Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) har vært innblandet i kreft initiering og progresjon via deres evne til å påvirke uttrykk av gener og proteiner som regulerer cellevekst og /eller celledød. Transkripsjon av de tre miRNA MIR-34 familiemedlemmer ble nylig funnet å være direkte regulert av p53. Blant de target proteiner regulert av MIR-34 er Notch pathway proteiner og BCL-2, noe som tyder på muligheten for en rolle for MIR-34 i vedlikehold og overlevelse av kreft stamceller.
metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte rollene til Mir-34 i p53-mutant menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer MiaPaCa2 og BxPC3, og potensialet link til kreft i bukspyttkjertelen stamceller. Restaurering av MIR-34 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler ved enten transfeksjon av MIR-34 etterligner eller infeksjon med lentiviral MIR-34-MIF downregulated Bcl-2 og Notch1 /2. MIR-34 restaurering betydelig hemmet klonogene cellevekst og invasjon, apoptose og G1 og G2 /M arrest i cellesyklus, og lysfølsomt cellene til cellegift og stråling. Vi identifiserte at CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 celler er beriket med tumorsphere dannende og tumor initiere celler eller kreft stilk /stamceller med høye nivåer av Notch /Bcl-2 og tap av MIR-34. Mer vesentlig, MIR-34 restaurering førte til en 87% reduksjon av tumor-initiere cellepopulasjon, ledsaget av en betydelig inhibering av vekst tumorsphere
in vitro
og tumordannelse
in vivo
.
Konklusjoner /Betydningen
Våre resultater viser at MIR-34 kan gjenopprette, i det minste delvis, tumor undertrykker funksjonen av p53 i p53-manglende humane kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre data understøtter det syn at MIR-34 kan være involvert i kreft i bukspyttkjertelen stamcelleselvfornyelse, eventuelt via den direkte modulering av nedstrøms mål Bcl-2 og Notch, noe som tyder på at MIR-34 kan spille en viktig rolle i bukspyttkjertelkreft stamcelle selvfornyelse og /eller celle skjebne besluttsomhet. Restaurering av MIR-34 kan holde betydelig løftet som en roman molekylær terapi for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen med tap av p53-miR34, potensielt via hemme kreft i bukspyttkjertelen stamceller
Citation. Ji Q, Hao X, Zhang M, Tang W, Yang M, Li L, et al. (2009) mikroRNA MIR-34 hemmer menneskelig kreft i bukspyttkjertelen Tumor-Initiere Cells. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10,1371 /journal.pone.0006816
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 22. januar 2009: Godkjent: 05.08.2009; Publisert: 28 august 2009
Copyright: © 2009 Ji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av NIH tilskudd CA121830-01, CA128220-01 og CA134655-01A1 (L. Xu.), og ved NIH gjennom University of Michigans Cancer Center Support Grant (P30 CA46592). JTD er en University of Michigan Undergraduate Research Opportunity Program (UROP) student. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, i datainnsamling, analyse og tolkning, og beslutningen om å publisere, vurdering, godkjenning, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
microRNAs (mirnas) er en fredet klasse av ikke-koding 20-22 nt små RNA som regulerer gen og protein uttrykk ved å binde seg til mRNA fører til mRNA degradering eller inhibering av translasjon [1], [2]. mirnas sannsynlig regulere ulike biologiske prosesser, herunder vev differensiering og vedlikehold, og har medvirkende roller i ulike sykdomsprosesser, blant annet kreft [2], [3], [4]. Emerging bevis tyder på at mirnas også spille en viktig rolle i stamcelleselvfornyelse og differensiering av negativt regulerer uttrykket av visse viktige gener involvert i selvfornyelse og overlevelse, såkalte «stamcelle gener» [1], [2] , [4], [5]. Nylig ble de tre medlemmer av MIR-34 familien funnet å være direkte regulert av p53 og den funksjonelle aktiviteten til mir-34 indikerte en mulig rolle som en tumor suppressor [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Vi har tidligere rapportert at Bcl-2-protein reguleres direkte av MIR-34 [10]. Rapporten fra He et al. indikerte at ektopisk ekspresjon av MIR-34 induserer cellesyklusarrest i både primære og tumor-avledede cellelinjer, som er i samsvar med muligheten av MIR-34 for å nedregulere et program av gener som fremmer cellesyklusprogresjon [11]. Vi har nylig vist at ekspresjon av MIR-34s blir dramatisk redusert i p53-mutert magekreftceller, og at gjenopprettelse av MIR-34 ekspresjon hemmet kreftcellevekst [6]. Tap av MIR-34 har blitt knyttet til chemoresistance av kreft [13]. MIR-34a er blitt rapportert å være involvert i p53-mediert apoptose i tykktarmskreft og kreft i bukspyttkjertelen [8], [9]. Chang et al. rapportert at 15 bukspyttkjertelkreft cellelinjer har minst to ganger reduksjon i MIR-34a uttrykk i forhold til uttrykk i normale bukspyttkjertelen duktale epitel cellelinjer [8]. Til sammen publiserte studier tyder på MIR-34 familiemedlemmer kan ha tumor suppressor funksjon nedstrøms p53. I tillegg, fordi mer enn 50% av primære humane cancere har mutasjoner som inaktiverer p53-funksjon, funnene gitt støtet til å utforske den funksjonelle restaurering av MIR-34 som en ny tilnærming for å hemme kreftformer med p53 tap-av-funksjon.
