Abstract
Antracykliner (som doksorubicin eller daunorubicin) er blant de mest effektive kreft narkotika, men deres nytten er hemmet ved risikoen for irreversible kardiotoksisitet. Dexrazoxane (ICRF-187) er den eneste klinisk godkjent kardio middel mot antracyklinindusert kardiotoksisitet. Dens aktivitet har tradisjonelt blitt tilskrevet jern-chelaterende effekter av dets metabolitt med påfølgende beskyttelse mot oksidativt stress. Imidlertid er dexrazoksan også en katalytisk inhibitor av topoisomerase II (TOP2). Derfor undersøkte vi om deksrazoksan og to andre top2 katalytiske hemmere, nemlig sobuzoxane (MST-16) og merbarone, beskytte cardiomyocytes fra antracyklin giftighet og vurdert deres virkninger på antracyklin antineoplastisk effekt. Dexrazoxane og to andre top2 hemmere beskyttet isolerte neonatal rotte cardiomyocytes mot toksisitet indusert av både doxorubicin og daunorubicin. Imidlertid har ingen av de Top2 inhibitorer signifikant beskyttet kardiomyocytter i en modell av hydrogenperoksyd-indusert oksidativ skade. I kontrast, gjorde katalytiske hemmere ikke gå på akkord med antiproliferative virkningene av antracykliner i HL-60 leukemicellelinje; i stedet, synergis interaksjoner ble hovedsakelig observert. I tillegg antracyklinindusert caspaseaktivering ble forskjellig modulert av top2-hemmere i hjerte- og kreftceller. Mens deksrazoksan var ved hydrolyse stand til å betydelig chelatringer intracellulære labile jernioner, ble ingen slik effekt kjent for enten sobuzoxane eller merbarone. I konklusjonen, våre data tyder på at deksrazoksan kan beskytte cardiomyocytes
via
sin katalytiske TOP2 hemmende aktivitet i stedet for jern-chelation aktivitet. Differensial uttrykk og /eller regulering av top2 isoformer i hjerte- og kreftceller ved katalytiske hemmere kan være ansvarlig for selektiv modulering av antracyklin handling observert
Citation. Vavrova A, Jansova H, Mackova E, Machacek M, Haskova P, Tichotova L, et al. (2013) katalytiske hemmere av topoisomerase II annerledes modulerer Giftig Antracykliner i hjerte- og kreftceller. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10,1371 /journal.pone.0076676
Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, Faculty of Medicine Helsefag, De forente arabiske emirater
mottatt: May 23, 2013; Godkjent: 25 august 2013; Publisert: 07.10.2013
Copyright: © 2013 Vavrova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den tsjekkiske Science Foundation (prosjekt 13-15008S; www.gacr.cz), Karlsuniversitetet (prosjekt SVV 267 004, www.cuni.cz) og co-finansiert av European Social Fund og statsbudsjettet den tsjekkiske republikk (prosjekt nr CZ.1.07 /2.3.00 /30,0022,. www.msmt.cz). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
antracyklin (ANT) antibiotika, for eksempel doxorubicin (DOX, figur 1), daunorubicin (DAU, figur 1) eller epirubicin, rangerer blant de mest effektive og mest brukte antineoplastiske midler og forblir uunnværlig komponenter i moderne kjemoterapi protokoller for en rekke hematologiske kreftformer, så vel som faste tumorer. Men risikoen for irreversible og potensielt dødelig giftighet for hjertevevet er den største ulempen med ANT bruk i klinisk praksis [1].
Antracykliner doxorubicin (DOX) og daunorubicin (DAU) og topoisomerase II katalytisk hemmere deksrazoksan ( DEX), sobuzoxane (SOB) og merbarone (MER) ble brukt i denne studien.
Mange hypoteser er foreslått om mekanismene bak både antineoplastiske og kardiotoksiske effekter av maur [2]. Foreløpig er topoisomerase II (TOP2) generelt anerkjent som den viktigste molekylære mål for ANT antitumor handling. Maur tilhører gruppen av «giftstoffer» Top2, som består av cytotoksiske midler som stabiliserer «spaltbare kompleks» [3]. I form av kardiotoksisitet, jern (Fe) -catalysed intramyocardial produksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) har tradisjonelt vært innblandet. C-ringen av ANT aglykon undergår lett redoks-sykling, og Fe-ioner kan danne redoks-aktive komplekser med maur, noe som resulterer i dannelsen av superoksid, peroksyd og eventuelt svært reaktive og giftige hydroksylradikaler [4], [5].
