Abstract
Mål
Rollen Sonic pinnsvin (SHH) i epiteliale mesenchymale overgang (EMT) for kreft i bukspyttkjertelen (PC) er kjent, er imidlertid uklart sin mekanisme. Fordi SHH fremmer tumorutvikling hovedsakelig gjennom Gli1, forsøkte vi å forstå dens mekanisme ved å identifisere Gli1 mål i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Metoder
Først undersøkte vi invasjon, migrasjon, og EMT i PC-celler transfektert med lentiviral Gli1 forstyrrelser vektorer eller SHH over-uttrykk vektorer
in vitro
og
in vivo
. Deretter bestemmes vi målgenet profiler av Gli1 i PC-celler ved hjelp av cDNA microarray analyser. Til slutt ble de primære regulatoriske nettverk nedstrøms av SHH-Gli1 signal i PC-celler studert gjennom funksjonelle analyser av disse målene.
Resultater
Våre resultater indikerer at det er nedsatt E-cadherin uttrykk ved økt uttrykk av SHH /Gli1. Migrasjon av PC celler økt betydelig på en doseavhengig måte innen 24 timer Gli1 uttrykk (
P
0,05). Forholdet mellom levermetastaser og intrasplenic miniatyr metastaser økt markert ved aktivering av SHH-Gli1 signaler i nakne mus. Ved hjelp av cDNA microarray, identifiserte vi 278 oppregulert og 59 downregulated gener ved Gli1 uttrykk i ASPC-1 celler. Dataene indikerer at SHH-Gli1 signaler fremme EMT ved formidling av et komplekst signaleringsnett inkludert TGFfi, Ras, Wnt, vekstfaktorer, PI3K /AKT, integriner, transmembran-4-superfamilien (TM4SF), og S100A4.
Konklusjon
Våre resultater tyder på at rettet mot de molekylære forbindelser etablert mellom SHH-Gli1 signalering og EMT kunne tilby effektive behandlinger for PC
Citation. Xu X, Zhou Y, Xie C, Wei Sm, Gan H Han S, et al. (2012) Genome-Wide Screening avslører en EMT Molecular Network formidlet av Sonic Hedgehog-Gli1 signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (8): e43119. doi: 10,1371 /journal.pone.0043119
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 6 juni 2012; Godkjent: 17 juli 2012; Publisert: 10 august 2012
Copyright: © Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Natural Science Foundation of China (81072005 og 81172312) og Shanghai Science and Technology Committee (10ZR1423300) National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sonic pinnsvin (SHH) er involvert i embryonale organogenesen som morfogen. Upassende aktivering av Hysj signaler under bukspyttkjertel formasjons resultater i agenesis og flere bukspyttkjertel sykdommer [1]. SHH er utelukket fra utviklings bukspyttkjertelen samt modne organ, men er oppregulert i kronisk pankreatitt, tidlige bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin) lesjoner, og invasiv kreft i bukspyttkjertelen (PC) [2]. Avvikende SHH oppregulering ble rapportert i Subtotal menneskelige PC celler og kan være en overordnet kritisk formidler av PC utvikling [3].
The Hedgehog (HH) signalveien er nært knyttet til metastase og prognose i kliniske studier og er kreves for PC tumormetastase i ortotopiske musemodeller [3], [4]. Nylig ble denne veien tenkt å organisere det omprogrammering av kreftceller via epitelial mesenchymale overgang (EMT). Interessant, fant nylig bevis på at SHH var signifikant oppregulert i gemcitabin-resistente PC celler som samtidig uttrykker kreftstamcelle (cscs) markører [5]. Fordi SHH-induserte mål-genprodukter kan bidra til selvfornyelse, overlevelse, og migrering av kreft progenitorceller og Gli1 kan spille en avgjørende rolle i den ondartede oppførselen til PC-celler [6], [7], identifisere Gli1 mål er et logisk skritt å forstå mekanismen i PC-celler.
målet med denne studien var å gi et rammeverk for de primære regulatoriske nettverk nedstrøms av SHH-Gli1 signal i PC-celler. Vi har også forsøkt å finne ut om spesifikke Gli1 målgener koble SHH-Gli1 alarm og EMT, og dermed gi en terapeutisk strategi for PC.
