Abstract
Nuclear faktor (NF) -κB signalering er nødvendig for lunge adenokarsinom utvikling hos mus, og begge dens subenheter
Rel
A og
Rel
B ble uavhengig rapportert å være sterkt uttrykt i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Omfattende undersøke NF-kB uttrykk i NSCLC, analyserte vi seriesnitt av primærtumorprøver fra 77 veldokumenterte pasienter (36 adenokarsinomer, 40 plateepitelkarsinom og 3 store cellekreft) for immunoreaktivitets av
Rel, En,
Rel
B, P50 og P52 /P100. Tumor og intratumoral stroma områder ble diskriminert på grunnlag av prolifererende cell nuclear antigen immunoreaktivitets og inflammatorisk infiltrasjon ble vurdert i intratumorale stroma områder. NF-kB-immunoreaktivitet ble kvantifisert ved intensitet, omfang, og nukleære lokaliserings og var kryss-undersøkt med tumorcelleproliferasjon, inflammatorisk infiltrasjon, og klinisk-patologiske data. Vi fant at uttrykket av ulike NF-kB subenheter var ikke konkordant, warranting vår integrert tilnærming. Overall,
Rel, En,
Rel
B, og P50 ble uttrykt på et høyere nivå sammenlignet med P52 /P100. Men
Rel, En og P50 ble hovedsakelig uttrykt i intratumoral stroma, men
Rel
B i tumorceller. Viktigere, ble tumorområdet
Rel, En uttrykk korrelert med intensiteten av inflammatorisk infiltrasjon, mens
Rel
B-ekspresjon ble påvist i prolifererende tumorceller. Ved hjelp av multippel logistisk regresjon, identifiserte vi at svulsten
Rel
B uttrykk var en uavhengig prediktor for lymfeknutemetastase, og tumor P50 var en uavhengig prediktor for TNM6 stadium IIB eller høyere, mens tumor
Rel
en var en uavhengig prediktor for inflammatorisk infiltrasjon. Vi konkluderer med at patologiske studier av NF-kB uttrykk i kreft bør inneholde flere sti komponenter. Utnytte en slik tilnærming, identifiserte vi spennende assosiasjoner mellom forskjellige NF-kB underenheter og kliniske og patologiske trekk ved NSCLC
Citation. Giopanou jeg, Lilis jeg, Papaleonidopoulos V, Marazioti A, Spella M, Vreka M, et al. (2015) Omfattende Evaluering av Nuclear Factor-κΒ uttrykk mønstre i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (7): e0132527. doi: 10,1371 /journal.pone.0132527
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 03.03.2015; Godkjent: 15 juni 2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Giopanou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et europeisk forskningsråd 2010 Starting Independent Investigator Grant (tilskudd nummer # 260524 til GTS; https://erc.europa.eu/KRAS-mutasjon-interaksjoner-host-immunitet-malign-pleural-effusjon). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest vanlige humane kreftformer og den ledende kreft spekkverdensom [1]. Lungekreft består av to hoved histologiske typer, liten celle lungekarsinom og ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), med sistnevnte sto for mer enn 80% av nye tilfeller [2]. NSCLC representerer en histologisk mangfoldig gruppe av svulster som er underklassifiseres i adenokarsinomer, plateepitelkarsinom og store cellekreft, sto for 40, 30, og 10% av nye NSCLC tilfeller, henholdsvis [2]. Adenocarcinoma er den dominerende NSCLC subtype med økende forekomsten [3].