Dette tradisjonelle «ROS og Fe» hypotesen om ANT-kardiotoksisitet har blitt forsterket av den beskyttende effektiviteten av deksrazoksan (DEX, ICRF-187, figur 1), som er den eneste klinisk godkjent hjertebeskyttende. De kardiobeskyttende virkninger av DEX har blitt tilskrevet dets hydrolyseprodukt ADR-925, påfallende lik den velkjente metallchelator EDTA. Etter metabolismen av DEX til ADR-925, kan dette produktet kelatere gratis og redoks-aktive intracellulære Fe og /eller erstatte Fe i ANT-Fe komplekser, og dermed hindre stedsspesifikke hydroksyl radikal dannelse og oksidativ skade på hjertevevet [6].
Men det er DEX også en etablert katalytisk inhibitor av TOP2 [7], og derfor kan det ikke utelukkes at DEX kan utøve beskyttende effekt gjennom interferens med ANT-indusert TOP2 forgiftning i hjertet [8], [9]. Faktisk en fersk undersøkelse rapporterte at sletting av TOP2 beta isoformen (
Top2b
genet) beskyttede cardiomyocytes fra DNA dobbelttrådbrudd og transkriptom endringer indusert av akutt in vivo DOX behandling, med påfølgende forebygging av defekt mitokondrie biogenesis og ROS formasjon. Videre kardiomyocytt spesifikke sletting av
Top2b
genet beskyttet mus fra utvikling av progressiv hjertesvikt indusert av gjentatt DOX behandling, noe som tyder på at DOX-kardiotoksisitet er i hovedsak mediert av kardiomyocytt TOP2B [10].
spørsmål som kommer fra disse tidligere studier oppfordret oss til å undersøke involvering av tOP2 i ANT kardio og å vurdere andre top2 katalytiske inhibitorer som potensielle cardioprotectants. I denne studien bruker primærkulturer av isolerte rotte neonatal ventrikkel cardiomyocytes (NVCMs), undersøkte vi den beskyttende effekten av DEX og to andre katalytiske hemmere av TOP2, sobuzoxane (SOB, MST-16, figur 1) og merbarone (MER, Figur 1 ), mot kardiotoksisitet indusert av DAU og DOX. Til sammenligning har vi også undersøkt effekten av disse midlene i en modell av H
2o
2-indusert oksidativ kardiomyocytt skade. I tillegg ble det HL-60 leukemicellelinje som brukes til å vurdere om top2 katalytiske hemmere kan påvirke ANT kardio uten å svekke deres antiproliferativ effekt mot leukemikreftceller.
Materialer og metoder
1. Materialer
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), DMEM med næringsblanding F-12 (DMEM /F12), hesteserum (HS), føtalt bovint serum (FBS), penicillin /streptomycin-løsning (5000 U /ml ; P /S) og natriumpyruvat-oppløsning (100 mM; Pyr) ble anskaffet fra Lonza (Belgia). Sera ble varme-inaktivert før bruk. DEX ble hentet fra Huaren Chemicals (Chang-Zhou, Kina). RPMI-1640 medium med L-glutamin og NaHCO
3, melkesyre, nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD
+), MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid bromide, SOB, MER, dimetylsulfoksid og 4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulphonic syre (HEPES) ble kjøpt fra Sigma (Tsjekkia) og andre kjemikalier (f.eks bestanddeler av forskjellige buffere) fra Penta (Tsjekkia) og var av den høyeste tilgjengelige farmasøytiske eller analytisk kvalitet. dimetylsulfoksid ble brukt til å oppløse DEX, SOB og MER. Plast for cellekultur ble hentet fra TPP (Sveits).