Materiale og metode
Cell kultur
PC cellelinjer (BxPC3, ASPC-en, og Panc-1 ble alle reddet av den kinesiske Academy of Sciences.) ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft.
Vector konstruksjon og celleinfeksjon
lentivirale vektorer for overføring av humant Gli1 shRNA eller SHH cDNA ble bygget av Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kina. Dette systemet inkluderer lentiviral vektor pLVTHM, konvolutten plasmid pMD2G, og emballasje plasmider pRSV-REV og pMDlg-pRRE. Lentivirus-SHH (L-SHH) inneholder et 3,3-kb SHH-kodende sekvens og den lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) inneholder små hårnål Gli1 RNA til den målsøkende sekvensen av shRNA, som tidligere beskrevet (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3- «) [8]. Den lentivirus-kontroll (L-C) ikke inkluderer Gli1 forstyrrelser sekvenser eller SHH cDNA-sekvenser og fungerte som kontroll. Lentivirale konstruksjoner ble verifisert ved DNA-sekvensering. Rekombinant lentivirus ble fremstilt ved transient transfeksjon av 293T-celler etter en standard protokoll. Når BxPC3, ASPC-1, og Panc-1 celler var omtrent 50% sammenflytende (i RPMI-1640 inneholdende 2% FCS), ble de infisert med lentivirale konstruksjoner ved MOI på 5. Cellene ble høstet etter 72 timer for ytterligere eksperimenter. For å identifisere funksjonelle L-SHH og L-Gli1i konstruerer, vi rutinemessig analysert SHH og Gli1 uttrykk ved QRT-PCR
A:. Uttrykk for SHH, Gli1, Patched1, og E-cadherin mRNA i nærvær av L -Gli1i og SHH transduksjon. B:. Western blot som viser proteinuttrykk av Gli1, E-cadherin og GAPDH i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
RNA ekstraksjon og sanntid RT-PCR-analyser
Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Total-RNA (100 ng) ble reverstranskribert i 20 ul volum og 2 ul cDNA ble anvendt for PCR, i henhold til produsentens instruksjoner. (Takara bioteknologi, Dalian, Kina). Primersekvensene er vist i tabell 1. CT (syklus terskel) verdier ble standardisert til CT verdier av GAPDH
A1-9.: Krystallfiolett farging av PC-cellene gjennom polykarbonat membranporene (200 x forstørrelse). B: Celle tellinger av trekkende PC celler som analyseres av transwell analysen. C1-3: Celle proliferasjon, som bestemt ved MTT (C1: BxPC-3-celler, C2: ASPC-1-celler; C3: Panc-1 celler). *
P
0,05, **
P
. 0,01
Protein utvinning og vestlige blotting analyser
Totalt protein ble utvunnet med RIPA-buffer i henhold til standard metoder og prøver ble normalisert for proteininnhold ved bruk av et kommersielt tilgjengelig kit (Bio-Rad Laboratories Inc Philadelphia, PA USA). Proteinprøver ble separert med 6% SDS-PAGE (for Gli1 protein) og 12% SDS-PAGE (for SHH, E-cadherin og GAPDH). Proteiner ble overført til PVDF-membraner, og membranene ble inkubert i 2 timer i TBST-buffer, fulgt av inkubering over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer [1:1000 (v /v) for SHH, E-cadherin, eller GAPDH og 1: 500 (v /v) for Gli1] i blokkering løsning og visualisering ved hjelp av ECL Detection system (GE Healthcare biovitenskap, Piscataway, NJ, USA)
A:. Milt svulster og levermetastaser i en makroskopisk eksemplar av L-SHH gruppe. B: Milt tumorer og levermetastaser i en makroskopisk eksemplar av L-C-gruppen. C, D og E: fluorescensmikroskopi bilder. F, G og H: Lightmicroscopy bilder. (C, F: Milt svulster fra L-Gli1i gruppe; D, G: Intrasplenic miniatyr metastaser fra L-C gruppe, E, H: levermetastaser fra L-SHH gruppe). *
P
0,05, **
P
. 0,01
Transwell analyser
Cell invasjon analyser (24 -vel prøvesett, Chemicon, Bedford, MA, USA) ble brukt til å studere PC cellelinje invasjon og migrasjon. I korthet PC-celler (1 x 10