en annen potensiell rolle for MIR-34 i kreft initiering og progresjon kan være en link til tumor initiere celler eller kreft stamceller (CSC). Det har blitt rapportert at MIR-34 mål Notch, c-Met og Bcl-2, gener som er involvert i selvfornyelse og overlevelse av kreft stamceller [10], [11], [14]. I dag, sammenhengen mellom p53, nedstrøms target MIR-34 og presumptive bukspyttkjertelkreft stamceller er ukjent. I denne studien har vi undersøkt effekten av funksjonelle restaurering av MIR-34 ved Mir-34 ligner og lentiviral MIR-34a på humane p53-mutant bukspyttkjertelkreft MiaPaCa2 celler, samt potensialet link til kreft i bukspyttkjertelen stamcelleselv -fornyelse. Opptegning rollen MIR-34 i regulering av cellevekst og tumorprogresjon, og dens potensial link til tumor initiere celler eller kreft stamceller kan gi grunnlag for å utforske sitt potensial som en roman behandlingsstrategi.
Materialer og Methods
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og reagenser
menneskelige bukspyttkjertelcancercellelinjer og den normale humane lunge fibroblastcellelinje WI-38 ble innkjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket i DMEM (HyClone, Logan, UT), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Logan, UT). mi
RIDIAN
miRNA miR34a, b, c ligner og negativ kontroll miRNA etterligne (NC ligne), mi
RIDIAN
MIR-34-hemmere og negative kontroller ble hentet fra Dharmacon (Chicago, Illinois) [ ,,,0],6]. Bcl-2 3’UTR luciferase reporter plasmid eller dets mutant har blitt rapportert tidligere [10]. QRT-PCR primere og antistoffer for Western blot er beskrevet i vår siste utgivelse [6].
Transfeksjon av MIR-34 ligner
MiaPaCa2 celler ble transfektert 24 timer etter at de er seedet i 6-brønn plater. miRNA etterligner (100 pmol) i 200 ul serumfritt, antibiotika-fritt, medium ble blandet med 5 ul Lipofektamin 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) oppløst i 200 ul av det samme medium og tillatt å stå ved værelses temperatur i 20 minutter. De resulterende 400 ul transfeksjon løsninger ble deretter tilsatt til hver brønn inneholdende 1,6 ml medium. Seks timer senere ble kulturene erstattet med 2 ml friskt medium supplert med 10% FBS og antibiotika. For Western blot ble cellene samlet etter ytterligere 48 timer.
Lentiviral MIR-34a infeksjon
feline immunsviktvirus (FIV) lentiviral systemet uttrykker Mir-34a (MIR-34a-MIF) eller vektor kontroll (MIF), samt en lentiviral pakkesystem, ble kjøpt fra system biovitenskap (SBI, Mountain View, California). MiaPaCa2 og BxPC3-celler ble infisert med FIV lentiviral system som uttrykker MIR-34a (MIR-34a-MIF) eller vektorkontroll (MIF), og de infiserte celler ble selektert via antibiotika resistens (Zeocin 50 ug /ml, Invitrogen), som vi nylig beskrevet [6].