2. kardiomyocytt isolasjon og toksisitets vurderinger
Alle dyr prosedyrer og utarbeidelse av NVCMs ble godkjent og overvåket av Charles University Animal Care komiteen. Primære kulturer av NVCMs fremstilt fra 2 dager gamle Wistar rotter. dyrene ble bedøvet med CO
2, og halshugget. kistene ble åpnet og hjertene ble samlet i en iskald Ca
2 + -fri buffer, som inneholder 116 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO
4, 1,13 mM NaH
2PO
4, 5 mM glukose og 20 mM HEPES (pH 7,40). Ventriklene ble grundig hakket og i serie spaltet med en blanding av kollagenase (0,25 mg /ml; Invitrogen, USA) og pankreatin (0,4 mg /ml; Sigma) oppløsning ved 37 ° C. Cellesuspensjonen ble plassert på en stor (15 cm) petriskål (ca. 20 hjerter pr tallerken) og venstre i 2 timer ved 37 ° C for å separere myocytter (som flyter i mediet) fra fibroblaster (festet til fatet). Den myocyte rike suspensjonen ble oppsamlet og levedyktige celler ble tellet ved hjelp av Trypan blå eksklusjon. Isoleringsfremgangsmåten resulterte i et konfluent monolag med cellulær ~90% av kardiomyocytter slå synkront. For å vurdere cytotoksisitet, cellulær morfologi og kaspase-aktivitet, ble cellene sådd ut på 12-brønn plater forhåndsbelagt med 1% gelatin i en tetthet på 0,8 millioner celler per brønn. For å måle glutation innhold, ble cellene sådd ut på 60-mm petriskåler i en tetthet på 4,8 millioner celler per parabolen. NVCMs ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i DMEM /F12 supplert med 10% HS, 5% FBS, 4% PYR og 1% P /S. Nylig isolerte NVCMs ble etterlatt i 40 timer, deretter ble mediet forandret til DMEM /F12 supplert med 5% FBS, 4% PYR og 1% P /S. Mediet ble byttet en gang etter ytterligere 24 timer. Alle forsøkene ble startet på den fjerde dagen etter isolering. Ved hjelp av både serum og PYR fritt medium, ble NVCMs inkubert ved 37 ° C med de testede midler enten alene eller i kombinasjon. Aktiviteten av laktatdehydrogenase (LDH) frigjøres fra kardiomyocytter ble bestemt i cellekulturmedium som en standard markør for cytotoksisitet og cellulær nedbrytning ved hjelp av en vel-etablert spektrofotometrisk metode; i våre tidligere studier av denne metode, samsvarte godt med frigivelse av cardio-spesifikk troponiner T og I [11]. Aktiviteten av LDH frigjort fra kardiomyocytter ble uttrykt som prosentandel av total cellulær LDH som målt følgende cellelysering i 15 minutter (0,1 M kaliumfosfat, 1% Triton X-100, 1 mM DTT [(-) -1,4-ditio L-threitol], 2 mM EDTA, pH 7,8) ved romtemperatur. Alle prøvene ble frosset umiddelbart og holdt på -80 ° C før måling. Aktiviteten av LDH ble analysert i Tris-HCl-buffer (100 mM, pH 8,9) inneholdende 35 mM av melkesyre og 5 mM av NAD
+. Frekvensen av NAD
+ reduksjon ble overvåket spektrofotometrisk ved 340 nm i 2 min. Skråningen av lineære området og molar absorpsjon koeffisient e = 6.22 * 10
3 M /cm ble brukt for beregning av LDH aktivitet og dataene ble uttrykt som prosentandelen av totale LDH beløpet.
Endringer i cellulær morfologi ble dokumentert ved hjelp av en Eclipse TS100 invertert epifluorescence mikroskop (Nikon, Japan), og NIS-Elements AR 2,20 programvare (Laboratory Imaging, Tsjekkia). For å visualisere aktiv mitokondrier ble cellene ladet med 0,5 uM JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, USA) i 30 minutter ved 37 ° C. Ved lave konsentrasjoner eksisterer JC-1 løpet av celler i et grønt-fluorescerende monomere form og akkumuleres i aktivt pustende mitokondriene. Det JC-1-monomerer samles det drevet av eksisterende membranpotensialdifferansen (ΔΨ
m) mellom den indre og ytre mitokondriemembranen. Dette ΔΨ
m avhengig dannelsen av «J-aggregater» er representert ved et hjerneslag-skifte fra grønt til rødt fluorescens.