pattedyr nukleær faktor (NF) -κB veien består i hovedsak av
Rel
A, c-
Rel
,
Rel
B, NF-κB1 (P105 /P50) og NF-κB2 (P100 /P52) [4]. Disse allestedsnærværende proteiner danner homo- eller heterodimerer som bor i cytoplasma i en inaktiv form, bundet til hemmende proteiner som kalles hemmere av NF-kB (ΙκΒ). Ved stimulering, IkB gjennomgå fosforylering av flere IkB kinaser (IKK, a, β, γ, ε, og andre), samt ubiquitinering og proteolytisk nedbrytning av proteasomet og andre proteaser, for å frigjøre aktive NF-kB-underenheter for nukleær translokasjon og aktivering av target gentranskripsjon [5, 6]. Det er to hoved NF-kB aktivering pathways, den kanoniske (eller klassisk) og ikke-kanoniske (eller alternative), som er mediert av
Rel
A /P50 eller c-
Rel Twitter /P50 og
Rel
B /P52 dimers henholdsvis [4-7]. I den senere tid ble ytterligere mekanismer for NF-kB-aktivering offentliggjort, inkludert, men ikke begrenset til, induserbart behandling av P100 til P52 regulert av IKKα homodimerer, noe som ytterligere øker kompleksiteten i systemet [8]. Kanonisk og /eller alternative NF-kB-aktivering oppstår etter cellulær stimulering med cytokiner, bakterier eller virus, endotoksiner, oksidativt stress, bestråling, etc, og kan føre til celle-differensiering, proliferasjon, hemming av apoptose, og /eller inflammatorisk signale [9] .
NF-kB aktivering er blitt identifisert i flere kreft hos mennesker, inkludert men ikke begrenset til lymfom, kolorektal tumorer, esophageal og hode og nakke kreft, brystkreft svulster, leverkreft, og prostatakreft [10-16] . Men studier har fokusert nesten utelukkende på den kanoniske NF-kB vei, mens rollen som alternativ NF-kB signalisering i tumorvekst og progresjon er fortsatt uklar [17-19]. I human NSCLC, øker atom
Rel, En immunreaktivitet er blitt beskrevet med progressiv sykdom [20]. Canonical NF-kB signale har også vist seg å være avgjørende for lungetumordannelse i musemodeller av NSCLC indusert av onkogene
KRAS
G12D Hotell og /eller tap av tumordempere
Trp53 Hotell og
Gprc5a
, sigarettrøyk eksponering, og tobakkskreftfremkallende uretan [21-25]. Men andre studier tyder på at konstituerende og svulstens mikro-indusert NF-kB aktivering i NSCLC er mer kompleks og hviler på mer enn én vei [26-28].
Her setter vi ut for å teste dette ved hjelp av omfattende analyser av flere NF-kB subenhet ekspresjon av 77 veldokumenterte pasienter med NSCLC. For dette formålet, utviklet vi en semi-kvantitativ NF-kB subenheten scoring system som tar hensyn til både uttrykk nivåer samt kjernefysiske lokalisering. Vi konsekvent identifisert forskjellige NF-kB subenhet uttrykk mønstre i tumorceller kontra intratumoral stroma og funnet interessante sammenhenger mellom disse mønstrene og klinisk-patologiske trekk ved menneskelig NSCLC. Endelig rekapitulert vi noen av disse funnene i to forskjellige musemodeller av NSCLC, noe som indikerer at avvikende NF-kB aktivering mønstre er faktisk på spill i NSCLC og kan ha ulike funksjoner.
Materialer og metoder
pasienter
Seventy seven arkivformalinfikserte, parafininnstøpte diagnostiske vevsprøver av pasienter med NSCLC som gjennomgikk kirurgisk reseksjon med kurativ hensikt mellom 2001 og 2008 ved University Hospital of Patras ble retrospektivt inkludert i studien. Noen av disse pasientene hadde også blitt studert i en tidligere rapport fra vår institusjon [28]. Pasienter, alt kaukasisk, 69 menn og 8 kvinner i alderen fra 46 til 84 år, ble nøye utvalgt basert på tilgjengeligheten av full kliniske og patologiske data hentet fra de primære patologi rapporter og pasientenes filer, inkludert alder, kjønn, histologisk type karakter og detaljert patologisk stadium. Pasienter utvalgte inkluderte 34 pasienter med lunge adenokarsinomer, 40 med plateepitelkarsinom, og tre med store karsinomer. Alle pasientene ble iscenesatt i henhold til den sjette utgaven av TNM klassifikasjon for NSCLC, gjeldende på tidspunktet for sin diagnose [29]. Studiens observasjonsprotokollen ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen, ble godkjent av etikkomiteen ved University Hospital of Patras, Hellas, og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke.
