 nukleotider. Det har vist seg at miRNA skanne regulere genekspresjon på posttranskripsjonelt nivå gjennom ufullkommen baseparring med det 3′-ikke-translaterte området (3’UTR) av mål-mRNA [4]. Økende bevis tyder på at deregulering av miRNAs kan bidra til visse krefttyper, inkludert lungekreft. Mange studier har vist unike miRNA profiler i lungekreft [5-7] .I vår forrige undersøkelse på undersøkelse av miRNA biomarkører i 3 undergrupper av lungekarsinom, fant vi betydelig oppregulering av mikroRNA-375 (MIR-375) uttrykk nivåer i AC og SCLC men nedregulering av MIR-375 i SQ [8]. Vi hypotese at MIR-375 kan være en kandidat onkogen i AC og SCLC men en tumor suppressor i SQ. Faktisk fenomener av en enkelt miRNA som spiller hver sin rolle under svulst patogenesen, enten som et onkogen eller som en tumor suppressor, har blitt rapportert i ulike kreftformer [9-11] .I tillegg oppregulering av MIR-375 i SCLC ble nylig rapportert [12, 13]. Men signalveier som reguleres av MIR-375 og rollen til MIR-375 i lungekreft er fortsatt i stor grad ukjent.
Vi undersøkte rollen MIR-375 i kreftutvikling av 3 lungekarsinom subtyper å identifisere nye molekylære mål for diagnostisering og behandling av lungekreft. I denne artikkelen viser vi vellykket validering av distinkte Mir-375 uttrykk profiler i de 3 subtyper. Videre presenterer vi uttrykk profiler av 22 antatte målet mRNA fra Mir-375 i tre lunge Carcer subtyper. I tillegg viser vi at MIR-375 fremmer cellevekst i SCLC cellelinje og hemmer ITPKB uttrykk på posttranskripsjonelt nivå ved direkte rettet mot 3’UTR av
ITPKB
mRNA.
Materialer og Metoder
kliniske prøver
den lokale etikkomiteen godkjent studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. For utvalgs, ble rutinemessig histologisk klassifikasjon brukes etter World Health Organization Klassifisering av lungesvulster [2] sikret diagnosen AC ble bekreftet av fravær av keratinization eller inter broer og positiv TTF1 farging. SQ diagnose ble bekreftet ved intercellulære broer eller positiv P63 farging (minst 40% av tumorceller). For alle SCLC tilfeller var det full enighet om nevroendokrin morfologi, små celler og nevroendokrin positiv farging. Hvis det var uenighet ble det enighet ved påvisning av TTF1 /P63. Alle saker ble uavhengig vurdert av 2 erfarne lungekreft patologer. Pasienter som hadde fått preoperativ strålebehandling eller cellegift ble ekskludert. De kliniske kjennetegn er presentert i tabell 1.
RNA isolering
Total RNA fra de frosne vevssnitt ble utvunnet ved hjelp av Mirvana miRNA isolasjon kit i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Foster city, CA). Konsentrasjonen ble kvantifisert ved Nanodrop spektrofotometer 1000 (Nanodrop Technologies, Waltham, MA). Kvalitetskontroll av RNA ble utført av en 2100 Bioanalyzer hjelp av RNA 6000 Pico LabChip kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Kvaliteten ble målt ved bruk av RNA integritet nummer (RIN). En RNA-prøve ble forkastet dersom RIN resultatet var mindre enn 5,0.
QRT-PCR
kvantitativ revers-transkriptase-polymerase-kjede-reaksjon (QRT-PCR) ble utført på 78 macrodissected frosset lunge vev å validere uttrykk profiler av MIR-375 og dets antatte målrettede gener i 3 undergrupper av lungekarsinom. I valideringen av MIR-375, ble QRT-PCR utføres ved hjelp av TaqMan mikroRNA analyser (Applied Biosystems, Foster City, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Den U47 liten kjerne RNA ble anvendt som et endogent kontroll. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
For 22 spådd målgener av Mir-375 (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
CSNK2A1
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
JAK2
,
JUND
,
LAMC1
,
LRP5
,
MAP3K5
,
NLK
,
PAK7
,
PDGFC
,
PDPK1
,
PIAS1
,
RUNX1
,
RyR2
,
SOCS5
,
SP1 Hotell og
WNT5A
) , QRT-PCR bruker SYBR Grønn PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
GAPDH
ble anvendt som en endogen kontroll. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Primer sekvenser er tilgjengelig på forespørsel. Eksklusjonskriterier for statistisk analyse er som følger: 1) Et mål genet som viste syklus terskel (CT) verdier over 35 sykluser i 20% av de testede prøvene og 2) En prøve som viste CT-verdier over 35 sykluser i 20% av de testede genene.