3. Spredningsstudier
HL-60 cellelinje, avledet fra en pasient med akutt promyelocytic leukemi [12], ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% P /S i 75-cm
2 vevskultur-kolber) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. For proliferasjonsanalyser, ble cellene sådd ut på 96-brønners plater i en tetthet på 10.000 celler per brønn. De kombinasjonsstudier ble utformet i henhold til Chou – Talalay metode [13]. I korthet ble konsentrasjonene av chelatorer som induserer 50% reduksjon proliferasjon (IC
50) av alle enkeltstoffer ble først bestemt. Deretter ble både de individuelle stoffer og kombinasjonsblandinger testet ved konsentrasjoner som tilsvarer flere fraksjoner og multipler. (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) av de enkelte IC
50-verdier
Cellulær proliferasjon ble undersøkt ved anvendelse av en levedyktighet assay basert på evnen av aktive mitokondrier å endre gul 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazolium-bromid tetrazol (MTT, Sigma) til fiolett formazan i henhold til produsentens instruksjoner korthet ble 25 pl av 3 mg /ml MTT-løsning i fosfatbufret saltvann ble tilsatt til kulturmediet (100 mL) og etter to timers inkubering i 37 ° C ble cellene lysert med lyseringsbuffer (isopropanol , 0,1 M HCl, 10% Triton X-100) i 30 minutter i romtemperatur. Etter oppløsning, ble den optiske tetthet av oppløselig MTT målt ved anvendelse av en Tecan Infinite 200 M plateavleser ved λ = 570 nm, å subtrahere λ = 690 nm bakgrunn. De spredning priser av de eksperimentelle gruppene ble uttrykt som prosenter av ubehandlede kontroller (100%).
4. Vurdering av caspase aktivitet
Aktivitetene caspases 3/7, 8 og 9 ble bestemt ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit (caspase Glo Analyser, Promega, USA) basert på evnen til caspases å spalte spesifikke aminosyresekvenser til stede i et substrat for luciferase. Kaspaser aktiviteter ble bestemt i forhold til proteininnhold, som ble vurdert ved hjelp av bicinchoninic syre fremgangsmåten i henhold til produsentens protokoll (Sigma). Lysates ble fortynnet til like proteinkonsentrasjoner.
5. Bestemmelse av total og oksidert glutation
NVCMs ble vasket med PBS (2 x 2,5 ml, 4 ° C), høstet med en celleskraper, og sentrifugert (10 minutter ved 700 x g, 4 ° C), og pelleten ble resuspendert i 250 pl av 4 ° C kaldt sulphosalicylic syre (Sigma), og deretter sonikert på is i 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Tyskland). Prøvene ble deretter sentrifugert i 15 minutter ved 18 000 x g og supernatantene ble anvendt for å bestemme mengden av redusert og oksidert glutation (GSH /GSSG) i henhold til Tietze [14] ved hjelp av den enzymatiske resirkuleringsmetoden med 5,5′-Dithio bis (2-nitrobenzosyre) (Sigma) og GSH-reduktase (Sigma) i en mikroplateformat. Hastigheten av 2-nitro-5-merkaptobenzosyre dannelse ble målt ved 405 nm i 2 min og skråningen ble sammenlignet med standardkurven for oksydert glutation (GSSG). Konsentrasjonen av total glutation (GSH GSSG +) ble beregnet ved hjelp av metoden til lineær regresjon ble resultatene korrigert for proteininnhold og uttrykt som en prosentandel av den totale glutation i en kontrollprøve (100%). GSSG-innholdet i prøven ble bestemt etter derivatisering av GSH med 2-vinylpyridin (Sigma). Resultatene ble korrigert for proteininnholdet bestemt spektrofotometrisk ved bruk av bicinchoninic syre fremgangsmåten i henhold til produsentens protokoll (Sigma).
6. Flowcytometri cellesyklusanalyse
Etter inkubering ble HL60 celler sentrifugert ved 300 x g, vasket i PBS med 5% FBS (PBS + FBS) og suspenderes i en liten mengde PBS + FBS. Deretter ble iskald 70% etanol tilsatt dråpevis, og cellene ble fiksert i 3 timer ved – 20 ° C. Etter fiksering, ble etanol fjernet ved sentrifugering; Cellene ble vasket i PBS + FBS og suspenderes i 4 mM natriumcitrat i PBS + FBS. Til slutt ble cellene inkubert med 200 pg /ml RNase A (Sigma) og 30 ug /ml propidiumjodid (PI) i 20 minutter ved 37 ° C. Celler ble analysert under anvendelse av en Accuri C6 strømningscytometer (Accuri strømsfotometere Europe Ltd., U.K.) som tidligere beskrevet [15]. PI ble eksitert ved 488 nm og fluorescens ble analysert ved 585 nm (FL-2). Per analyse, ble 10.000 hendelser samlet. Cellesyklus analyse ble evaluert ved hjelp av multicycle AV programvare (Phoenix Flow Systems, USA). Cellesyklus tallene ble opprettet med Cyflogic programvare (CyFlo Ltd, Finland).