5) ble separat sådd ut i serumfritt media i matrigel forbelagte Transwell kamre (øvre kammer), som inneholdt polykarbonatmembraner med 8-um porer. Media inneholdende 2% FCS ble tilsatt til den nederste kammer. Transwell kamrene ble så plassert på 24-brønners plater. Etter inkubering i 24 timer ble migrering av PC-celler bestemt ved å fotografere membranen gjennom mikroskopet. Teller ble registrert fra de 5 områdene med de høyeste cellekonsentrasjoner på høy effekt forstørrelse (× 200). Gjennomsnittsverdien av feltene ble ansett migrasjon telling av PC-celler
A:. CDNA microarray data cluster sammenligne L-C og L-Gli1i celler. B: Funksjonell klassifisering av forskjellig uttrykt gener. Se også tabell 2.
Cell vekstanalyser
Cellevekst ble bestemt ved bruk av MTT [3- (4, 5 dimetyl-2-tiazolyl) -2,5 -diphenyl- 2H-tetrazoliumbromid] analyser. Kort sagt ble PC-cellelinjer sådd ut i 96-brønners plater. MTT-analyser ble utført etter 12, 24, 48, og 72 timer, og optiske densiteter ble bestemt ved en bølgelengde på 490 nm.
levermetastaser induksjon av milt injeksjon
Tre grupper av ASPC-1 celler (lentivirus-Gli1i, lentivirus-kontroll, og lentivirus-Shh) ble brukt til å påvise metastaser etter intrasplenic inokulasjon i hårløse mus som tidligere beskrevet [9]. I korthet, ble musene bedøvd med metoksyfluran, ble en liten buk venstre flanke snitt gjort, og milten ble eksponert. ASPC-1-celler ble injisert inn i milten med en 30-gauge nål. Milten ble returnert til magen, og såret ble lukket i ett lag med sår klips. Etter 8 uker, høstet vi lever og milt, og produsert kontinuerlig frysesnitt. Vi farget seksjonene med hematoxylin og eosin og telles milt svulster, intrasplenic miniatyr metastaser, og levermetastaser under et fluorescens mikroskop og optisk mikroskop. Alle dyreforsøk protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av forsøksdyrutvalget komité Tongji University
A: Målgener og signale involvert i EMT regulert av Gli1 i PC-celler;. B:. Den antatte crosstalk modell innenfor EMT molekylære nettverk formidlet av SHH-Gli1 signale
cDNA microarray analyser
ASPC-1 celler transduced med L-Gli1i og LC ble brukt i cDNA microarray analyser med Affymetrix human Genome U133 Plus2.0 Array Genechip. Tre forsøk ble utført på en enkelt total RNA-preparat fra cellene. Signalverdier er presentert som middelverdi av 3 gjentatte eksperimenter. cDNA microarray-analyser og statistiske analyser av genuttrykk resultatene ble utført som beskrevet tidligere [10].
Statistiske analyser
For alle statistiske analyser, brukte vi SPSS17.0 programvare (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). Kontinuerlige variabler er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Non-paret Student t-tester ble brukt for statistisk evaluering.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Lentiviral-Gli1i og -SHH transduksjon effektivitet og PC celle EMT er regulert av SHH-Gli1 signale
Vi tilført tre PC cellelinjer med lentiviral Gli1 forstyrrelser vektor (L-Gli1i), SHH over-uttrykk vektor (L-SHH), og kontroll vektor (LC). Vi bekreftet endringer i aktivering av SHH-Gli1 signalering ved å evaluere uttrykk for SHH, Gli1, og Patched1 med real-time RT-PCR. The real-time RT-PCR data viste at Gli1 og Patched1 genene ble signifikant nedregulert av L-Gli1i transduksjon, mens Gli1 og Patched1 ble oppregulert av L-SHH transduksjon sammenlignet med LC (
P
0,01; figur 1A). Gli1 og Patched1 var målgener i de fleste celletyper med SHH signale aktivert derfor resultatene foreslår lentiviral vektorer effektivt endret aktivering av SHH-Gli1 signaler. De E-cadherin mRNA nivåer ble drastisk redusert med økt SHH /Gli1-uttrykk i PC-celler. En lignende trend ble observert med E-cadherin protein.