Mus
Eksperimenter ble godkjent a priori ved Veterinær Administration of Western Hellas (Protocol Antall: 276134/14873/2) og ble gjennomført i henhold til direktiv 2010/63 /EU (https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do ? uri = OJ: L: 2010: 276: 0033: 0079: EN: PDF). For mutant KRAS-drevet lunge tumorigenesis,
C57BL Twitter /6 mus heterozygote for loxP-STOP-loxP.
KRAS
G12D transgenet ble brukt, som uttrykker mutant KRAS i noen somatisk celle upon CRE-mediert rekombinasjon (heretter kalt
LSK
mus, Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) [22]. For lunge svulst induksjon,
LSK
mus fikk rekombinant adenovirus vektorer som koder CRE recombinase (Admin
Cre
, Baylor College of Medicine, Cell og Gene Therapy Center, Vector Development Lab, Houston, Texas) intratrakealt (5×10
8 plaque-dannende enheter i 50 ul fosfat-bufret saltvann) og ble avlivet etter fire måneder [30]. For kjemisk indusert lunge tumorgenese,
FVB
mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) som mottas tobakken carcinogen uretan intraperitonealt (1 g /kg i 100 ul fosfatbufret saltvann), og ble avlivet etter 6 måneder [21 , 31]. Muse lungene ble tappet for blod med 20 ml intrakardiell saltvann infusjon, ble fylt med 10% nøytral-bufret formalin ved hjelp av 20 CMH
2o press, ble fiksert i% nøytral-bufret formalin, og ble i parafin.
immunhistokjemi
Menneske og mus vevsblokker ble kuttet i 4 mikrometer tykke seksjoner, som senere ble deparaffinised av etanol gradient, rehydrert, og kokt i varme-indusert epitop antigen gjenfinning løsning (0,1 M natriumsitrat, pH = 6,0 ). Endogen peroksidase-aktivitet ble inhibert ved anvendelse av 3% H
2o
2 og ikke-spesifikke antistoff-proteinbinding ble forhindret ved anvendelse av 3% bovin-serum-albumin-inneholdende Tris-bufret saltvann. De følgende primære antistoffer og fortynninger ble anvendt over natten ved 4 ° C: anti-P50 (sc-114 kanin polyklonal IgG, 1/150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti P100 /P52 (ab31409 kanin polyklonalt IgG; 1 /150; Abcam, Cambridge, UK), anti-
Rel, En (sc-8008 monoklonalt IgG, 1/200, Santa Cruz), anti-
Rel
B (sc-226 kanin polyklonal IgG, 1/400, Santa Cruz), og anti-prolifererende cell nuclear antigen (PCNA; ab2426 kanin polyklonal IgG, 1/2000, Abcam). Påvisning av primære antistoffer ble utført ved anvendelse av et pepperrot-peroksydase-konjugert polymer i henhold til produsentens instruksjoner (EnVision; Dako, Glostrup, Danmark) og diaminobenzidin som det kromogene substrat. Seksjoner ble kontra med Harris hematoxylin, dehydrert, og deretter montert. For isotype kontroller, ble det primære antistoff utelatt. Normal tonsil vev ble anvendt som positiv kontroll. Alle antistoffer ble validert for immunhistokjemi å bruke serielle fortynninger med start fra 1/100 (bortsett fra PCNA hvor fortynninger startet på 1/1000) og forskjellige bovint serumalbumin konsentrasjoner i Tris-bufret saltvann følgende eller modifisering av produsentens instruksjoner for å maksimalisere signal til bakgrunnsforhold. Immunoreaktivitets ble scoret av tre blindet i sakens etterforskere (i.g., H.P., og G.T.S.) inkludert en Hellenic bord-sertifisert patologen (H.P.) og konsensus ble søkt i tvetydige saker av co-observasjon. PCNA immunoreaktivitet ble definert som prosentandelen av positive celler i tumorområder og ble brukt til å diskriminere disse (høy prosentandel av immunreaktive celler) fra intra-tumoral stromaceller områder (lav prosentandel av immunreaktive celler). Seksjoner ble talt ved høy effekt (X400), og 5-8 felt ble vurdert tilfeldig for kreftceller og for intratumorale stroma områder, henholdsvis. Ett tusen cellekjerner ble talt henholdsvis, og antallet celler som viser positiv nukleær farging ble registrert. NF-κΒ subenheten immunoreaktivitet ble gitt poeng som følger: intensitet (0: negativ; 1: svak; 2: moderat, og 3: sterk), utstrekning (0: 10% av cellene positive, 1: 10-35% av cellene positive, 2: 35-70% av cellene positive, og 3: 70% av cellene