7. Calcein-AM analyse for bestemmelse av intracellulær Fe-chela egenskaper
Forsøkene analysere Fe-chela intracellulære effektiviteten av de undersøkte agenter ble utført i henhold til Glickstein et al. [16] med mindre modifikasjoner. Den H9c2 cellelinje avledet fra embryonale rottehjerte vev [17] ble kjøpt fra American Type Culture Collection (U.S.A.). Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, 1% P /S og 10 mM HEPES i 75 cm
2 vevsdyrkingskolber ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Subkonfluente celler ble subdyrket hver 3-4 dager. H9c2 celler ble sådd på 96-brønners plater (10.000 celler per brønn), og ble forlatt i 24 timer for å feste. Etterpå kulturmediet ble erstattet med serum-og pyruvat-fri DMEM. Etter 24 timer i serum deprivasjon, ble cellene i det vesentlige ikke-prolifererende, og ble anvendt for forsøkene. Cellene ble fylt med 100 uM jern-III-ammoniumcitrat (FAC) i serumfritt medium i 24 timer før forsøket. Cellene ble deretter vasket, og for å forhindre mulige forstyrrelser (spesielt med hensyn til ulike sporstoffer) ble mediet erstattet med en buffer fremstilt fra Millipore-filtrert (demineralisert) vann, inneholdende 116 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM CaCl
2, 1,2 mM MgSO
4, 1,13 mM NaH
2PO
4, 5 mM glukose og 20 mM HEPES (pH 7,4). Cellene ble deretter lagt i 30 minutter ved 37 ° C med 1 uM celle-gjennomtrengelige acetoksymetylester av calcein grønn (Molecular Probes /KRD, Tsjekkia) og vasket. Cellular esteraser spalte acetoksymetyl-grupper for å gjøre cellemembranen-ugjennomtrengelig calcein grønn, som fluorescens ble slukket av FAC. Intracellulær fluorescens (λ
ex = 488 nm; λ
em = 530 nm) ble deretter fulgt i 24 timer ved 37 ° C ved hjelp av en Infinite 200 M plateleser (Tecan, Østerrike). DEX, SOB og MER ble sammenlignet med den sterke lipofile Fe chelator SIH som ble brukt som referansemiddel.
8. Dataanalyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Data ble utsatt for enveis eller toveis ANOVA med Dunnetts post-test med GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, California, USA) med P≤0.05 som nivået av betydning. Alle målinger ble utført i mer enn fire uavhengige forsøk. IC
50-verdier (konsentrasjon av midler som induserer en 50% reduksjon proliferasjon sammenlignet med ubehandlede kontroller), så vel som kombinasjoner indeksverdier (
CI
-en kvantitativt mål på graden av interaksjon) ble beregnet ved anvendelse CalcuSyn 2.0-programvaren (Biosoft, Cambridge, UK)
IC
50-verdier (konsentrasjon av stoffer som induserer 50% reduksjon spredning sammenlignet med ubehandlede kontroller eller median effekt dose) ble beregnet som følger:.
Hvor
F
a
er fraksjonen påvirkes (spredning hemmet) av en medikamentell behandling;
F
u
er uhemmet fraksjon;
D
x
er dosen av et stoff;
D
m
er median-effekt dosen (IC
50) og m er helningen av kurven. Sistnevnte programvaren ble også brukt til å få kombinasjonen indeks (
CI
) -en strenge kvantitative mål på graden av interaksjon:
Hvor
D
a
og
D
b
er de doser av legemidler som brukes i kombinasjon, mens
D
xa Hotell og
D
xb
er isoeffective doser. Chou og Talalay beskrive interaksjoner i form av nesten additiv effekt (
CI
0,9 til 1,1), liten synergisme (
CI
0,85 til 0,90), moderat synergisme (
CI
0,7 til 0,85), synergisme (
CI
0,3 til 0,7), sterk synergisme (
CI
0,1 til 0,3), veldig sterk synergisme (
CI
0,1) , liten antagonisme (
CI
01.01 til 01.02), moderat antagonisme (
CI
1,20 til 1,45), antagonisme (
CI
1,45 til 3,3), sterk antagonisme (
CI
3,3 til 10) eller veldig sterk antagonisme (
CI
10). Videre, for å vurdere endringer av legemiddelinteraksjoner som en funksjon av konsentrasjon eller aktivitet, brøk påvirke (
F
a
) – kombinasjonsindeks (
CI
) tomter ble beregnet ved hjelp av de CalcuSyn datasimuleringer.