PC celle invasjon og migrasjon er regulert av SHH-Gli1 signale
Data fra transwell analyser viste at et økt antall celler fra PC cellelinjer invadert i en Gli1 doseavhengig måte gjennom Matrigel-belagte filter innen 24 timer (
P
0,05, figur 2A1-A9, B).
den SHH-Gli1 signalveien regulerer PC-celleproliferasjon
Vårt MTT-data viste at L-Gli1i /SHH transduksjon ikke signifikant påvirker celleproliferasjon i løpet av 24 timer. Imidlertid, etter 48 timer, økte PC-celle proliferasjon med viral transduksjon (figur 2C1-C3).
levermetastaser etter injeksjon av ASPC-1-celler i nakne mus reguleres av SHH-Gli1 signale
Vårt data fra nakne mus-modellen viste at 8 uker etter intrasplenic injeksjon av ASPC-1-celler, ble det milt tumorer hos 8 av 10 mus i den L-Gli1i gruppe, 8 av 9 mus i LC-gruppe, og 9 av 9 dyr i L-SHH gruppe. De gjennomsnittlige antall milt miniatyr svulster var 2,6, 4,9 og 8,9, henholdsvis. Forekomsten av levermetastaser var 3 av 8 mus i L-Gli1i gruppe, 5 av 8 mus i L-C-gruppen, og åtte av ni dyr i L-SHH gruppe. De gjennomsnittlige antall levermetastaser var 2,7, 4,2, og henholdsvis 6,7, (figur 3, tabell 2).
cDNA microarray analyser av Gli1 målgener i ASPC-1 celler
Patched1 genet en direkte mål for Gli1 ble oppregulert 1,71341 ganger i denne studien. Derfor setter vi 1,7 ganger regulering som målgenet standard. Ved hjelp av denne grensen, målgenet profildata viste at 278 gener ble oppregulert og 59 gener ble nedregulert på Gli1 i ASPC-1 celler. (Tabell 3). De regulerte gener ble klassifisert i ulike kategorier basert på veldokumentert og etablert biologisk eller patologisk funksjon. Gener som reguleres av Gli1 hører hjemme i hovedsak tilhører følgende kategorier: celle invasjon /migrasjon, angiogenese, celleoverlevelse, transport, metabolisme, signaltransduksjon, og immunsystemet forsvar (figur 4). Vi deretter sammenlignet disse målgener med tidligere data ved å søke på Medline-databasen for å screene for forskjellig uttrykt PC gener og SHH signalveien målgener. Ved å benytte denne fremgangsmåten, identifiserte vi 58 oppregulert gener (tabell 4) og en nedregulert gen ved Gli1 hemning i vårt skjerm som tidligere var blitt funnet å være tilsvarende regulert i PC. Ved bruk av samme metode, fant vi 22 oppregulert gener ved Gli1 hemning som tidligere ble funnet å være korrelert med SHH signale (tabell 4). Videre ble 15 av 22 gener som ble rapportert å være overuttrykt i PC involvert i celle metastaser, inkludert ITGB4, ANG, VEGFA, S100A4, WNT5A, og TGFB2 samt celle overlevelse, slik som BCL2, BIRC3, IGFBP6, KLF4, og Plau. Minst 8 gener (WNT5A, BCL2, IGFBP6, PTCH1, MSX2, TGFB2, HOXC6, og SOX13) ble tidligere vist å være direkte mål av SHH signale [10], [11].