MIR-34 BCL-2-3’UTR reporter analysen
MiaPaCa2 celler ble transfektert i 6-brønners plater med to mikrogram av BCL-2 3’UTR luciferase reporter plasmid eller dets mutant [6], [10], og 2 mikrogram av den styre β-galaktosidase plasmid, per brønn, ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler var også co-transfektert med 100 pmol av hver MIR-34 etterligne eller NC etterligne, som indikert ved hjelp Lipofectamine 2000. luciferase analysene ble utført 24 timer etter transfeksjon hjelp Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega). Luciferase-aktivitet ble normalisert i forhold til p-galaktosidase-aktivitet som registreres av β-galaktosidase Assay System (Promega). I hvert fall viser mutant BCL-2 3’UTR innføring av endringer i frø komplementære områder av BCL-2 3’UTR [10].
Colony dannelse og klonogene analysen
Til kolonidannelse assay-celler ble transfektert med MIR-34 etterligner eller NC ligne i 24 timer, og deretter utsådd på en 6-brønners plate i tre eksemplarer. 0,2 ml FBS ble tilsatt per brønn på dag 5. Etter 9-10 dager inkubasjon plater ble forsiktig vasket med PBS og farget med 0,1% av krystallfiolett. Kolonier med over 50 celler ble manuelt telles. Plating effektivitet ble beregnet ved å dividere antall kolonier dannet i den behandlede gruppe med den i kontrollen. For klonogene overlevelsesanalyse, ble celler transfektert med MIR-34 etterligner eller NC ligne i 24 timer, og deretter sådd i 6-brønns plater i triplikat ved den ønskede celletetthet (200~10,000 celler /brønn) fulgt av røntgenstråling . Celleoverlevelseskurver ble plottet ved anvendelse av en lineær-kvadratisk modell og strålingen enhancement ratio (ER) ble beregnet som vi tidligere beskrevet [15], [16], [17].
Kvantitativ sanntids-RT- PCR (QRT-PCR)
QRT-PCR ble utført for å bestemme uttrykket nivåer av potensielle Mir-34 målgener [6]. Tjuefire timer etter MIR-34 ligne transfeksjon av MiaPaCa2 celler med MIR-34 etterligner (100 pmol per brønn i 6-brønners plater), uttrykk for potensielle målgener ble målt ved QRT-PCR med SYBR Grønn PCR System (TaqMan) . I korthet, ble total RNA ekstrahert fra de transfekterte celler ved hjelp TRIZOL (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved anvendelse av en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). For QRT-PCR, ble en ul av genet primere med SYBR Grønn (Applied Biosystems) i 20 pl reaksjonsvolum brukt. Primere ble utformet som: BCL-2, videresende, 5′-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 «, revers, 5′-GAA CCG GCA CCT GCA CAC-3′; HMGA2, fremover, 5»-TTT GTA ATC CCT TCA CAG TCC-3 «, revers, 5′-TTT CTC ACC CGC CCA C-3′; Notch1, fremover, 5»-ATC CAG AGG CAA ACG GAG-3 «, revers, 5′-CAC ATG GCA ACA TCT AAC CC-3′; Notch2, fremover, 5»-GGA CCC TGT CAT ACC CTC TT-3 «, revers, 5′-CAT GCT TAC GCT TTC GTT TT-3′; Notch3, fremover, 5»-TGA TCG GCT CGG TAG TAA TG-3 «, revers, 5′-CAA CGC TCC CAG GTA GTC A-3′; Notch4, fremover, 5»-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 «, revers, 5′-CGG GAT CGG AAT GTT GG-3′; β-aktin, fremover, 5»-ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC-3 «, revers, 5′-TCA TAG TCC GCC TAG AAG CA-3». Alle reaksjoner med TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ble utført på Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf, Westbury, NY). Målgen mRNA-nivåer ble normalisert til aktin mRNA i henhold til følgende formel: [2- (C
T
target – C
T
Actin)] x 100%, hvor C
T er den terskelsyklusen. Den relative ekspresjon ble beregnet ved å dele den normaliserte mål-gen ekspresjon av den behandlede prøve med den for den ubehandlede kontroll, med verdien fra NC ligne angitt som en vilkårlig enhet. For målgener uttrykk i de sorterte celler, data ble normalisert til at av Actin (satt Actin = 1000 vilkårlig enhet).