positive) og fordeling (0: negativ; 1: cytoplasma-kun, 2: cytoplasmiske og kjernefysiske, og 3: atom only) av immunreaktiviteten ble bedømt separat for hver NF-κΒ subenheten for prøven samlet, samt separat for tumorceller og intratumoral stroma av hver tumor, og ble slått sammen til underenhet-spesifikke samlet, tumor, og stromaceller score med formelen: NF-κΒ subenheten poeng = (intensitet + grad) * distribusjon. NF-κΒ subenheten score ble videre kategorisert i lav (0-4), middels (5-6), og høy (7-18). Inflammatoriske infiltrater ble bestemt semikvantitativt ved hjelp av PCNA-farget og isotype kontrollprøver og er definert som lav (mindre enn 5%), moderat (5-20%), og høy (mer enn 20%), avhengig av prosentandelen av leukocytter i intratumorale stroma områder. Sistnevnte ble identifisert ved morfologi og mangel på immunoreaktivitet for PCNA. Bilder ble tatt ved hjelp av en oppreist Axio Lab.A1 mikroskop koblet til en AxioCam ERC 5s kamera (Zeiss, Jena, Tyskland). For immunfluorescens, ble vevssnitt inkubert samtidig med anti-PCNA (enten ab2426 kaninpolyklonalt IgG, 1/100 fortynning, Abcam for collocalization med
Rel
A eller sc-56 mus monoklonalt IgG, 1/100 fortynning, i Santa Cruz for collocalization med
Rel
B) og enten anti-
Rel, En (sc-8008 monoklonalt IgG, 1/100 fortynning, Santa Cruz) eller anti-
Rel
B (sc-226 kanin polyklonal IgG, 1/100 fortynning, Santa Cruz) antistoffer som ovenfor, etterfulgt ved kjernekontra med Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR). Påvisning av primære antistoffer ble utført ved hjelp av esel anti-kanin Alexa568-konjugert (A10042, 1/500 fortynning, Invitrogen, Carlsbad, California) og esel anti-mus Alexa488 konjugert (A21202, 1/500 fortynning, Invitrogen, Carlsbad, California) sekundære antistoffer. For isotype kontroller, enten eller begge primære antistoffer ble utelatt. Immunoreaktivitets ble fanget på en Zeiss Axio Observer.D1 invertert mikroskop koblet til en AxioCam MRc 5 kamera (Zeiss, Jena, Tyskland) og var co-registrert bruker Fiji akademisk bilde freeware (https://fiji.sc/Fiji).
statistikker
Sannsynlighet verdier (
P
) mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Menneske NF-κΒ subenheten score var normalt ikke distribueres, som testet av Kolmogorov-Smirnov test (
P
0,05), og er vist i søylediagrammer som median med bokser som indikerer indre kvartilområdet og værhår indikerer 95% persentiler. Matchet numeriske NF-κΒ subenheten score av de samme svulster ble sammenliknet med Friedman tester etterfulgt av Dunns post-tester. Kategoriske NF-κΒ subenheten score ble sammenliknet med χ
2 tester etterfulgt av Fishers eksakte tester. Korrelasjoner mellom numeriske NF-κΒ subenhet score og klinisk-patologiske data ble gjort ved hjelp av Spearman tester, hvorved den totale terskel for statistisk signifikans (
P
0,05) ble justert til det totale antall korrelasjoner undersøkt (n = 153) av Bonferroni metoden for å
P
0,05 /153 = 0,000327. Sammenligninger av numeriske NF-κΒ subenheten poeng ved inflammatorisk infiltrasjon grad og klinisk-patologiske kategorier ble gjort ved hjelp av Wilcoxon signert rang tester eller Kruskal-Wallis tester etterfulgt av Dunns post-tester, for to eller flere sammenligningsgruppene. For å avgjøre om tall NF-κΒ subenheten score uavhengig forutsi klinisk-patologisk variabler, sistnevnte ble dikotomisert ved deres median og binære logistisk regresjon ble utført ved bruk av bakover Waldman metoden. For dette ble NF-κΒ subenheten score brukt som input (uavhengige variabler) og klinisk-patologiske variabler og inflammatoriske infiltrasjons score som output (avhengige variabler). Mouse NF-κΒ subenheten score på progressive stadier av kreftutvikling er presentert som gjennomsnitt ± SD og ble sammenlignet med to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-tester. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism v5.0.0 (GraphPad, San Diego, California) og Statistisk Package for Social Sciences v20 (IBM SPSS Statistics, Chicago, IL, USA).