Resultater
1. In vitro-studier kardiotoksisitet
Først ble de kardiotoksiske effekter av maur og potensielle beskyttende inngrep vurdert ved anvendelse av en tidligere publisert protokoll [18] som består av en tre-timers eksponering av NVCMs til DAU eller DOX, etterfulgt av vaskinger for å fjerne maur og myocyte inkubasjon i ANT-free medium; cellulær skade ble bestemt ved anvendelse av en LDH-frigivelse assay. Som observert i figur 2A-B, eksponeringen av isolerte kardiomyocytter til DAU eller DOX i 3 timer etterfulgt av en 48-timers utvaskingsperiode førte til en statistisk signifikant tap av levedyktighet (bestemt som prosentandel av total LDH-frigivelse) i området fra -20 % ved 0,6 mikrometer for både maur til ~55% på 2,0 mikrometer. Pre-inkubering av cellene med 10, 100 og 1000 pM DEX i 3 timer induserte signifikant beskyttelse mot toksisitet av begge maur ved konsentrasjoner opp til 1,2 um (DAU) og 1,4 um (DOX). Denne effekten synes ikke å være doseavhengig, som i de fleste forsøkene 10 og 100 um DEX konsentrasjoner tilbys bedre beskyttelse enn 1000 mikrometer (Figur 2A-B). I cardiomyocytes utsatt for oksidativt stress-induserende middel H
2o
2, toksisitet alt fra ~36% på 200 mikrometer til -50% på 500 mikrometer H
2o
2 ble oppdaget. Men ingen signifikant beskyttelse mot H
2o
2-indusert toksisitet ble funnet med noen analysert konsentrasjon av DEX (figur 2C). For ytterligere undersøkelser, ble 1,2 mikrometer DAU eller DOX valgt, som i denne konsentrasjonen både maur forårsaket signifikant toksisitet forebygges ved DEX preinkubasjonstid. Følgelig, 300 pM H
2o
2 ble valgt for sammenligning ettersom dette konsentrasjonen forårsaket sammenlignbar toksisitet til 1,2 uM av DAU eller DOX. Av de tre Top2 katalytiske inhibitorene anvendt i denne studien, DEX (10-1000 pM) og SOB (i konsentrasjoner opp til dets løselighetsgrense på 300 pM) førte ikke til noe betydelig tap av NVCM levedyktighet. Motsatt MER utstilt betydelig toksisitet ved konsentrasjoner ≥60 mikrometer (Figur 3D). DEX, SOB og MER ble så sammenlignet for deres kardiobeskyttende potensial ved en konsentrasjon på 30 uM, det vil si den høyeste konsentrasjon ved hvilken ingen av de stoffene som induseres sin egen toksisitet. Alle tre Top2 katalytiske inhibitorene var i stand til delvis, men betydelig beskytte NVCMs mot 1,2 uM DAU eller DOX med ~ 10 – 15% reduksjon toksisitet sammenlignet med DAU eller DOX toksisitet alene, men de Top2 inhibitorer hadde ingen signifikant effekt på toksisiteten forårsaket av 300 uM H
2o
2 (figur 3A-C).