Caspase-3-aktivering analysen
caspaseaktivering i de transfekterte MiaPaCa2 celler ble bestemt etter instruksjoner fra en Caspase-3-aktivering analysesett (BioVision, Mountain View, California). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene lysert, og hele cellelysater (20 ug) ble inkubert med 25 pM fluorogent substrat DEVD-AFC i en reaksjonsbuffer (inneholdende 5 mM DTT) ved 37 ° C i 2 timer. Proteolytisk utgivelsen av AFC ble overvåket ved λex = 405 nm og λem = 500 nm ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (BMG LABTECH, Durham, NC). Relativ caspase-3-aktivering ble beregnet ved å normalisere fluorescens signalet i hver behandlet prøve med at av NC etterligne eller MIF kontroll angitt som 100 vilkårlig enhet [16].
Cell Cvtotoksisitetsmålinq
MiaPaCa2 celler ble transfektert med MIR-34 etterligne eller NC ligne i 24 timer, sådd ut i 96-brønners plater (5.000 celler /brønn), og ble behandlet med serielt fortynnede kjemoterapeutiske midler, i triplikater. Etter 96 timers inkubering, ble 20 ul /brønn CCK-8-reagens tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 1-3 timer. Optisk tetthet ble målt ved 450 nm og 650 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (BMG LABTECH, Durham, NC). IC
50, ble den medikamentkonsentrasjon som inhiberer 50% cellevekst beregnet ved GraphPad Prism 5,0 (San Diego, CA), som vi tidligere beskrevet [18].
cellesyklus og apoptose analyse
For cellesyklus og apoptose analyse ved flowcytometri, ble MiaPaCa2-celler transfektert med MIR-34 etterligner eller NC etterligne i 6-brønns plater, trypsinert 24 timer senere og vasket med fosfat-bufret saltvann, og fiksert i 70% etanol på is . Etter sentrifugering ble cellene farget med 50 ug /ml propidiumjodid og 0,1 pg /ml RNase A, og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACStar Plus ™. Hvert histogram ble konstruert med data fra minst 5000 arrangementer. Data ble analysert for å beregne prosentdelen av cellepopulasjonen i hver fase ved hjelp av Cellquest-programvare, så vel som% av cellene i sub-G1 (Becton Dickinson) [18].
CD44 og CD133 farging og cellesortering
MiaPaCa2 celler ble inkubert med PE-konjugert anti-humant CD133 /1-antistoff og APC-konjugert anti-humant CD44-antistoff (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, USA) i PBS inneholdende 2% FBS. Isotype-matchet mus immunoglobulin tjente som kontroller. For flowcytometri, prøver ble analysert ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer og Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For celle sortering av flowcytometri, ble prøvene analysert og sortert på en BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Porsjoner av CD133
+ og CD133
– sorterte cellene ble vurdert for renhet med en FACSCalibur maskin og Cellquest programvare (BD Biosciences), ved bruk av PE-konjugert anti-human CD133 /2 antistoff (Miltenyi Biotec) [19].
Tumorsphere dyrknings
De sorterte MiaPaCa2 cellene ble suspendert i serumfritt kulturmedium DMEM inneholdende 1% N2 supplement, 2% B27 supplement, 1% antibiotikum-antimykotisk (Invitrogen), 20 ng /ml human FGF-2 (Sigma), og 100 ng /ml EGF (Invitrogen), og sådd ut i 24-brønners ultralave festeplater (Corning) 2.000 celler pr brønn. 7-10 dager senere, platene ble analysert for tumorsphere dannelse og ble kvantifisert ved bruk av et invertert mikroskop (Olympus) ved 100X, 200X, og 400 x forstørrelse. For påfølgende kvantifisering av celle tall per tumorsphere, ble tumorspheres samlet inn med et 40 um sikt (BD Biosciences, San Jose, California) og disassociated med trypsin for å lage en enkelt celle suspensjon. De levedyktige celler ble så telt ved bruk av trypanblått-eksklusjon.
dyremodellen og in vivo tumordannelse studie
fem til seks uker gamle hunn atymiske NCR-nu /nu nakne mus ble innkjøpt fra NCI. MiaPaCa2 celler ble transfektert med MIR-34a etterligne eller NC ligne i 24 timer. Celler ble samlet opp og inokulert i nakne mus subkutant (s.c.) på begge flanker, etter alkohol fremstillingen av huden, ved hjelp av en steril 22-gauge nål med 0,2 ml cellesuspensjon av 1 x 10
6-celler, med manuell tilbakeholdenhet. Tumorstørrelsene ble målt ved hjelp av en skyvelære. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen: (lengde x bredde
2) /2. På dag 38 ble alle tumorer samlet opp for å måle tumorvekter. Alle dyreforsøk ble gjort i henhold til protokollen er godkjent av University of Michigan Retningslinjer for bruk og stell av dyr.