Resultater
NF-κΒ subenhet uttrykk mønstre i NSCLC
de kliniske og patologiske trekk ved studien pasienter er oppsummert i tabell 1. rå studieresultatene er vedlagt denne artikkelen som S1 Table. Vi først undersøkt NF-κΒ subenhet uttrykk i normale lunge områder som grenser til våre kirurgisk resected tumorprøver. I bronkial og alveolær epitel,
Rel, En, P50 og P100 /P52 utstilt lav eller moderat cytoplasma immunoreaktivitets, mens
Rel fra B vist høyere uttrykk nivåer. I juxta-tumor bronkial og alveolære hyperplasias, immunoreaktivitets for alle NF-kB subenheter viste en sterkere uttrykk mønster, med
Rel
B viser både cytoplasma og kjernefysiske lokalisering. I svulster, ble alle NF-kB subenheter sterkt uttrykt i forhold til normale og hyperplastiske områder, med
Rel
B oppnå høyest og viser den høyeste grad av kjernefysiske lokalisering. Men
Rel, En,
Rel
B, og P50 immunoreaktivitets ble sterkere sammenlignet med P100 /P52 (Fig 1A og 1B). Når NF-kB subenheten score ble delt inn i lav (0-4), middels (5-6), eller høy (7-18), ingen sammenheng var tydelig mellom de ulike subenheter (fig 1c). Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert mellom de ulike NSCLC histologiske subtyper. Imidlertid ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller i NF-kB subenhet uttrykk nivåer innenfor hver svulst: tumor områder vises ulike uttrykk mønstre sammenlignet med intratumorale stroma områder (Fig 1A, representative paneler i rød ramme). Disse resultatene antydet at flere NF-κΒ subenheter er gradvis overuttrykt i NSCLC, viste at ikke alle NF-κΒ subenheter er uttrykt like, og identifisert en disharmoni i uttrykket av flere NF-κΒ underenheter mellom svulsten og intratumorale stromal områder, berettiger videre undersøkelser .
(A) Representative bilder. Bilder i røde rammer representativt vise differensial NF-kB subenhet uttrykk i svulsten og intratumorale stroma områder. (B) Totalt scoring av NF-kB subenhet uttrykk nivåer. Data presentert som median med bokser som indikerer indre kvartilområdet og værhår indikerer 95% persentiler. ns, * og ***: P 0,05, P 0,05 og P 0,001 for angitte sammenligninger av Friedmans test etterfulgt av Dunns post-tester. (C) Co-uttrykk matriser av kategoriske NF-kB subenhet uttrykk nivåer. For dette ble NF-kB score fra (B) kategoriseres i lav (0-4), middels (5-6), og høy (7-18). ns: P 0,05 av χ
2 tester etterfulgt av Fishers eksakte tester.
