Abstract
Bakgrunn
Som en serin /treonin protein kinase, spiller p70S6K en viktig rolle i tumor celler. Bevis har avdekket overekspresjon av p70S6K og fosforylert p70S6K (p-p70S6K) i ulike tumorvev, med disse proteinene identifisert som uavhengige prognostiske markører i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I denne studien utforsket vi rollen som p70S6K spesifikk hemmer PF-4708671 i NSCLC.
Metoder
Tre NSCLC cellelinjer (A549, SK-MES-en, og NCI-H460) ble behandlet med PF-4708671 ved fem forskjellige konsentrasjoner, inkludert 0,1 gM, 0.3μM, 1 uM, 10 uM og 3 um, og proteinnivåer ble bestemt ved hjelp av Western-blot. Deretter ble PF-4708671 effekter vurderes både
in vitro plakater (celleproliferasjon, apoptose, cellesyklus distribusjon, og invasjon) og
in vivo
.
Resultater
de uttrykk nivåer av p-p70S6K og nedstrøms effektor S6 ble betydelig redusert ved PF-4708671. Diametralt motsatte, nedstrøms protein nivåer av BAD, Caspase3 og ERK hadde økt etter behandling med PF-4708671. I tillegg PF-4708671 drastisk hemmet celledeling og invasjon evne i A549, SK-MES-1 og NCI-H460-celler
in vitro
, forårsaker cellesyklus arrest i G0-G1 fase. Begrenset effekt av PF-4708671 ble observert på apoptose i de tre NSCLC cellelinjer vurderes. Viktigere, PF-4708671 kan hemme tumordannelse i nakne mus
in vivo
.
Konklusjon
Disse funnene viste at p70S6K spesifikk hemmer PF-4708671 har hemmende effekt på NSCLC tumorigenesis
in vitro Hotell og
in vivo
. Derfor P70S6K bør betraktes som en ny potensiell terapeutisk mål, og PF-470867 kan brukes som målrettet medikament for kreftbehandling
Citation. Qiu ZX, Sun RF, Mo XM, Li WM (2016) The p70S6K spesifikk hemmer PF-4708671 hindrer ikke-småcellet lungekreft Vekst. PLoS ONE 11 (1): e0147185. doi: 10,1371 /journal.pone.0147185
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 17 november 2015; Godkjent: 30 desember 2015; Publisert: 15 januar 2016
Copyright: © 2016 Qiu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81372504), Science and Technology Support Program of Science and Technology Department of Sichuan provinsen (2014SZ-0148), og International Cooperation Program of Science and Technology Department of Sichuan-provinsen (2014AA022202-2)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Lungekreft er en av de vanligste kreftformer, er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, med høyest sykelighet og dødelighet i Kina. Mer enn 80% av pasienter med lungekreft er diagnostisert som ikke-småcellet lungekreft [1]. Til tross for kombinasjonsbehandling med kirurgisk reseksjon, cellegift, strålebehandling og biologisk target terapi, den generelle fem års overlevelse av lungekreft er bare 16%, varierende fra 52,2% til 4% i lokale og scene pasienter, henholdsvis [2]. Derfor identifisering av nye mål og klarlegging av endringer på molekylært nivå kan være gunstig for lungekreft behandling.
Som en serin /treonin protein kinase av AGC kinase familien, p70S6K fosforylert av ulike vekstfaktorer og insulin -liker faktorer gjennom PI3K /mTOR vei, og samhandler med S6, eIF4B, eEF2K, PDCD4 og mange andre underlag; Dette er viktig for mitogen-indusert celleproliferasjon, overlevelse, motilitet og kjemoterapi legemiddelresistens i cancerceller [3]. Nylige studier har vist at overekspresjon av p70S6K, og p-p70S6K i forskjellige tumorvev er viktig for å forutsi dårlig prognose, og bidrar til kjemoterapi motstand [4-14].
In vitro
overekspresjon av p70S6K fremmer cellevekst, angiogenese og apoptose undertrykkelse [15, 16]. I mellomtiden, hemmer S6K1 knockdown p70S6K ekspresjon og reduserer celleproliferasjon, minktumordannelse i nakne mus [17]. Dessuten, p70S6K og p-p70S6K-nivåer er betydelig høyere i tumorer enn i normalt vev fra NSCLC [18, 19]. Vår tidligere studie viste at p-p70S6K er nært knyttet til langsiktig overlevelse i NSCLC [20]. Derfor spiller p70S6K en viktig rolle i NSCLC, og vurdering av høy spesifisitet p70S6K hemmere kan bidra ytterligere definere denne nye terapeutiske mål for klinisk anvendelse.