Target prediksjon og sti analyse
Målene fra Mir-375 ble spådd gjennom porten miRecords (https://mirecords.biolead.org/). For å øke prediksjonsnøyaktigheten, ble genene som ble spådd av minst fire av 11 databaser (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid og targetscan) valgt som mål.
KEGG database (https://www.genome.jp/kegg/tool/search_pathway.html) ble brukt til å kartlegge den anslåtte mål å lungekreft forbundet veier.
Cells
En SCLC cellelinje NCI-H82 ble vennlig levert av Dr. Xueliang Zhu (institutt for biokjemi og cellebiologi, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) [13]. NCI-H82 stabilt transdusert med MIR-375-uttrykk (H82-MIR-375) eller tom (H82-NC) lentiviruses ble opprettholdt i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS). SV40-transformerte embryonisk nyrecellelinje 293T, erholdt fra American Type Culture Collection, ble holdt i DMEM med 10% FBS.
Vector konstruksjon
Seks antatte målrettede gener (
ITPKB
,
RUNX1
,
LRP5
,
PIAS1
,
FZD8 Hotell og
ITGA10
) som hadde sterk negativ korrelasjon med Mir -375expression nivå i SCLC ble valgt for funksjonelle studier. Av de 6 målrettede gener, det 3’UTR av
ITPKB
mRNA inneholdt 3 mulige målområder for MIR-375 (målområde 1: frø 1667-1673, målområde 2: frø 2463-2469 og målområde 3 : frø 2513-2519). To forskjellige segmenter av
ITPKB
3’UTR, utpekt ITPKB-Δ1 (målområde 1) og ITPKB-Δ2 (målområde 2 og 3), ble klonet, respectively.Schematic representasjon av
ITPKB
3’UTR og de antatte bindingsseter for MIR-375 er vist i S2 fig.
å konstruere Mir-375 uttrykk vektor (pS-MIR-375), et DNA fragment som koder MIR-375 pre-miRNA (flankerer oppstrøms og nedstrøms 30-50 nt) ble forsterket og satt inn i
Bam
HⅠ og
Hind
ⅲ nettsider for å uttrykke vektoren pSilencer4.1 CMV-puro. Mir-375-uttrykke lentiviral vektor ble konstruert med Ubi-EGFP-MCS-IRES-puromycin.
For å konstruere villtype 3′-UTR pGL3 journalister (pGL3-ITPKB-Δ1, pGL3-ITPKB-ô2 , pGL3-RUNX1, pGL3-LRP5, pGL3-PIAS1, pGL3-FZD8 og pGL3-ITGA10), DNA-fragmenter av den anslåtte målrettede gener inkludert de antatte MIR-375 bindende sekvenser og XbaⅠrestriction nettsteder 100 bp ble syntetisert og klonet inn i XbaⅠ nettstedet umiddelbart nedstrøms for stoppkodonet i pGL3-promoter vektor. Muterte 3′-UTR pGL3 journalister (pGL3-ITPKB-Δ1-Mut1, pGL3-ITPKB-Δ2-Mut2, pGL3-ITPKB-Δ2-Mut3, pGL3-RUNX1-mut, pGL3-LRP5-mut, pGL3-PIAS1-mut, pGL3-FZD8-mut og pGL3-ITGA10-mut), som fraktet den muterte sekvens i komplementær stedet for frø regionen MIR-375, ble generert basert på villtype 3′-UTR pGL3 reportere ved stedsspesifikk mutagenese. Alle klonet produkter ble verifisert ved sekvensering. Primere for kloning MIR-375 og oligonukleotider for målet 3’UTR konstruksjon er presentert i S1 tabell.