Differensial NF-κΒ uttrykk i tumor og stromale avdelinger av NSCLC
For å studere dette nærmere , alle prøver ble farget for PCNA, som tydelig identifisert kreftområder (høy overflod av PCNA + celler) fra intratumoral stroma rommet (veldig lav overflod av PCNA + celler), og NF-kB subenheten scoring ble gjentatt separat for disse to områdene i seriesnitt av alle pasienter (figur 2A). Disse analysene viste at
Rel
B var subenheten uttrykt sterkest i områder av tumorceller viser en både kjernekraft og cytoplasmatiske uttrykk mønster. På den annen side, de gjenværende subenhetene undersøkt viste bare moderat cytoplasmisk ekspresjon i tumorområder (figur 2A og 2B). Når tumor rommet NF-kB subenheten score ble delt inn i lav (0-4), middels (5-6), eller høy (7-18), og sammenlignet innenfor hver svulst,
Rel
B og P50 viste signifikant disharmoni, med svulster med sterk
Rel
B immunoreaktivitets stiller lave P50 score (figur 2C). Overraskende, evaluering utelukkende av intratumoral stroma gitt forskjellige resultater: her,
Rel
A og P50 subenheter ble mest overveiende uttrykt i kjernen av stromale celler. I sterk kontrast,
Rel
B og P100 /P52 viste bare svak cytoplasma immunoreaktivitets (Fig 2A og 2D). Når stroma NF-kB subenheten score ble delt inn i lav (0-4), middels (5-6), eller høy (7-18), og sammenlignet innenfor hver svulst,
Rel
B og P100 /P52 viste betydelig samsvar med 49/77 svulster viser samtidig lav score for begge subenheter, sannsynligvis gjenspeiler lave nivåer av både proteiner (fig 2E). Vi endelig undersøkt forholdet mellom numeriske og kategoriske tumor og stroma score for hvert NF-kB subenheten, finne at bare P100 /P52 uttrykk i tumor og tilhørende stroma var konkordant og korrelert (Fig 2F og 2G).
(A) Representative bilder. (B, D) Skårer for NF-kB-subenhet ekspresjonsnivåer i tumoren (B) og stromaceller (D) områder. Data presentert som median med bokser som indikerer indre kvartilområdet og værhår indikerer 95% persentiler. ns og ***: P 0,05 og P 0,001 for angitte sammenligninger av Friedmans test etterfulgt av Dunns post-tester. (C, E) Ko-ekspresjon matriser av kategoriske NF-kB-subenhet uttrykk nivåer i tumor (C) og stromaceller (E) områder. For dette ble NF-kB score fra (B) og (D) kategoriseres i lav (0-4), middels (5-6), og høy (7-18). ns: P 0,05 og P: sannsynlighetsverdier ved χ
2 tester etterfulgt av Fishers eksakte tester. (F) Co-uttrykk matriser av tumor mot stroma NF-kB subenhet uttrykk. ns: P 0,05 og P: sannsynlighetsverdier ved χ
2 tester etterfulgt av Fishers eksakte tester. (G) Korrelasjonen av tumor og stroma P100 /P52 uttrykk score. Vist er datapunkter, lineære regresjonslinjen med 95% konfidensintervall, squared Spearmans korrelasjonskoeffisient, og sannsynlighetsverdi.
Korrelasjonen av Rel subenhet uttrykk med celledeling og inflammatorisk infiltrasjon
Siden NF-kB er mekanistisk implisert i proliferasjonen og inflammatoriske signalisering av lungetumorceller i musemodeller [21-24], søkte vi å bestemme graden av cellulær proliferasjon og inflammatorisk infiltrasjon i våre 77 pasienter med NSCLC. For dette ble seriesnitt kastet PCNA immunofarging som ovenfor, med samtidig hematoksylin farging av isotype kontroll-seksjoner, og prosentandelen av PCNA-positive celler i tumor områder ble vurdert som et mål på celleproliferasjon hastighet. I tillegg, ble prosentandelen av tumor-infiltrerende PCNA-negative inflammatoriske celler i stroma områder bestemt for hver pasient (figur 3A). Disse analysene identifiserte at selv uttrykk nivåer av
Rel
A i tumor områder var ganske lav, de ble økt i svulster med høye nivåer av inflammatorisk infiltrasjon (figur 3B). Dessuten, selv om prosentandelen av PCNA-positive celler var ikke forskjellig mellom de forskjellige histologiske subtyper (figur 3C), og er ikke forbundet med ekspresjon av hvilken som helst NF-kB-subenhet (data ikke vist), dobbel immunofluorescens for
Rel
A eller
Rel fra B kombinert med PCNA avslørte at PCNA + prolifererende celler hovedsakelig uttrykt
Rel
B i sin kjerne (figur 3D). Disse data indikerte at svulsten
Rel, En uttrykk var assosiert med inflammatorisk infiltrasjon og at svulsten
Rel
B uttrykket ble koblet med mobilnettet spredning innenfor hver svulst. Siden
Rel
B uttrykket har blitt funnet å være regulert av både den kanoniske samt alternative NF-kB trasé, vi neste søkt å undersøke en mulig sammenheng mellom
Rel, En uttrykk i tumor eller stroma avdelinger, og
Rel
B uttrykk i tumorceller. Men ingen statistisk signifikant korrelasjon ble funnet når dataene ble vurdert enten i en parametrisk eller en ikke-parametrisk mote, noe som tyder på at tumor
Rel
A og
Rel
B uttrykk oppstår uavhengig i NSCLC.