Aktuelle studier for målet behandling for kreft hovedsakelig fokuserer på mTOR-hemmere [20] , mens verka vurdere p70S6K hemmere ved lungekreft behandling er begrenset [21-25]. Denne studien fokuserer på de spesifikke p70S6K inhibitor PF-4708671 å vurdere virkningene av p70S6K hemming i NSCLC [22].
Metoder
1. PF-4708671 (C
19H
21F
3N
6)
PF-4708671 (# 559273 Calbiochem, Merck, USA) er en hemmer av S6K1 (Ki = 20 nM ; IC50 = 160 nM). 10 mg av PF-4708671 ble fullstendig oppløst i 1 ml DMSO og lagret ved -80 ° C i
in vitro
eksperimenter. For
in vivo
assays, PF-4798671 ble oppløst i 10% DMSO første og ytterligere fortynnet i 30% PEG400, 0,5% Tween 80 og 5% propylenglykol, for å oppnå en endelig DMSO-konsentrasjon på 1%.
2. Cellekultur
Tre ikke-småcellet lungekreft cellelinjer ble hentet fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, og dyrket i henhold til leverandørens anbefalinger. De inkluderte A549 (adenokarsinom), NCI-H460 (stor celle karsinom), og SK-MES-1 (plateepitelkarsinom) celler. Alle celler ble opprettholdt i en fuktig miljø som inneholdt 5% CO2 ved 37 ° C.
3. Western blot
Proteiner ble hentet fra celler ved hjelp av fosforylert protein utvinning kit (keygen, Nanjing, Kina), og konsentrasjonene ble målt ved hjelp av BCA Protein Assay Reagent (Thermo vitenskapelig, Rockford, USA). Like mengder av protein fra forskjellige prøver ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektro-overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billeraica, USA). Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med anti-p70S6K R365, anti-p-p70S6K T389, anti-ribosom-protein S6 A229 (# BS1568, # BS4440, # BS3610, 1; 1000, BioWorld Technology, Nanjing, Kina ), anti-BAD, anti-Caspase3, anti-ERK (# 9239P, # 96625, # 3552S, 1: 1000, Cell Signaling Technology), og anti-β-aktin (# 4970, 1: 5000, Cell Signaling Technology) antistoffer, henholdsvis. Target-proteiner ble påvist ved anvendelse av ChemiDoc XRS-system (Bio-Rad, Philadelphia, USA) etter eksponering for kjemiluminescens HRP-substrat (Millipore, Billerica, USA). Data ble analysert med nummer én 1-D Analyse programvare (Bio-Rad).
4. Celleproliferasjonsanalyse
Cell spredning av NSCLC cellelinjer ble målt ved hjelp av celletelling kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens protokoll. Tumorceller ble sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 5 x 10
3 per brønn. Etter inkubering i nærvær av PF-4708671 (0,1 gM, 0.3μM, 1 uM, 3 um og 10 uM) i 24, 48 og 72 timer henholdsvis, ble celleproliferasjon vurdert. DMSO behandlede eller ubehandlede celler ble anvendt som negative kontroller. I tillegg ble markør celleproliferasjon Ki-67 undersøkt av immunhistokjemi i naken tumorvev.
5. Cellesyklusanalyse
For hver cellelinje, ca 1 × 10
6 celler ble høstet etter behandling med 10 uM PF-4708671 for 24 timer; cellesyklus distribusjon ble vurdert ved hjelp Cell Cycle Detection Kit (keygen, Nanjing, Kina); DNA-innholdet ble bestemt på et FACSCalibur Flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA). Data ble analysert ved hjelp av Cellquest og Modfit programvare.
6. Cell invasjon
Cell invasjonen ble evaluert ved bruk av Millipore celle invasjon analysesett (# ECM550, Millipore, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, etter behandling med PF-4708671 ved 10 uM for 24 timer. Cellesuspensjoner inneholdende 1 x 10
6 celler /ml ble sådd ut på det øvre kammer med medium supplementert med 1% serum. Media inneholdende 20% FBS ble tilsatt til nedre kammer.