Luciferase reporter analysen
293T celler ble sådd i 96-brønns plate. Cellene ble co-transfektert med 2 ng av en intern kontroll vektor PRL-Renilla (Promega, Madison, WI), 40 ng av forskjellige 3′-UTR pGL3-promoter journalister, 160 ng av MIR-375 ekspresjonsvektor (PS-MIR -375) eller tom kontroll (pS-negative). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter analysert ved hjelp av Dual-Glo Luciferase assay system (Promega, Madison, WI). Luciferase-aktivitet av hver prøve ble normalisert ved Renilla luciferase-aktivitet. Den normaliserte luciferase-aktivitet for pS-negativ ble angitt som relativ luciferaseaktivitet 1. Alle forsøk ble utført in triplo, og uavhengig av hverandre repeated3 ganger.
Western blot
NCI-H82-celler ble infisert med mir -375-uttrykke (H82-MIR-375) eller tom (H82-NC) lentivirus ved en MOI av 80. infeksjon effektivitet var ca 100% som vurderes av mikroskopi av GFP fluorescens. Cellene ble høstet etter 72 timer. Totalt protein av cellene eller friske vev (2 AC, 2 SQ, tre SCLC og 1adjacent normalt vev) ble fremstilt ved hjelp av RIPA lysebuffer. Cell proteinlysatene ble separert i 10% SDS-polyakrylamidgeler, elektro overført til polyvinylidenedifluoride membraner (Roche, Pleasanton, CA), deretter oppdaget med antistoffer inkludert anti-ITPKB (for cellelinje: ab171984, Abcam, for vev: NBP1- 81589, Novus Biologicals), anti-RUNX1 (ab54869, Abcam), anti-LRP5 (ab38311, Abcam), anti-PIAS1 (ab77231, Abcam), anti-FZD8 (ab155650, Abcam), anti-ITGA10 (ab118099, Abcam), anti -GAPDH (Santa Cruz) og peroxidise-konjugert sekundære antistoffer (Santa Cruz). Intensiteten av proteinfragmenter ble kvantifisert ved hjelp Antall One-programvaren og ble normalisert ved GAPDH.
CCK-8 analysen
NCI-H82 celler ble infisert med MIR-375-uttrykke (H82-speil 375) eller tom (H82-NC) lentivirus som nevnt ovenfor. H82-MIR-375 eller H82-NC-celler ble sådd ut i 96-brønners plater. Cellene ble inkubert i 24 timer, 48 timer og 72 timer, henholdsvis. CCK-8-reagens (DOJINDO) ble tilsatt til hver brønn 3 timer før utløpet av inkubasjonstiden. Optisk tetthetsverdi (OD) av hver prøve ble målt ved en bølgelengde på 450nm. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og uavhengig repeated3 ganger.
Statistisk analyse
For microarray data, enveis variansanalyse (ANOVA) med Benjamini-Hochberg korreksjon (p ≤ 0,001) ble utført å bestemme forskjellig uttrykt mirnas blant normale, AC, SQ og SCLC vev. Hierarkisk clustering ble utført med Pearson korrelasjon med de forskjellig uttrykt mirnas
For QRT-PCR data, en uparet, ulik varians
t
-test med Benjamini-Hochberg korreksjon (p 0,05). Den brukes på MIR-375 og differensielt uttrykt målrettede gener i sammenligninger av AC vs normal, SQ vs. normal og SCLC vs. normalt vev. De målrettede gener med korrigert p 0,05 og brett uttrykk endring 2 ble valgt som kandidater for videre funksjonelle studier. Alle p-verdiene var tosidig.
Andre metoder, inkludert laser capture mikrodisseksjon (LCM), er macrodissection og microarray hybridisering beskrevet i S2 File.
Resultater
Den speil 375 uttrykk profiler i tre undergrupper av lungekarsinom
i en microarray analyse, ble uttrykket profiler av 723 mennesker mirnas undersøkt i valgt LCM kreftcellepopulasjoner og normale celler avledet fra 36 AC, 30 SQ, 16 SCLC og 44 tilstøtende normale vev. Fig 1A viser hierarkisk clustering av differensial uttrykk nivåer av miRNAs i 3 undergrupper av lunge Kreftsvulster og normal lungevevet. Den samlede miRNA uttrykket profiler tydelig delt prøvene inn i fire hovedgrupper: AC, SQ, SCLC og normalt vev. Oppregulering av MIR-375 ekspresjonsnivået ble observert noe i AC og betydelig i SCLC, mens merket nedregulering av MIR-375-ekspresjon ble observert i SQ (fig 1B og tabell 2).