(A) Representative bilder av Hematoxylin-farget prøvene som viser ulike grader av inflammatorisk infiltrasjon av stroma områder. (B) NF-kB subenhet uttrykk score av svulster med varierende grad av inflammatorisk infiltrasjon. Data presentert som median med bokser som indikerer indre kvartilområdet og værhår indikerer 95% persentiler. ns, ** og ***: P 0,05, P 0,01 og P 0,001 for angitte sammenligninger av Kruskal-Wallis tester etterfulgt av Dunns post-tester. (C) Representative bilder av PCNA-farget NSCLC subtype prøver. (D) Nuclear samlokalisering av PCNA immunoreaktivitets med
Rel
B (piler), men ikke med
Rel
A, ble identifisert ved hjelp av dual farging av prøver av 10 pasienter (representative bilder vist) .
Association of NF-κΒ subenhet uttrykk med kliniske og patologiske trekk ved NSCLC
Vi neste undersøkt om NF-kB subenhet uttrykk i tumor og stroma avdelinger er korrelert med klinisk og patologisk funksjonene til våre pasienter med NSCLC. For dette analyser korrelasjon ble gjort, noe som viste ingen signifikant sammenheng (data ikke vist). NF-kB score ble videre inndelt i henhold til kliniske og patologiske funksjoner og undergrupper ble sammenlignet (Fig 4A). Stroma score på P100 /P52 var betydelig lavere i godt differensierte svulster, sammenlignet med lav eller moderat differensierte seg. I tillegg ble stromal P100 /P52 ekspresjon redusert hos pasienter med N2 sykdom, sammenlignet med pasienter uten lymfatisk involvering. Ingen andre signifikante forskjeller ble funnet med hensyn til intratumoral stromal ekspresjon av hvilken som helst annen subenhet. Når svulst området NF-kB score ble undersøkt på denne måten,
Rel
A ble funnet å være uttrykt på et høyere nivå hos menn sammenlignet med kvinner, hos pasienter i alderen 65 år og over sammenlignet med yngre, og hos pasienter med plateepitel cellekreft sammenlignet med adenokarsinom. Viktigere, ble kreft P50 score forhøyet hos pasienter med N2 og pTNM6 stadium III sykdom sammenlignet med pasienter uten lymfatisk engasjement og stadium II sykdom, henholdsvis. Til slutt, tumor P100 /P52 uttrykk ble statistisk signifikant forhøyet hos pasienter med pTNM6 stadium II sykdom sammenlignet med pasienter med stadium I sykdom. I et tredje nivå av undersøkelser, ble kliniske og patologiske NSCLC funksjoner dikotomisert ved deres median og ble ført opp som pårørende i binær logistisk regresjonsanalyser, ved hjelp av tumor og stromal NF-kB score som inngangs (uavhengige) variabler (fig 4B). Disse analysene viste at svulsten
Rel, En poengsum var en uavhengig prediktor for 65 år eller eldre, av plateepitel histologi, og av inflammatorisk infiltrasjon. Interessant, tumor og stroma
Rel
B uttrykket ble identifisert som positive og negative prediktorer for lymfeknuteaffeksjon, henholdsvis. Til slutt ble tumor P50 stillingen funnet å være en uavhengig prediktor for dårlig differensiering og pTNM6 stadium IIB eller høyere. Derfor tydelig NF-kB subenhet (
Rel
B og P50, men ikke
Rel
A) uttrykk var forbundet med avansert sykdom, og distinkte NF-kB subenheter ble koblet med definerte funksjoner i NSCLC, validere vår integrerte tilnærming.