Statistisk analyse
To-veis ANOVA og tosidige
t
-UNDERSØKELSER var ansatt for å analysere
in vitro Hotell og
in vivo
data ved hjelp av Prism 5.0-programvaren (GraphPad, San Diego, California).
P
. 0,05 ble definert som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk av MIR-34s i menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
Vi undersøkte en rekke av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, MiaPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-en, og den normale menneskelige lunge fibroblast cellelinje WI-38, for MIR-34a, b, c uttrykk. Vi har også vurdert parallelt ekspresjon av presumptive MIR-34-regulerte målgener og proteiner, ved å bruke primerne og metoder som vi nylig beskrevet [6]. MiaPaCa2 og BxPC3 celler har svært lave nivåer av både primær- og modne MIR-34a, b, c, men høye nivåer av Mir-34 målgener
BCL2 Kjøpe og
Notch1
, og ulike nivåer av
Notch2-4 plakater (figur 1). De har også lave nivåer av p21 (figur 1
C
), en annen mRNA mål av p53, i samsvar med den cellelinjen er p53-mutant status. Basert på disse data og vår observasjon at de er svært tumorigent og reproduserbart danne tumorspheres
in vitro
, valgte de to cellelinjene for denne studien.
A
, Western blot-analyse.
B
, QRT-PCR analyse av relative uttrykk nivåer av Mir-34s.
C
, QRT-PCR analyse av uttrykket nivåer av MIR-34 målgener i humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer samt normale menneskelige fibroblast WI-38 celler. Cellene ble lysert for å ekstrahere total RNA for QRT-PCR, ble data normalisert til den av aktin og de relative nivåer er vist (Actin = 1000). Merk p21 er et mål gen av p53.
MIR-34 restaurering av transfeksjon av MiaPaCa2 celler med Mir-34 ligner
For å undersøke effektene av MIR-34 restaurering på kreft i bukspyttkjertelen celler, transfektert vi MiaPaCa2 celler med MIR-34 etterligner eller uspesifikke kontroll miRNA etterligne (NC ligne). Western blot-analyse (figur 2
A
) viste at transfeksjon av MIR-34 etterligner downregulated ekspresjon av målgener, Bcl-2, Notch1 og Notch2 på proteinnivået, men hadde ingen virkning på Bcl-xL og Mcl -1 uttrykk, noe som indikerer målet genet knock-down av MIR-34 ligner påvirker transkripsjoner husing MIR-34 målse. MIR-34a, MIR-34b og MIR-34C ligner alle hadde lignende aktiviteter. Figur 2
B
viser QRT-PCR analyse av potensielle mål gener; MIR-34 ligner potent hemmet
BCL2 Hotell og
Notch1
genekspresjon, i samsvar med Western blot data. De har også hemmet uttrykk for p21 (figur 2
B
), et annet mål av p53, men har begrenset effekt på Notch3 og cMET. Interessant, Notch2 uttrykket inhibering på proteinnivået ved MIR-34 ble ikke fulgt av inhibering på mRNA-nivået, i overensstemmelse med tidligere rapporter om at miRNA inhiberer target-genekspresjon post-transkripsjonelt, med eller uten mRNA degradering [11], [20 ].
En
, MIR-34 restaurering nedregulerer target proteiner BCL-2, Notch1 og Notch2, ingen påvirkning på Mcl-en. MiaPaCa2-celler ble transfektert med MIR-34 etterligner eller ikke-spesifikt kontroll miRNA etterligner (NC mimic) (100 pmol per brønn i 6-brønns plater med Lipofectamine 2000) i 48 timer, deretter samlet opp for Western blot-analyse.
