Abstract
Bakgrunn
transkripsjonsfaktor Pax6 er først og fremst uttrykt i embryoer . Pax6 uttrykkes også i flere svulster og spiller en onkogen rolle. Men lite er kjent om rollen Pax6 i lungekreft.
Metoder
Funksjonen Pax6 i lungekreftceller ble evaluert av små interfererende RNA-mediert nedbrytning av protein fulgt av analyser av celleproliferasjon, forankrings-uavhengig vekst, og cellesyklus-stans. Endringene av cyclin D1, pRB, ERK1 /2, p38 uttrykk forårsaket av Pax6 hemming ble oppdaget ved hjelp av western-blotting. Den Pax6 mRNA nivå i 52 par av svulster og tilsvarende matchet tilstøtende normalt vev fra ikke-småcellet lungekreft pasienter og lungekreftcellelinjer ble oppdaget av real-time PCR.
Resultater
Suppression av Pax6 uttrykket hemmet cellevekst og kolonidannelse i A549 og H1299 celler. Prosentandelen av celler i G1-fase øker når Pax6 ekspresjon ble hemmet. Cyklin D1 proteinnivå, samt pRB fosforylering nivå, reduseres som et resultat av Pax6 nedregulering. Aktiviteten av ERK1 /2 og p38 ble også undertrykket i Pax6 knock-down-celler. Den Pax6 mRNA ble sterkt uttrykt i lungekreft vev og lunge kreft cellelinjer. Hos de fleste pasientene (ca 65%), den relative forholdet mellom Pax6 mRNA i primær NSCLC versus tilstøtende vev skredet 100.
Konklusjoner
Våre data impliserte at Pax6 akselererer cellesyklusprogresjon ved å aktivere MAPK signal sti. Pax6 mRNA nivåer ble signifikant forhøyet i primær lungekreft vev sammenlignet med sine matcher tilstøtende vev
Citation. Zhao X, Yue W, Zhang L, Ma L, Jia W, Qian Z, et al. (2014) nedregulering av Pax6 av shRNA hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen of Human Ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (1): e85738. doi: 10,1371 /journal.pone.0085738
Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 01.12.2013; Publisert: 15 januar 2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Beijing Novel Program bevilgning (nr 2006B34); Beijing Research Foundation for gode talenter (nr 20061D03); Beijing Dyrking Project for Key Teknisk og medisin Produkt (No. Z101100055610030); vitenskapelig forskning Common Program av Beijing Municipal Commission of Education (No. KM201210025024). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En fersk oversikt på globale kreft statistikk viste at lungekreft var den vanligste diagnosen kreft, samt den ledende årsak til kreft dødsfall [1]. Tidlig oppdagelse og målrettet terapi er en potensiell metode for lungekreft forebygging og behandling [2]. Det er viktig å finne hvilken trasé eller proteiner er aktive i lungetumorprogresjon [3]. På grunnlag av «kreft stamcelle-hypotesen» svulster antas å stamme gjennom vev-spesifikk ekspresjon stamcelle [4] – [6]; Med andre ord, blir tumorer tilskrevet stamcellefaktor overekspresjon [3], [5], [7]. Sammenkoblet-box 6 (Pax6) er en viktig transkripsjonsfaktor under embryogenese og stamcellefaktor [3]. Derfor kan Pax6 spille en viktig rolle i tumorgenese.
Pax6 representerer PAX genfamilien, som koder for en gruppe på ni parede boks-transkripsjonsfaktorer med viktige roller i utvikling og sykdom [3]. Pax6 er en viktig transkripsjonsfaktor i utviklingen av øyne, bukspyttkjertel, og sentralnervesystemet [3], [8]. Pax6 uttrykket ble nylig funnet i tumorer, noe som tyder på en onkogen rolle [9]. Pax6 blir ofte uttrykt i retinoblastom, pankreatiske tumorer, og tarmsvulster [6], [10], [11]. Pax6 er også sterkt uttrykt i hjernen og brystkreft-cellelinjer [9]. I pankreas karsinom-cellelinjer, inhibering av Pax6 ekspresjon fører til en nedgang i cellevekst og overlevelse [12]. Pax6 er også en regulator av MET-tyrosin-kinase-reseptor-ekspresjon i pankreas karsinom-cellelinjer [12]. MET er en potensiell biomarkør og terapeutisk mål for svulster, som bekrefter onkogene rolle Pax6 i tumorigenesis [13].
Det var tidligere rapportert at PAX8 og PAX5 er høyt uttrykt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC ) og småcellet lungecancer-cellelinjer, henholdsvis [14]; men lite er kjent om Pax6 uttrykk og funksjon i lungekreft. I denne studien undersøkte vi om Pax6 regulert celle spredning av NSCLC. Våre funn viser at Pax6 fremmer G1-S progresjon ved aktivering av MAPK signalveien. Pax6 mRNA ble ofte uttrykt i kreftvevet lunge, sammenlignet med tilsvarende tilstøtende ikke-neoplastisk vev. Dette tyder på at Pax6 er en ny potensielt mål i lungekreft.
Materialer og metoder
RPMI 1640, ble føtalt bovint serum (FBS), og Trizol Reagens kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California) ; M-MLV revers transkripsjon, CellTiter 96® vandig ikke-radioaktiv analyse celleproliferasjon, oligo-dT, og dNTP ble oppnådd fra Promega (Madison, WI); SYBR® Grønn PCR Master Blanding var fra Applied Biosystems (Carlsbad, California); anti-Pax6 antistoffer ble kjøpt fra Abnova (Taibei, Taiwan), anti-pRB, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, og -pRB (S780 fosforylering) antistoffer ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, England, UK); og forbedret kjemiluminescens (ECL) reagens ble hentet fra Pierce (Rockford, IL). Propidiumjodid (PI), RNase A, og proteasehemmer cocktail ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO).