(A) NF-kB uttrykk nivåer inndelt etter kliniske og patologiske parametere. Data presentert som median med bokser som indikerer indre kvartilområdet og værhår indikerer 95% persentiler. ns, * og **: P 0,05, P 0,05 og P 0,0501 for angitte sammenligninger av Wilcoxon signert rang tester eller Kruskal-Wallis tester etterfulgt av Dunns post-tester, for to eller flere sammenligningsgruppene. (B) Resultater av binær logistisk regresjonsanalyse ved hjelp av NF-kB subenhet uttrykk poenger som input (uavhengige variabler) og dikotomert kliniske og patologiske parametre som utgangs (avhengige variabler). RR, risikoforhold; CI, konfidensintervall; P, sannsynlighetsverdier.
NF-κΒ subenhet uttrykk i musemodeller av NSCLC
Vi har endelig søkt å verifisere om våre funn kan også bli rekapitulert i to forskjellige musemodeller av human NSCLC , nemlig modellen av uretan-indusert lunge adenom og mutant
KRAS
indusert lunge adenokarsinom. Analyser, gjort som for humane prøver, identifisert som
Rel
B ble overexpressed i uretan-indusert hyperplastic lesjoner, men ikke i adenomer. Videre
Rel fra B ble overexpressed i både mutant
KRAS
indusert hyperplastic lesjoner og adenokarsinomer (fig 5). Disse funnene var i samsvar med de humane data som viser fokal overekspresjon av
Rel
B i tumorområder av human NSCLC (figur 2).
NF-kB-subenhet-ekspresjon ble bestemt ved immunhistokjemi i uretan-indusert muse lungeadenomer (A og C) og mutant
KRAS
indusert lunge adenokarsinomer (B og D). (A, B) Representative bilder. (C, D) Samlet scoring av NF-kB subenhet uttrykk nivåer fra fire mus per gruppe. Data presentert som gjennomsnitt ± SD. ** Og ***: P 0,01 og P 0.001 for den angitte fargekodet underenhet sammenlignet med normal bronkial og alveolær epitel ved to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-tester. Ikke-signifikante sammenligninger er ikke angitt.
Diskusjoner
I denne studien har vi preget uttrykket og subcellulære lokalisering av flere NF-kB underenheter i menneskets NSCLC og eksperimentelle modeller av sykdommen. Vi har funnet ulike mønstre av immunoreaktiviteten for hver av underenhetene studert, rettferdiggjøre vår integrerte tilnærming. I spesielle,
Rel
B ble sterkt uttrykt i tumorceller, mens
Rel
A og P50 i stromale celler. Interessant, tumor
Rel, En uttrykk ble korrelert med inflammatorisk infiltrasjon og tumor
Rel
B uttrykket ble collocalized med voksende tumor cellekjerner. Disse resultatene var konsistente med binær logistisk regresjon analyser som viste at svulsten
Rel, En uttrykk var en uavhengig prediktor for inflammatoriske infiltrater, mens tumor
Rel
B immunoreaktivitets spådd mer avansert sykdom med lymfeknuteaffeksjon. Til slutt, dette mønsteret av fremherskende
Rel
B-ekspresjon i humane NSCLC ble rekapitulert i musemodeller av sykdommen. Samlet våre resultater viser en multi-modal aktivering av NF-kB i NSCLC og muligens foreslå avvikende funksjoner for
Rel
A og
Rel
B i kjøre parakrint induksjon av inflammasjon og celle-autonome eller autokrint fremme celleproliferasjon, henholdsvis (figur 6).
NF-kB subenhet uttrykk nivåer i kreft og stromaceller av 77 pasienter med NSCLC er angitt med relativ skriftstørrelse.