B
, kvantitativ real-time PCR-analyse av de mulige målgener «mRNA nivåer etter MIR-34 ligne transfeksjon i MiaPaCa2 celler. **
P
0,01, ***
P
0,001, Student
t
-test, n = 2.
C
, BCL-2 3’UTR luciferaserapportørplasmid analysen viser at de transfekterte MIR-34 etterligner er funksjonelle. MiaPaCa2 celler ble ko-transfektert med BCL-2 3’UTR luciferaserapportørplasmid eller sin mutant, b-gal vektor, sammen med enten MIR-34 etterligner eller NC ligne. Luciferase assay ble utført 24 timer etter transfeksjon hjelp Bright-Glo Luciferase Assay System. Luciferase-aktivitet ble normalisert i forhold til b-gal-aktivitet. Feil linjen viser standardavvik
For å vurdere om de transfekterte MIR-34 etterligner er funksjonelle, gjennomførte vi den BCL-2 3’UTR reporter analysen som vi nylig beskrevet [6], [10]. De transfekterte MIR-34 etterligner inhiberte luciferase reporter-gen ekspresjon, som er kontrollert av Bcl-2 3’UTR i promoter-regionen (figur 2
C
). Imidlertid mutasjon i Bcl-2 3’UTR komplementært til mir-34 frø sekvens opphevet denne effekten, noe som indikerer at den observerte aktiviteten er sekvens-spesifikk. Resultatene viser at de transfekterte Mir-34s er funksjonelle og bekrefter at BCL-2 er en direkte mål av MIR-34, i samsvar med tidligere rapporter [8], [10], [21].
For å evaluere de langsiktige effektene av MIR-34 restaurering, vi også ansatt en lentiviral system for å uttrykke MIR-34a. Den feline immunodeficiency virus lentiviral systemet uttrykker Mir-34a (MIR-34a-MIF), eller vektor kontroll (MIF), ble brukt til å infisere MiaPaCa2 og BxPC3 celler og den infiserte cellepopulasjon ble valgt via Zeocin motstand [6]. Figur S1 viser karakterisering av uttrykk endringer i MIR-34a-MIF celler. Western blot analyse viste at Bcl-2-protein ble nedregulert i MIR-34a-MIF-celler sammenlignet med de MIF-vektorkontrollcellene (fig S1
A
), i samsvar med QRT-PCR-analyse av Bcl- 2 mRNA nivå (Figur S1
B
). BCL-2 3’UTR luciferaserapportørplasmid analysen viste at MIR-34a er funksjonell i Mir-34a-MIF celler (Figur S1
C
).
MIR-34 restaurering hemmer MiaPaCa2 celle klonogene vekst og fører til caspase-3-aktivering og apoptose
Etter å validere at de transfekterte MIR-34 etterligner var funksjonelle, gjennomførte vi en klonogene analyse for å undersøke effekten av MIR-34 restaurering på cellevekst. Som vist i figur 3
A-B
, MIR-34 restaurering vesentlig hemmet klonogene cellevekst, med MIR-34a ligne induserende 80% inhibering av kolonidannelse i forhold til NC etterligner (18,3 ± 3,8 kolonier /vel vs 95,3 ± 1,8% kolonier /brønn). Lignende resultater ble observert i MIR-34a-MIF-celler som vokste langsommere enn MIF-kontrollcellene, som indikert av både den betydelig redusert antall trypanblått-ekskluderende levedyktige celler i cellevekstanalyse (figur S1
D
) og den reduserte kolonidannelse (Figur S1
E
). Vi undersøkte også effekten av hemming av endogen MIR-34 på cellevekst av mi
RIDIAN
MIR-34-hemmere. De er enkelttrådet kjemisk forbedret oligonukleotider som effektivt kan hemme den endogene modne MIR-34. MIR-34-hemmere indusert en nesten 20% økning i klonogene vekst sammenlignet med kontroll (120,3 ± 2,9 kolonier /godt vs. 95.3 ± 1.8 kolonier /brønn) (figur 3
A-B
). Vi har også gjennomført en celle invasjon analysen i MiaPaCa2 celler med MIR-34 restaurering av både MIR-34a ligne og MIR-34a-MIF. MIR-34 vesentlig hemmet invasjon potensialet MiaPaCa2 celler (Figur S2). Våre resultater viser at MIR-34 er involvert i MiaPaCa2 cellevekst; MIR-34 restaurering hemmer klonogene vekst, og hemming av endogen MIR-34 ved MIR-34-hemmere fremmer vekst. Våre data er i overensstemmelse med den rapporterte tumor suppressor funksjon av MIR-34 [6], [8], [9], [11], [22].