Celler ble pre-inkubert med tre konsentrasjoner av dexrazoksan i 3 timer og deretter ko-inkubert med økende konsentrasjoner av antracykliner daunorubicin (DAU, A) eller doksorubicin (DOX, B) 3 timer etter en 48-timers antracyklin som er fri for eller i 48 timer med H
2o
2 (C). Toksisitet ble bestemt som% av total laktat dehydrogenase (LDH) frigjøres fra kardiomyocytter inn i cellekulturmediet. Data fra ≥4 uavhengige forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, statistisk signifikans: c – sammenlignet med stoff-fri kontroll (DMSO); d – sammenlignet med DAU eller DOX; s. – sammenlignet med H
2o
2 (enveis ANOVA med Dunnetts post-test, P≤0.05)
Neonatal rotte cardiomyocytes ble pre-inkubert med deksrazoksan (DEX) , sobuzoxane (SOB) eller merbarone (MER) i 3 timer og deretter inkubert med antracykliner daunorubicin (DAU, A) eller doxorubicin (DOX, B) i 3 timer etter en 48-timers antracyklin frie perioden eller i 48 timer med hydrogen peroxide (H
2o
2, C). DEX, SOB og MER individuell toksisitet etter 48-timers inkubering er vist i panel D. Effekter av DEX pre-behandling i 3 timer med en 3-timers inkubasjon DAU og påfølgende 48-h DAU-fri periode på celle oksidert og redusert glutation innhold er vist i panel E. data erholdt fra ≥ fire uavhengige forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, statistisk signifikans: c – sammenlignet med kontroll; d – i forhold til DAU eller DOX (enveis ANOVA med Dunnetts post-test, P≤0.05)
Som observert i figur 3E, inkubasjon av NVCMs med 1,2 mikrometer DAU i 3 timer fulgt. etter 48 timer i DAU-fritt medium ikke førte til en statistisk signifikant økning i enten GSH GSSG eller, til tross for den betydelige toksisitet forårsaket av denne konsentrasjon og inkubasjon tidsplan. Den pre-inkubering av kardiomyocytter med 30 pM DEX i 3 timer fulgt av ko-inkubasjon med DAU viste en ubetydelig Tendens økning av GSH, men dette forekom i fravær av endringer i GSSG. Kontrollen inkubasjon med DEX alene induserte ikke noen signifikant forskjell fra kontrollverdier for enten GSH eller GSSG (Figur 3E).
En tre-timers eksponering av NVCMs til 1,2 mikrometer DAU eller DOX forårsaket tydelige endringer i cardiomyocyte morfologi , inkludert cytoplasma vakuoliseringen og korning, som gikk inn seponering av cellemonolaget og mobilnettet og kjernekraft krymping. Cardiomyocytes ble farget med JC-en sonde, og det signalet ble visualisert ved fluorescens mikroskopi. Etter eksponering til DAU eller DOX, var det en iøynefallende overgang fra normal rød-farget mitokondrier med polarisert indre membraner til å diffundere grønn fluorescens indikerer døende celler med depolariserte mitokondrier. Pre-inkubering med 30 pM DEX, SOB og, i mindre grad, MER, delvis hindret både ANT-induserte endringer i cellulær morfologi, samt bortledning av den mitokondrielle indre membranpotensial (fig S1).
2. Spredningsstudier
Etter inkubasjon i 72-h, alle stoffer undersøkt hadde betydelige og doseavhengig antiproliferative effekter på HL-60 celler. Maur (DAU og DOX) var effektive ved konsentrasjoner som var tre størrelsesordener lavere enn de katalytiske hemmere; IC
50 verdier for alle stoffer var som følger: 19 nM for DAU, 38 nM for DOX, 25 uM for DEX, 48 uM for SOB og 38 uM for MER. Enkle midler og kombinasjoner av maur og Top2 katalytiske inhibitorer ble så inkubert i 72 timer ved konsentrasjoner svarende til deres IC
50-verdier, og deres interaksjoner ble analysert i henhold til Chou-Talalay metode. I tillegg, som legemiddelinteraksjoner kan endre seg som en funksjon av konsentrasjon eller aktivitet, vi også undersøkt kombinasjoner av chelators og kreft narkotika på fraksjoner og multipler (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) av deres IC
50 verdier, og fraksjon påvirkes (
Fa
) – kombinasjonsindeks (
CI
) tomter ble beregnet ved hjelp av datasimulering (figur 4). Sprednings data er vist i panel A og B i figurer S2-S4, og kombinasjoner indeks (
CI
) beregnede verdier er oppsummert i tabell S1-S3. Disse analysene viste at DEX, SOB og MER forsterkes de antiproliferative effekter av både DAU og DOX når disse stoffene ble co-inkubert samtidig som den tilsvarende
CI
verdier varierte fra moderat til sterk synergi.