Diskusjoner
I denne studien, kan celleoverlevelses målgener deles inn i flere typer: (1) spredningsrelaterte gener, slik som IGFBP6, IGF1R, IRS1, EGFR, og ALOX5, (2) apoptose-relaterte gener, slik som BIRC3 og Bcl-2, (3) cellesyklusrelaterte gener, slik som CCNG2, CDC2L6, og CDK6, og (4) CSC orCSCs vedlikeholds-relaterte gener. Stamcelle-fenotypen overveiende inkludert EMT, anti-behandling, og stamcelle markører. IGF signalveien var en nøkkel spredning relaterte sti og BCL-2-familien var en viktig klassiker apoptotiske signalveien. Det ble rapportert at Gli1 direkte regulerer CCND transkripsjon og våre data tyder på det kan regulere CCNG2 på samme måte [7]. Den ABCC3-genet koder for multimedikamentresistens-assosiert protein 3 (MRP3), som er involvert i kjemoterapi motstand av kreftceller [12]. Dessuten har MTS oppregulering og CTPS nedregulering også blitt rapportert å føre til kjemoterapi motstand [13]. I tillegg er KLF4 en stamcelle markør som fremmer kreft stamcelle populasjon vedlikehold og CD59 oppregulering kan være forbundet med tumorcelleimmun flukt [14], [15]. Interessant, HUS1 nedregulering sannsynlig svekker skade på DNA reparasjonsmekanismene [16].
Angiogenese er nødvendig for kreft metastase så vel som for cscs mikromiljøet vedlikehold. Betydelig bevis tyder på at aktivert SHH signale kan være en angiogenese-initiere signalveien under bukspyttkjertelen kreftutvikling, selv om den nøyaktige mekanismen ikke er kjent [17]. I denne studien fant vi at Gli1 betydelig oppregulert pro-angiogene faktorer, blant annet ANG, VEGFA, PDGFA, TNFRSF12A, og IL-8, som tyder på det har en viktig regulerende rolle i PC-angiogenese. Videre, i denne studien, VEGF og PDGF ble oppregulert på samme tid, noe som tyder på at proangiogenesis mekanismer av SHH banen ikke bare er involvert i endotelceller (ECS) tuberformation, men også karveggen modning.
Det ble rapportert at SHH signalveien aktivering ledsaget EMT og EMT er nødvendig for migrering av SHH-responsive celler under vev morphogenesis. Men det var ingen bevis for at Gli1 direkte regulert Snail eller Slug transkripsjon. I denne studien, target profildata viste at SHH signalisering i EMT involverte en kompleks crosstalk nettverk (figur 5A). EMT-relaterte målgener oppsummeres som følger: (1) TGF-β signalveien:
TGFβ2 Hotell og
TGFβR3
. Tidligere studier har vist at TGFp-signalisering er signifikant forhøyet i PC med Smad4 mutasjon, som resulterer i tap av Smad4-avhengig hemming av cellevekst og øket Smad4 uavhengig EMT [18]. (2) Ras signalveien: RAB27B, RAB8B, RASA4, RHEBL1, RHOU, RRAS, og RIN2. Data tyder på Ras /ERK1 /2 veier er involvert i mesenchymale transformasjon av PC celler [19]. (3) Wnt signalveien: wnt5a. Tidligere studie tyder på at wnt5a fremmer EMT gjennom en ikke-klassiske veien [20]. (4) PI3K /AKT signalveien: ITPKB. PI3K ble funnet å styrke sneglen atom kolonisering gjennom PAK1 aktivering av AKT-signalveien i EMT [21]. AKT fungerer som et sentralt punkt for å omsette ekstracellulære (vekstfaktorer inkludert insulin, IGF-1, og EGF) og intracellulær (slik som mutert eller aktiverte reseptor-tyrosin-kinaser, PTEN, Ras, og Src-signaler) [22]. (5) vekstfaktor og reseptor signalveier:
IGF1R, IGFBP6, IGFL2, EGFR, PDGFA, etter og
VEGFA