MiaPaCa2-celler ble transfektert med MIR-34 etterligner eller -inhibitorer, 24 timer senere ble cellene sådd ut i 6-brønns plater (200 celler /brønn, i tre paralleller). Etter 12-14 dager inkubasjon, ble platene forsiktig vasket med PBS og farget med 0,1% krystallfiolett.
En
, representative bilder av koloniene.
B
, Colonies med over 50 celler ble talt opp.
C
, Restaurering av MIR-34 fører til caspase-3-aktivering. Caspase-3-aktivering analysen ble utført som beskrevet i i
Materialer og metoder
. Gangers økning av fluorescens-signalet ble beregnet ved å dele den normaliserte signal i hver behandlet prøve med den i den ubehandlede kontroll. **
P
0,01, ***
P
0,001, Student
t
-test, n = 3.
D
, cellesyklus distribusjon av MiaPaCa2 celler transfektert med MIR-34 etterligner. Cellesyklus analyse ble utført en dag etter transfeksjon. Celler ble farget med propidiumjodid etter ethanol fiksering og analysert ved strømningscytometri.
Siden p53 tumor suppressor-funksjonen er mediert delvis via induksjon av apoptose [23], [24], undersøkte vi effekten av MIR-34 restaurering på apoptose-induksjon i MiaPaCa2 celler transfektert med MIR-34 etterligner. Som vist i figur 3
C
, forbigående transfeksjon av MIR-34 etterligner førte til en signifikant økt aktivering av kaspase-3, en nøkkel indikasjon av cellene som gjennomgår apoptose [25]. Vi evaluerte også effekten av MIR-34 etterligner på cellesyklusen. MIR-34 ligner resulterte i betydelig G1 og G2 /M arrest og en reduksjon av celler i S-fasen (Figur 3
D
), i samsvar med andre rapporter om Mir-34 restaurering i ulike kreft modeller [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Denne effekten på cellesyklus er lik den til p53 restaurering som vi tidligere har rapportert [23], [24], [27], [28], noe som indikerer at MIR-34 restaurering kan utøve effekter beslektet med restaurering av p53 tumor suppressor funksjon, i det minste delvis, i cellene med p53 tap av funksjon.
MIR-34 restaurering sensitizes MiaPaCa2 celler til kjemoterapi og strålebehandling
Neste, vi undersøkt om Mir-34 restaurering kan sensitize bukspyttkjertelcancerceller med et høyt nivå av endogen Bcl-2-ekspresjon til kjemo- og stråleterapi. De WST-1-basert cytotoksisitets-analysen ble anvendt som vi nylig beskrevet [6], [18] for å evaluere cellenes respons på tre kjemoterapeutiske midler, docetaxel, cisplatin og gemcitabin, som alle er i dag brukes for bukspyttkjertelcancerkjemoterapi. Som vist i figur 4
A
, MIR-34 restaurering i MiaPaCa2 celler gjengitt i cellene 2-3 ganger mer sensitive overfor kjemoterapeutiske midler, sammenlignet med de vektorkontrollcellene, basert på IC50-data. I apoptose analyser, MIR-34a restaurering betydelig økt gemcitabin eller stråleindusert caspase-3-aktivering (Figur 4
B
) og sub-G1-celler (Figur 4
C
). Vi har også gjennomført klonogene analysen, MIR-34a ligne sensibiliserte MiaPaCa2 celler til røntgenstråling, med en strålings enhancement ratio (ER) = 1,3 (Figur 4
D
). Våre data viser at MIR-34 restaurering kan overvinne kjemo- /radioresistance av kreft i bukspyttkjertelen celler som har høye nivåer av BCL-2 og lave basalnivåer av MIR-34s, og er avhengig av Bcl-2 for overlevelse og resistens overfor terapi.
En
, sensitizes MIR-34 restaurering cellene til kjemoterapeutika. Den MTT-baserte cytotoksisitet analysen ble utført ved hjelp av Zeocin-resistente stabile MiaPaCa2-MIR-34a-MIF og MiaPaCa2-MIF celler.