A, hierarkisk gruppering av miRNA uttrykk profiler i AC, SQ, SCLC og normal lungevevet på mikromatriser. Den midlere signal fra biologiske duplikate prøver ble anvendt for gruppering. Fargede linjer indikerer omfanget av normaliserte log2 baserte signaler. B, En interaktiv dot diagram av MIR-375 normaliserte signaler på mikromatriser. C En interaktiv dot diagram av MIR-375 normalis CT verdier på QRT-PCR. AC: adenokarsinom, SQ: plateepitelkarsinom, SCLC. Småcellet lungekreft
Uttrykket profiler av MIR-375 i 3 lunge karsinom subtyper ble ytterligere bekreftet i en uavhengig kohort av 78 snap-frosset kirurgiske lunge vev ved hjelp QRT-PCR. Tilsvarende MIR-375 uttrykk var signifikant oppregulert i AC og SCLC men nedregulert i SQ (fig 1C og tabell 2).
Foreningen av MIR-375 uttrykk med lunge kreft
Vi identifiserte 191 gener gjennom gateway miRecords å bli assosiert med MIR-375. Etter kartlegging til KEGG veien databasen ble 22 gener identifisert til å være involvert i viktige signalveier i lungekreft (S2 tabell.).
uttrykk nivåer av de 22 mulige målgener ble neste bestemt i 78 macrodissected frosset lungevev. Uttrykket profiler av de antatte målet mRNA i 3 undergrupper av lunge Kreftsvulster er presentert i tabell 3. Av de 22genes, 11 (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
JUND
,
LRP5
,
PIAS1
,
RUNX1 Hotell og
RyR2
) hadde markert forskjells uttrykk nivåer i minst 2 av 3 parvise sammenligninger av AC vs normal, SQ vs. normal eller SCLC vs. normalt. Bortsett
ACSL3
, alle de 11 mulige målgener viste signifikant nedregulering i alle de 3 lunge carcinomasubtypes. Omvendt,
ACSL3
viste over 10 ganger oppregulering når compareits uttrykksnivået i SCLC som i normalt vev (p = 0,011). To gener (
CSNK2A1 Hotell og
MAP3K5
) viste differensial uttrykk nivåer i SQ vs. normal sammenligning bare. Tre gener (
NLK
,
PDPK1 Hotell og
SP1
) viste differensial uttrykk i SCLC vs. bare vanlig kontroll. To gener (
JAK2 Hotell og
LAMC1
) viste sammenlignbare uttrykk nivåer i de 3 sammenligninger, mens andre 4 gener (
PAK7
,
PDGFC
,
SOCS5 Hotell og
WNT5A
) ikke passere kvalitetskontrollen der målet genet viste CT-verdier over 35 sykluser i 20% av de testede prøvene.
Korrelasjonen av MIR-375 nivå med target mRNA uttrykk
I sammenligningen av AC vs. normal (2A), sterke negative korrelasjoner ble observert mellom uttrykket nivået av MIR-375 og at av 10 mulige mål mRNA (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
JUND
,
LRP5
,
PIAS1 Hotell og
RyR2
). I sammenligningen av SQ vs. normal (Fig 2B), ble sterke positive korrelasjoner oppdaget mellom uttrykket nivået av MIR-375, og at av 13 mulige mål mRNA (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
CSNK2A1
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
JUND
,
LRP5
,
MAP3K5
,
PIAS1
,
RUNX1 Hotell og
RyR2
). I sammenligningen av SCLC vs. normal (Fig 2C), ble sterke negative korrelasjoner funnet mellom uttrykket nivået av MIR-375, og at av 6 mulige mål mRNA (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
LRP5
,
PIAS1 Hotell og
RUNX1
), mens observert sterke positive korrelasjoner mellom uttrykket av MIR-375 og den til 4 antatte målet mRNA (
ACSL3
,
NLK
,
PDPK1 Hotell og
SP1
).