7. Cell apoptose
Omtrent 5 x 10
5 Cellene ble høstet etter behandling med PF-4708671 ved 10 uM for 24 timer, og farget med Annexin V-APC /7-AAD apoptose Detection Kit (KeyGen, Nanjing, Kina ) i henhold til produsentens protokoll. Fluorescens ble målt på et FACSCalibur Flowcytometer. Annexin V-positive og 7AAD-negative celler som antas å være apoptotiske. I tillegg ble TUNEL-metoden benyttet for å bestemme apoptose i xenograft tumorvev.
8.
In vivo
effekten av PF-4708671 i en naken mus xenograft modell etablert med H460-celler
H460 celler, som viste den høyeste vekstraten, ble valgt for
in vivo
eksperimenter. Kvinne naken mus (4 uker, 18 til 20 g) ble kjøpt fra Beijing WeiTongLiHua forsøksdyr teknisk co., LTD. (Kina), og holder til i Animal Center of West China Sichuan University, med en 12 t lys /12h mørke syklus. Alle forsøkene ble utført i SPF (Special Patogen Free) forhold. Mus ble delt i tre grupper tilfeldig, og hver gruppe inneholdt tre mus (n = 3 /i hver gruppe). Endepunktene for observasjon var som følger: 1) diameteren av tumorer 3cm; 2) transplanterte svulster hadde nekrose og /eller forfall; 3) naturlig død. Metoden for offer på slutten av vivo forskning ble overfalt etter anestesi under forutsetning av uten andre mus kunne se. I gruppe 1 (H460 gruppe), 1 × 10
7 H460 celler ble subkutant injisert i mus. Gruppe 2 (negativ kontroll, NC-gruppen) ble dyrene injisert celler som i Gruppe1; Tre dager senere ble de administrert intraperitonealt 200 ul av løsningsmiddel blanding (1% DMSO, 30% PEG400, 0,5% Tween80 og 5% propylenglykol) daglig i en uke. I gruppe 3 (H460 + PF4708671 gruppe), ble musene behandlet som beskrevet for gruppe 2, med 200 ul PF4708671 (50 mg /kg) i stedet for oppløsningsmiddel blanding. Svulster størrelser ble målt daglig i mer enn en uke (lang diameter = en; kort diameter = b), og volumene ble utledet slik: V = ab2 /2. Tumorinhibering rate = [(kontroll tumorvekt-eksperimentelle tumorvekt) /kontroll tumorvekt] x 100%. Studien ble godkjent av etisk komité for West Kina Hospital.
9. Statistisk analyse
Data ble behandlet av Microsoft Excel 2010. Ved hjelp av SPSS 19.0 programvare, t-test og enveis-ANOVA ble brukt for dataanalyse. Dataene er gjennomsnitt ± SD, og tosidig
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1. PF-4708671 hemmer p70S6K og S6 fosforylering
Våre resultater viste at de konkrete p70S6K inhibitor PF-4708671 betydelig redusert fosforylering av p70S6K og dens nedstrøms S6 på 0,1 gM (
P
0,05) ; p-S6 uttrykk nivåer avtok med økende medikamentkonsentrasjoner (
P
0,05). Tvert imot, proteinnivåer nedstrøms BAD, ble Caspase3 og ERK økte etter behandling med PF-4708671 med den konsentrasjon på 1 uM. Men totalt p70S6K og S6 proteinnivåer hadde ingen signifikante forskjeller mellom negativ kontroll og behandlingsgrupper (figur 1, S1 File).
1. Protein ekspresjonsnivåene av p70S6K, p-p70S6K, S6, og p-S6 etter behandling med forskjellige medikamentkonsentrasjoner. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. 2. Protein uttrykk nivåer av p-p70S6K og p-S6 under forskjellige medikamentkonsentrasjoner.
P
0,05: medikamentell behandling gruppe vs negativ kontrollgruppe. N, negativ kontroll; A, H460; B, A549; C, SK-MES-1.