Tidligere studier har vist at unormal aktivering av disse banene fremmer epitelial-avledet tumor. ekspansjon og progresjon gjennom promotering av EMT-lignende overganger. Når det gjelder mekanismer, induserer IGFR signale ekspresjon av transkripsjonsfaktorene sneglen og Zeb [23]. PDGF kan indusere EMT via aktivering av Wnt signalveien [24]. VEGF og EGF kan øke av sneglen og Twist protein uttrykk [25]. (6) Integriner: I
TGA3, ITGB4, etter og
ITGB6
. Det har blitt rapportert at de a3 og ß4 underenhetene kan gjøre opp laminin-bindende integriner med andre underenheter, slik som α3β1 eller α6β4, og disse underenhetene kan palmitoylated som kan bidra til integrin-tetraspanin interaksjoner [26]. De potensielle prometastatic funksjoner av disse inteunderenheter, spesielt p 4, ble rapportert tidligere og tyrosinfosforylering av p 4 SHC-bindingssete resultater i demontering av hemidesmosomes og mobilisering av signale-aktivert α6β4 inte. Mobilisert α6β4 brytere fra keratin til aktin filament forening og kan megle migrasjon og invasjon av laminin isoformer [26]. (7) TM4SF:
TSPAN1
TSPAN1 gen over-uttrykk ble påvist i leverkreft, prostatakreft, magekreft, livmorhalskreft, og endetarmskreft [27].. Det er blitt foreslått at TSPAN1 genekspresjon korrelerer med celleproliferasjon og kreft prognose. Våre data tyder på at TSPAN1, som medlem av TM4SF, kan delta i EMT ferd med PC-celler. Imidlertid er det fortsatt ikke bestemt hvordan den samhandler med inte, vekstfaktorer eller andre TM4S proteiner. (8) microRNAs:
MIR-21
. Studier har vist at MIR-21 er forbundet med PC-metastase og prognose, og kan spille en rolle i TGF-β -indusert EMT [28], [29]. (9) S100A genet familie:
S100A4
. Det har blitt rapportert at S100A4 og E-cadherin er omvendt reguleres i flere cellesystemer, og at S100A4 fremmer ekspresjonen av de grunnleggende transkripsjonsfaktorer, Twist og snegle, i EMT prosessen, samt mesenkymale markører, inkludert vimentin og MMP’er [30 ], [31].
Interessant, tyder våre data på at EMT molekylære nettverk formidlet av SHH signale kan inneholde minst to viktige positive tilbakemeldinger looper i PC-celler. Den første er positive tilbakemeldinger mellom SHH og TGFB signalering.
In vitro Hotell og
in vivo
bevis tyder på crosstalk mellom TGFB og Shh resulterer i gjensidig induksjon. TGFB oppregulert SHH og aktivert Gli1 under EMT induksjon; imidlertid, SHH signale oppregulert TGFβ2 og TGFBR3 som demonstrert i denne og en tidligere studie [32], [33]. Den andre positive feedback loop er mellom SHH og Ras signalering. Tidligere studier har vist at k-ras mutasjon var en viktig mekanisme for SHH og Gli1 oppregulering i PC-celler og i denne studien fant vi at Gli1 oppregulert flere Ras-relaterte gener for å aktivere Ras signale [34].
basert på tidligere studier og våre data, spekulerer vi at denne molekylære nettverk kan starte med
k-ras
mutasjoner, etterfulgt av SHH signalaktivering, og til slutt, slutter seg til TGFp signal og en positiv feedback loop former mellom de tre trasé. Den SHH signal ble kontinuerlig forbedret gjennom denne positive tilbakemeldinger og direkte fremmer EMT via regulering av EMT-relaterte Gli1 målgener, slik som
IGFR1, VEGF, EGF, etter og
S100A4
. (Figur 5B). Dette kan imidlertid molekylær nettverksmodell være mer komplisert med deltakelse av flere signal proteiner, slik som inte PI3K /AKT og WNT.
Takk
Vi takker alle medlemmer av Sentrallaboratoriet av det tiende Hospital of Tongji University.