A, Korrelasjonen av MIR-375 med mål mRNA uttrykk i sammenligningen av AC vs. normalt. B, Korrelasjon av MIR-375 med target mRNA uttrykk i sammenligningen av SQ vs. normalt. C, Korrelasjon av MIR-375 med target mRNA uttrykk i sammenligningen av SCLC vs. normalt. Grønn sirkel: nedregulering. Rød sirkel: oppregulering. Hvit sirkel: genet viste ikke dette uttrykket i parvis sammenligning av AC vs normal, SQ vs. normal eller SCLC vs. normalt. Blå sirkel: genet ikke passere kvalitetskontrollen. AC: adenokarsinom, SQ: plateepitelkarsinom, SCLC. Småcellet lungekreft
ITPKB: et direkte mål på MIR-375
Dual luciferase reporter analysen ble utført på seks målrettet gener (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
LRP5
,
PIAS1 Hotell og
RUNX1
) som hadde sterk negativ korrelasjon med uttrykket nivået av MIR-375 i SCLC. For de 3 mulige målse på 3’UTR av
ITPKB
mRNA, luciferase aktiviteten reporteren bærer for 2. og 3 villtype (ITPKB-Δ2) ble betydelig undertrykt av MIR-375, mens luciferase aktiviteten på nettstedet en villtype (ITPKB-Δ1) var upåvirket. Viktigere, siden to mutant (ITPKB-Δ2-Mut2) ble ikke angrepet av MIR-375, mens den for 3. mutant (ITPKB-Δ2-Mut3) var fortsatt hemmet av MIR-375 (figur 3A). Til sammen resultatene viste at MIR-375 målrettet 3’UTR av
ITPKB
mRNA primært gjennom målområde 2 (seed: 2463-2469).
A, Luciferase aktivitet. luciferase-aktivitet av hver prøve ble normalisert ved Renilla luciferase-aktivitet. Den normaliserte luciferase aktivitet for PS-negative ble angitt som relative luciferase aktivitet 1. Kolonne: middelverdi av 3 uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer. Feil bar: standardavvik. *: P 0,05, sammenlignet med celler transfektert med tom pGL3-promoter vektor. B, ble uttrykket nivåer av ITPKB protein av H82, H82-NC og H82-MIR-375 celler evaluert av western blot. Etter transfeksjon av MIR-375, ble ekspresjonsnivået av proteinet ITPKB undertrykte betydelig. C, kvantitativ analyse av Western blot. De ITPKB protein intensiteter ble normalisert ved GAPDH.
Effekten av MIR-375 på den endogene uttrykk for ITPKB ble videre undersøkt med Western blot. Ektopisk ekspresjon av MIR-375 i betydelig grad undertrykkes den ITPKB protein i MIR-375-transfiserte H82-celler (H82-MIR-375) i forhold til vektorstyre transfekterte celler (H82 H82-NC) (figur 3B og 3C). Dataene indikerte at MIR-375 hemmet uttrykk for ITPKB på posttranskripsjonelt nivå ved direkte rettet mot den 3’UTR (primært mot site2) av
ITPKB
mRNA.
I tillegg observerte vi ITPKB proteinekspresjon var signifikant nedregulert i lungekreft vev sammenlignet med tilstøtende normalt vev, som er i konsonanser med uttrykket mønster av
ITPKB
mRNA som er nevnt ovenfor (figur 4 og tabell 3).
Western blot ble anvendt for å detektere ekspresjon av ITPKB protein i lunge carcinoma vev (2AC prøver, 2SQ prøver, 3SCLC prøver) og tilstøtende normalt lungevev. De ITPKB protein intensiteter ble normalisert etter GAPDH.The kaste endringene var 0.2and0.3 i sammenligninger av 2AC vs normal, 0,2 og 0.4of 2SQ vs normal, 0,3, 0,3 og 0.4of 3SCLC vs normal, henholdsvis.
For andre 5 antatte målrettede gener (
RUNX1
,
LRP5
,
PIAS1
,
FZD8 Hotell og
ITGA10
), ble observert minimale effekter på MIR-375 i deres luciferasepreparater aktiviteter (S3 Fig). Videre ektopisk uttrykk nivåer av MIR-375 ble ikke signifikant undertrykt av de 5 mulige target proteiner i H82-MIR-375 sammenlignet med H82-NC (S4 figur).