Celler ble inkubert enten kontinuerlig med dexrazoksan (DEX, A), sobuzoxane (SOB, B) eller merbarone (MER, C) og daunorubicin (DAU) eller doksorubicin (DOX) i 72 timer eller pre-inkubert med DEX (A), SOB (B) eller HAV (C) i 3 timer eller 6 timer, og deretter inkubert i 72 timer med alle stoffer i konsentrasjoner som svarer til deres IC
50-verdier og IC
50 fraksjoner og multipler (1/8; 1 /4, 1/2, 1, 2, 4). Alternativt ble cellene enten ko-inkubert i 72 timer eller pre-inkubert med DEX i 3 timer og deretter ko-inkubert med DAU i 72 timer i et forhold på 01:20 DAU: DEX (A). Datasimuleringer av kombinasjonen index (
CI
) – celleproliferasjon (fraksjon berørt –
Fa
). Dependences ble oppnådd ved hjelp CalcuSyn 2.0-programvaren
I en annen serie eksperimenter, DEX, SOB og MER ble pre-inkubert i 3 eller 6 timer før tilsetningen av DAU med en etterfølgende 72 h-ko-behandling (paneler C og D i figurene S2-S4, Bord S1-S3). Som observert i disse figurer og tabeller, er disse legemiddelkombinasjoner forble synergistisk med unntak av kombinasjoner av DAU med DEX på sitt høyeste konsentrasjon; i dette tilfellet,
CI
verdier var tilsetningsstoff eller i en sjeldent tilfelle moderat antagonistisk. I tillegg, bortsett fra standard Chou-Talalay kombinasjon studiedesign (hvor midlene påføres i ekvipotente doser), DAU og DEX ble også undersøkt ved anvendelse av den faste 01:20 konsentrasjonsforholdet som brukes i klinisk praksis [19]. Mens heller mindre markert synergisme ble påvist for lavere konsentrasjoner, her, ingen antagonisme skjedd, selv etter preinkubering med DEX i 3 timer, og i denne innstillingen, alle konsentrasjoner av DEX forsterkes den antiproliferative aktivitet av DAU overfor HL-60-celler (figur S2E- F, Tabell S1).
3. Caspase aktivitetsanalyser
Kombinasjoner av maur og top2 katalytiske hemmere ble også undersøkt for deres evne til å aktivere caspases, som er viktige formidlere av apoptose. Inkubering av NVCMs med 1,2 uM DAU i 3 timer etterfulgt av 48 timer med DAU er fri for medført betydelig aktivering av kaspaser 8 og 9, som er nøkkelen extrinsic (reseptor-mediert) og indre (mitokondrielle) apoptotiske pathway initiatorer, henholdsvis, så vel som den utførelse caspaser 3/7 til rundt 200% av kontrollverdiene. Inkubasjon med 30 mikrometer konsentrasjoner av alle tre top2 katalytiske hemmere ikke føre til noen vesentlig økning i aktivitet av noe caspase, men DEX og SOB betydelig beskyttet cardiomyocytes mot caspaseaktivering av DAU. Selv MER forbehandling viste også en trend mot redusert aktivering av alle caspases, gjorde dette ikke statistisk signifikans i forhold til DAU gruppen. I samsvar med resultatene av LDH lekkasje analysen, aktivering av kaspaser etter inkubasjon med DOX var generelt mindre uttalt enn etter DAU inkubasjon. Aktiveringen av begge initiering caspaser var ubetydelig sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5E-F), selv om det var en svak økning. Totalt sett preinkubasjonstid av cellene med DEX, SOB eller MER ikke signifikant endring initiering caspaseaktivering, til tross trenden mot lavere aktivitet. Men aktiviteten av den utøvende caspase 3/7 ble betydelig økt etter DOX behandling, mens top2 katalytiske hemmere effektivt forhindret denne endringen (figur 5D)
Neonatal rotte cardiomyocytes (A – F). Ble pre-inkubert med 30 uM dexrazoksan (DEX), sobuzoxane (SOB) og merbarone (MER) i 3 timer og deretter ko-inkubert med 1,2 uM daunorubicin (DAU; A – C) eller doksorubicin (DOX; D – F) i 3 timer, etterfulgt av et antracyklin-fri 48-timers periode.