2. PF-4708671 hemmer NSCLC celleproliferasjon
CCK-8 analysedata viste at spredning evner av de tre NSCLC cellelinjene ble betydelig hemmet av PF-4708671. Etter 24 timers behandling, PF-4708671 hemmet H460-celleformering ved 10 uM, og A549 og SK-MES-1-cellemengder ble signifikant redusert på 3 um og 0,1 gM, henholdsvis (
P
0,05). I tillegg H460, A549, og SK-MES-1 celle vekstrater ble betydelig hemmet av PF-4708671 ved 0.3μM, 0,1 gM, og 0,1 gM henholdsvis 48 timer etter behandling (
P
0,05). Alle cellelinjer viste signifikant redusert spredning på 72 timer etter behandling med 0,1 gM PF-4708671 (
P
0,05). Betydelig tids- og konsentrasjonsavhengig inhibering av celleproliferasjon ble observert i alle cellelinjer (
P
0,05) (Fig. 2)
Proliferation inhibering hastighet = [1 – (forsøksgruppen verdier – blank verdi) /(negativ kontrollgruppe verdi -. blank verdi)] x 100%
3. PF-4708671 påvirker NSCLC cellesyklusen
Etter DNA farging av PI, flowcytometri analyse viste cellesyklus arrest i G0 /G1 fase for alle tre NSCLC cellelinjer (
P
0,05). I mellomtiden var andelen av celler i S og G2 /M faser ble betydelig redusert i A549-celler (
P
0,05). I tillegg ble det reduserte mengder av S-fasen (H460) og G2 /M fase (SK-MES) celler også detektert (
P
0,05) (Fig. 3)
(* p. 0,05, medikamentell behandling gruppe vs negativ kontrollgruppe)
4. PF-4708671 hemmer betydelig celle invasjon
PF-4708671 hemmet invasjon evne i de tre NSCLC cellelinjer vurderes. Faktisk gjennomsnittlig antall celler som passerer gjennom den ekstracellulære matrise gel var betydelig lavere i behandlingsgruppene enn i negative kontroller (
P
0,05), med invasjon hemming priser på 75,90%, 46,23% og 82,73%, for H460, A549 og SK-MES-1 celler, henholdsvis (figur 4).
5. PF-4708671 øker NSCLC celle apoptose
PF-4708671 viste begrenset effekt på apoptose i de tre NSCLC cellelinjer, men statistisk signifikante forskjeller ble oppnådd (
P
0,05). Sammenlignet med negative kontrollgrupper, apoptose priser for H460, A549 og SK-MES-1 cellelinjer ble økt med 1,537%, 2,483% og 3,475%, henholdsvis (
P
0,05) (figur 5).
6. PF-4708671 hemmer tumorigenesis
in vivo
Alle transplanterte svulster ble dyrket ut med hell i hver mus, og alle musene har ingen tegn til miscomfort og /eller lidelse før vi setter dem i hjel. Trender i tumorvolumer i nakne mus i hver gruppe er oppsummert i tabell A i S1 og S2 fil fig. Dyr behandlet med p70S6K spesifikk hemmer PF470867 viste åpenlyst hemmet tumorvekst sammenlignet med Gruppe 1 (H460) og gruppe 2 (NC) (alle
P
0,05). Som vist i tabell B i S1 Fil og S3 Fig, vekt og volum av det utskårede tumorer var lavere etter behandling med PF470867 sammenlignet med kontrollverdiene (
P
0,05). Videre celleproliferasjon, som uttrykt av Ki-67, ble betydelig redusert i H460 + PF4708671 gruppen sammenlignet med verdier oppnådd for begge kontrollgruppene. Til slutt, TUNEL-farging viste signifikant høyere apoptotisk hastighet for tumorceller i gruppe 3 sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe 1 og 2) verdier (Fig 6).
piler viser positivt fargede celler. Original forstørrelse, × 400.