Effekt av MIR-375 overekspresjon på SCLC cellevekst
Den betydelige oppregulering av MIR-375 uttrykk i SCLC prøver og dens hemmende effekt på
ITPKB
bedt oss om å undersøke dens mulige biologiske rolle i SCLC celler. Etter infisert, Mir-375 uttrykk for både H82-NC og H82-MIR-375 ble oppdaget ved hjelp av real-time QRT-PCR (Fig 5A). Deretter vurderte vi cellevekst av CCK-8 analysen. Resultatene vist i figur 5B foreslått at ekspresjon av eksogene MIR-375 kan fremme cellevekst fra H82-celler i en tidsavhengighet måte. Etter 24 timers inkubasjon, ble observert noen forskjell i celle levedyktighet mellom de to gruppene (p 0,05) .Men ble observert signifikant forskjell mellom de to gruppene etter 48t og 72h inkubasjon og fremme effektiviteten var henholdsvis 33,1% og 35,9%, ( p. 0,01)
A, ble Mir-375 uttrykk for både H82-NC og H82-MIR-375.NCI-H82 celler infisert med MIR-375-uttrykke (H82-MIR-375) eller tom (H82-NC) lentivirus før den proliferasjonsanalyse. B, kan MIR-375 fremme cellevekst av H82 celler. De infiserte celler ble sådd i en 96-brønners plater. Etter inkubering i flere dager ble cellevekst målt ved hjelp av CCK-8-analyse. *: P 0,01, sammenlignet med H82-NC.
Diskusjoner
MiR-375 ble først identifisert som en bukspyttkjertelen holme spesifikke miRNA regulerer insulinsekresjon [14-16]. Imidlertid videre studier viste at MIR-375 er en multifunksjonell miRNA som deltar i pankreatisk øy utvikling, glukose-homeostase, slimhinneimmunitet, lungeoverflateaktivt middel sekresjon og enda viktigere, tumorigenesis. Deregulering av MIR-375 har blitt observert i forskjellige typer kreft. For eksempel, Kong et al rapporterte at Mir-375 uttrykk ble sterkt nedregulert i spiserørs plateepitelkarsinom (ESCC), og MIR-375 hemmet tumorvekst og metastasering gjennom undertrykke insulin-like growth factor 1 reseptor (IGF1R) [17]. En annen studie overbevist om at Mir-375 ble ofte nedregulert i ESCC cellelinjer og vev, og MIR-375 var signifikant assosiert med avansert stadium, metastaser og dårlig utfall av ESCC [18]. Leidner et al fant at MIR-375 var assosiert med progresjon til invasivt karsinom i Barretts øsofagus [19] .Chang et al viste at nedregulering av MIR-375 i glioma var korrelert med ugunstige kliniske utfall [20]. Lav uttrykk for MIR-375 ble funnet i tykktarmskreft [21, 22], og også korrelert med dårligere prognose og metastase i hode og nakke plateepitelkarsinom [23, 24]. Han et al fant at MIR-375, nedregulert i leverkreft (HCC) vev og cellelinjer, mål AEG-en i HCC og undertrykker kreftcellevekst
in vitro Hotell og
in vivo product: [ ,,,0],25]. I lungekreft, redusert Mir-375 uttrykk nivå hos NSCLC vevsprøver signifikant korrelert med avansert stadium og lymfatiske metastase [26] .Reduced uttrykk for MIR-375 ble observert i alle krefttyper som er nevnt ovenfor, mens MIR-375 oppregulering ble lagt merke til i bryst kreft og prostata-karsinom [27, 28]. Disse funnene understreker en fundamental rolle MIR-375 i tumorigenesis. Resultatene var i overensstemmelse med tidligere funn. Vi oppdaget og validert betydelig MIR-375 oppregulering i AC og SCLC men signifikant nedregulering i SQ.