B
, øker MIR-34 restaurering caspase-3-aktivering indusert av gemcitabin eller røntgenstråling i MiaPaCa2 celler. Relativ kaspase-3 aktivering ble beregnet ved normalisering av den fluorescens-signalet i hver behandlet prøve med den til NC etterligne eller MIF kontroll som 100. *
P
0,05, ***
P
0,001, Student
t
-test, n = 3.
C
, øker MIR-34 restaurering stråling-indusert apoptose i MiaPaCa-2 celler. Cellene ble transfektert med MIR-34a etterligne eller NC ligne. 24 timer senere ble cellene underkastet røntgenstråling. Cellene ble samlet opp etter hverandre 48 timer, farget med propidiumjodid etter etanol fiksering, og analysert ved strømningscytometri for den% av cellene i sub-G1 fase. *
P
0,05, t-test, n = 2.
D
, MIR-34 restaurering radiosensitized MiaPaCa-2 celler. Den klonogene Analysen ble utført som beskrevet i
Materialer og metoder
Data er vist som gjennomsnitt +/- SD (n = 3).
CD44 + /CD133 + celler er tumorsphere dannende og tumor-initiering celler med høy Bcl-2 og tap av MIR-34 uttrykk
for å undersøke den potensielle effekten av MIR-34 restaurering på tumor initiere celler i MiaPaCa2 cellelinje, må vi først undersøkte tumor- initiere celle eller kreft stamcelle befolkningen i MiaPaCa2 celler med ulike celleoverflatemarkører. Både CD44 [29] og CD133 [19], [30] har blitt brukt som markører for å identifisere pancreatic cancer stamceller fra humane tumorvev. Imidlertid er det ingen rapport om kreft stamceller i MiaPaCa2 celler. Vi evaluerte CD44 og CD133 status i MiaPaCa2 celler ved immunfluorescens farging og FACS sortering. Om lag 60% cellene er CD44 + og 3-5% celler er CD133 + imidlertid bare 1-2% cellene er CD44 + /CD133 + dobbel-positive (Q2 i figur 5
A
). For å undersøke den selvfornyelse potensial av cellene med forskjellige markør flate profiler, foretok vi tumorsphere kultur av de sorterte celler i en spesiell ultra-low festedyrkingsplate med betinget medium for tumorsphere kultur [29]. Sju til ti dager senere, CD44 + /CD133 + dobbel-positive MiaPaCa2 cellene vokste typiske tumorspheres men ikke de CD44- /CD133- dobbel-negative celler, mens CD44 + /CD133- eller CD44- /CD133 + single-positive celler hadde færre og mindre kuler (Figur 5
B-C
). En representant tumorsphere fra CD44 + /CD133 + celler er vist i figur 5
B plakater (innsatsen). Vi har også foretatt en begrenset fortynning tumor-initiering assay i nakne mus ved hjelp av de sorterte celler, og dataene er sammenfattet i tabell 1. CD44- /CD133–celler ble ikke dannet tumor, mens 1 x 10
4 CD44 + /CD133 + -celler dannet svulst i 4 av 4 mus, en × 10
3 CD44 + /CD133 + celler dannet svulst i 2 av 4 mus, og ingen svulst dannet med 1 × 10
2 celler. Således våre data viser at CD44 + /CD133 + dobbel-positive MiaPaCa2 celler er anriket med tumor-initiering celler eller kreft stilk /stamceller som er i stand til selvfornyelse, men det CD44- /CD133- dobbelt-negative populasjonen inneholder ingen slike celler. Våre resultater tyder også på at CD44 /CD133 er egnede markører for tumor initiere celler i MiaPaCa2 cellelinje.
En
, CD44 og CD133 farging av MiaPaCa2 celler. MiaPaCa2 celler ble farget av anti-CD44-APC og anti-CD133-PE og sortert etter FACS. Rundt 1-2% celler er CD44 + /CD133 + dobbel-positive (Q2).
B-C
, Tumorsphere kultur av de sorterte celler. De sorterte cellene ble sådd for tumorsphere kultur som beskrevet i
Materialer og metoder
. 7-10 dager senere, tumorspheres ble talt (
B
). Innsatsen viser en representativ tumorsphere fra CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 celler.
C
.