Diskusjoner
P70S6K deltar i tumorigenicity og kreft progresjon, men mekanismen bak dens effekt er ikke helt forstått. Studier som vurderer p70S6K i forhold til NSCLC er knappe; vi tidligere funnet at p70S6K overekspresjon fremmer NSCLC celleproliferasjon, hemmer celle apoptose og forbedrer invasjon evne. For ytterligere å forstå hvilken rolle p70S6K hemmere i ikke-småcellet lungekreft, denne studien vurdert tre NSCLC cellelinjer (A549, SK-MES-1, og NCI-H460) behandlet med PF-4708671, og evaluert endringer av ondartet fenotyper som spredning, invasjon og apoptose unndragelser.
som vist ovenfor, p70S6K inhibitor PF-4708671 hemmet signifikant aktivering av p70S6K og styrings nedstrøms effektor S6, i en konsentrasjonsavhengig måte. Videre er protein nivåer av nedstrøms BAD; Caspase3 og ERK, som påvirker apoptose evnen til cellene, ble øket etter behandling med PF-4708671. Dette viste at PF-4708671 kan påvirke NSCLC cellelinjer «overlevelse ved å regulere relevante faktorer av apoptose. I tillegg var NSCLC celleproliferasjon tid og konsentrasjon avhengig inhibert av PF-4708671, som bekrefter tidligere rapporter [15-17]. Således foreslo vi at p70S6K regulering er forbundet med celle apoptose. Forskjellene i minimum effektive medikamentkonsentrasjoner for NSCLC cellelinjer som vurderes kan være på grunn av deres forskjellige p70S6K nivåer og vekstrater: vi fant veksthemming på 30 til 40%
Vi antok at ved å regulere cellesyklus. , PF-4708671 kan hemme celleproliferasjonen. Nyere studier viser at S6K1 og p70S6K er avgjørende for G1 arrest [26-28]. Konsekvent, fant vi at PF-4708671 påvirket cellesyklus distribusjon i de tre NSCLC cellelinjer som vurderes, vesentlig forsinke cellecyklusprogresjonen i G0 /G1 fase. En annen viktig faktor som påvirker celleproliferasjon er apoptose; en fase I-studie av LY2584702 vurdere avanserte solide tumorer pasienter viste ingen utilslørt anti-tumor effekt av dette stoffet [25]. Som vist ovenfor, PF-4708671 hatt begrenset effekt på celle apoptose i NSCLC-celler, med en apoptose hastighet i nærheten av 3% in vitro. Derfor antok vi at p70S6K trasé ikke kan være involvert i celle apoptose. Men denne studien viste også at PF-4708671 hemmer NSCLC tumorigenesis
in vivo
.
p70S6K overekspresjon ble vist å være assosiert med aggressiv sykdom og dårlig prognose ved brystkreft [29]. Vår tidligere studie viste p70S6K overekspresjon fremmer celle invasjon
in vitro
. Interessant, PF-4708671 kunne hemme invasjon evnen til alle NSCLC-cellelinjer som vurderes i denne studien. I kontrast til studier i NSCLC pasienter viste at p-p70S6K uttrykk ikke er assosiert med lymfeknutemetastase og kreft stadium [18-29]. Videre studier er nødvendig for å bekrefte rollen p70S6K i NSCLC invasjon og metastase
in vivo
.
Men det hadde fortsatt noen begrensninger i vår forskning. For det første, selv om alle celler var NSCLC-cellelinjer, kildene var forskjellig. Så våre resultater kan ikke være helt konsekvent fordi det kan være ulike mekanismer mellom ulike genetiske bakgrunn. Videre antallet var ikke stor nok for eksperimenter av hårløse mus in vivo. Derfor resultatene trenger ytterligere grundige undersøkelser for å bekrefte.
I konklusjonen, vår studie viste at p70S6K inhibitor PF-4708671 kan påvirke cellesyklus distribusjon, hemmer celledeling, apoptose og invasjonen i NSCLC celler. Hemme p70S6K-S6 aksen resulterte i potent antitumoraktivitet. Derfor kombinasjonsbehandling med p70S6K hemmer og kjemoterapi representerer en lovende ny strategi for NSCLC behandling.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Protein uttrykk nivåer av BAD, Caspase3 og ERK etter behandling med PF-4708671
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Tumor volumvekst trend i hver gruppe av nakne mus (mm
3)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. Sammenligning av tumorstørrelser blant grupper
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s003 plakater (TIF)
S1 fil. Tabell A. Tumorvolum veksten til hver gruppe i nakne mus (n = 3 /mm
3). Tabell B. tumorxenotransplantater vekt i hver gruppe ()
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s004 plakater (docx)
Takk
Takk til professor Mo XM gitt oss en god laboratoriemiljø og utstyr.