Dagens to rapporter om Mir-375 uttrykk i SCLC var i samsvar med resultatene våre [12, 13] . Sammenlignet med dem, er vår studie unike av følgende grunner: For det første, Zhao et al undersøkte miRNA ekspresjonsmønstre bare i cellelinjer (fire SCLC-cellelinjer (H209, H69, H82 og H345), en NSCLC cellelinje CRL 5908, og ett immortalisert human lunge epitelcellelinje Beas-2B), fant de at MIR-375 ble konsistent oppregulert i alle fire SCLC-cellelinjer. Den andre også konkluderte med dyrkede celler, og brukte små prøver av vev (7 NSCLC vs. 8SCLC) for verifisering uten normal kontroll. Vår studie ikke bare tatt cellelinjer, men også en mer omfattende skanning av kliniske prøver, slik at vi kan bedre identifisere potensielle diagnostiske miRNA markører. Understreker at miRNA uttrykket profiler i subtyping SCLC og NSCLC er på grunn av vanskelighetene med å skaffe primær vevsprøver, som de fleste SCLC svulster ikke er kirurgisk reseksjon. For det andre, oppdaget vi miRNA biomarkører på LCM valgt kreftceller og tilstøtende normale celler avledet fra AC, SQ og SCLC. Denne tilnærmingen sikrer renheten av målceller, noe som reduserer bakgrunnssignaler fra ikke-kreft-celler og forbedre påliteligheten av de påviste biomarkør kandidatene [29] .Og interessant, observerte vi at overekspresjon av MIR-375 kan drastisk fremme cellevekst i SCLC-cellelinjen NCI-H82.
mirnas er negative ettertranskripsjonsregulerende elementer av genuttrykk. Enkelt miRNA kan regulere flere mRNA og er muligens bedre narkotika mål. For bedre å forstå den molekylære mekanismen av MIR-375 i 3 undergrupper av lungekreft, vi videre spådde målgener av MIR-375 og filtrert de antatte målet gener gjennom KEGG veier. Vi observerte that22 målgener er de sentrale medlemmene av etablerte signalveier i lungekreft inkludert kalsium, insulin, Jak-STAT, MAPK, mTOR, PPAR, TGF-beta og Wnt veier. Blant disse genene, fant vi at 6 målgener (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKB
,
LRP5
,
PIAS1
og
RUNX1
) hadde sterk negativ korrelasjon med Mir-375 uttrykk nivå i sammenligningen av SCLC vs. normalt vev. Sammenhengen mellom lungekreft og 4 mål gener (
FZD8
,
LRP5
,
PIAS1 Hotell og
RUNX1
) har tidligere blitt rapportert [30-33 ] .Det har blitt rapportert at
FZD8
er sterkt uttrykt i A549-cellelinjen og feilregulering av
FZD8
kan spille viktige roller i menneskelige kreft gjennom aktivering av beta-catenin-TCF vei [30 ]. Lee et al viser en signifikant ned-uttrykk for
LRP5
genet i 6 av 17 lunge plateepitel karsinom prøver [31]. I H1299 cellelinjen,
PIAS1
hemmet STAT1-mediert genaktivering og den DNA-bindende aktivitet [32]. I NSCLC pasienter,
RUNX
ble oftere metylert i tumorvev enn i noncancerous vev [33] .Men funksjonene til
ITGA10 Hotell og
ITPKB
i lungekreft er fortsatt ukjent. I vår studie,
ITPKB
mRNA og protein uttrykk var signifikant nedregulert i lungekreft vev. Den luciferase assay viste at
ITPKB
er direkte mål genet av MIR-375. Den over-uttrykk for MIR-375 førte til betydelig redusert ITPKB protein nivå. Resultatene bekreftet at MIR-375 negativt regulert
ITPKB
oversettelsen nivå. For
ITGA10
genet, vi ikke observere noen effekter på MIR-375 i luciferase aktivitet og undertrykkelse av ITGA10 protein uttrykk ved MIR-375.
Nylig, MIR-375 har vært funnet å undertrykke kjerne kjennetegnene til kreft ved å målrette flere viktige gener som
AEG-en
,
YAP1
,
IGF1R Hotell og
PDK1 product: [16]. Målgenene regulert av MIR-375 kan fungere spatiotemporally eller i samarbeid med hverandre i ulike cellulære prosesser. Vår identifisering av ITPKB genet som et direkte mål for MIR-375 gir ny innsikt i mekanismene bak tumorigenesis. ITPKB, et medlem av [Ins
P
3] 3-kinaser familie ble kartlagt til telomeric slutten av menneskelig kromosom 1 og forbundet med kalsium signalveien. Det har blitt identifisert som en kandidat-gen i patogenesen av immunlidelser, multippel sklerose, Alzheimers sykdom og ondartet melanom [34, 35].