Prøver
Femti-to NSCLC prøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon ved Beijing Chest Hospital. Primære lungekreft prøver og matchet, tilstøtende normalt vev ble benyttet.
Studiet og bruk av prøver ble gjennomgått og godkjent av forskningsetikk komiteen i Beijing Chest Hospital, Capital Medical University (Beijing, Kina). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. De kliniske kjennetegn ved pasientene er oppført i tabell 1.
Cell kultur
Menneskelig lunge adenokarsinom cellelinjer A549 og NCI-H1299, menneske store celle lunge kreft cellelinjer NCI-H460 , småcellet lungekreft cellelinje NCI-H446, menneskelig embryo lunge fibroblaster (MRC-5) ble hentet fra National Platform of Experimental Cell Resources Sci-Tech. Menneske store celle lunge kreft cellelinjer, 95C, ble 95D og 801D hentet fra svulsten sentrum av Chinese Academy of Medical Sciences. Menneskelig lunge adenokarsinom cellelinje A2 og plateepitelkarsinom cellelinje L ble isolert og etablert av vår lab. De lungekreft cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Los Angeles, CA, USA). MRC-5 ble opprettholdt i MEM-EBSS supplert med 10% FBS.
Bygging av en Pax6 shRNA lentiviral vektor og infeksjon i celler
Fire RNA interferens (RNAi) kandidat målsekvenser ble utformet basert på menneske
Pax6
mRNA sekvens og klonet inn i pGCSIL-GFP vektor (GeneChem, Shanghai, Kina). Den RNAi sekvens GAGTAGCGACTCCAGAAGT var den mest effektiv på å undertrykke Pax6 mRNA i H1299 og A549 celler, og ble brukt i senere eksperimenter for å slå ned endogen Pax6. Nonsilencing (NS) -små interfererende RNA (shRNA) (TTCTCCGAACGTGTCACGT) ble også klonet inn i pGCSIL-GFP vektor og anvendt som en kontroll (GeneChem). Det rekombinante virus ble pakket i 293T-celler ved anvendelse av en Lentivector Expression System (GeneChem).
For cellulært infeksjon ble H1299 og A549 cellene subdyrket ved 5000 celler /brønn i 96-brønners kulturplater og infisert med lentivirus-mediert Pax6-shRNA eller NS-shRNA. GFP uttrykk nivået ble oppdaget via fluorescens mikroskopi (Nikon, Tokyo, Japan) for å fastslå infeksjon effektivitet.
RNA isolering og real-time PCR
Total RNA fra vev og celler ble isolert med Trizol Reagens henhold til produsentens protokoll. Den totale RNA-konsentrasjonen ble beregnet ved å måle OD
260, og prøvene ble lagret ved -80 ° C.
Totalt RNA (2 pg) ble reverstranskribert ved hjelp av en M-MLV revers transkriptase Kit ifølge til produsentens protokoll. CDNA (20 ng) ble blandet med SYBR® Grønn Master Mix, og gener ble forsterket med egnede primere med en real-time PCR deteksjon system (ABI7500, Life Technologies, Carlsbad, California). De relative ekspresjonsnivåer av Pax6 mRNA ble beregnet ved normalisering til den β-aktin-mRNA-nivå. PCR-primere som ble anvendt var som følger: Pax6 fremover, 5′-TTCAGCACCAGTGTCTACCA-3 «; Pax6 omvendt, 5»-GCTGTAGGTGTTTGTGAGGG-3 «; β-aktin fremover, 5»-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 «; og β-aktin omvendt, 5»-GCTGTCACCTTCACCGTTC -. 3 «
Celleproliferering analysen
En spredning analysen ble utført ved bruk av ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay i henhold til produsentens protokoll. I korthet, 5000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners kulturplater i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS. Cellene ble dyrket i 5 dager, deretter ble 20 ul av 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) ble det tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer hver 24 timer. Absorbansen ble målt ved 490 nm med en universell mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA). Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
kolonidannelse assay
Cellene ble sådd ut i triplikat på 300 celler /brønn i en 6-brønns plate. Etter 7 dagers dyrkning ble cellene vasket to ganger med NaCl (0,9%), farvet med 2% gentian fiolett i 20 min, vasket med vann og lufttørket. Foci ble tellet ved mikroskopi. Forsøkene ble gjentatt tre ganger og data er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
myk-agar assay
Cells (1000) ble sådd ut i 6-brønns plater i 2 ml vekstmedium inneholdende 0,3 % agar og brukt til å overlappe 1,4-ml lag av vekstmedium inneholdende 0,6% agar. Etter 21 dagers dyrking, ble koloniene tellet. Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
cellesyklusanalyse
Cellene ble høstet, vasket med kald PBS to ganger og fiksert i 70% etanol ved -20 ° C over natten. Cellene ble deretter sentrifugert (1500 rpm, 10 min) og vasket to ganger ved bruk av fosfatbufret saltløsning (PBS). Deretter ble cellene på nytt oppslemmet i 0,5 ml PBS inneholdende 50 pg /ml RNase A i 1 time ved 37 ° C. Cellene ble så ladet med 65 mg /ml PI i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Prosentandelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble målt ved flow-cytometri (Beijing Bestemmelse av tradisjonell kinesisk medisin Research Institute). Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Western-blotting
Celler ble fordøyet med trypsin og sentrifugert. Cellepelleten ble vasket to ganger med PBS. Deretter ble cellene ødelagt i lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% SDS og 1 x protease-inhibitor cocktail) på is i 15 minutter og sentrifugert ved 12 000 rpm i 20 min. Uoppløselig materiale ble fjernet og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en syre bicinchoninic kit. For Western blot-analyse, cellelysater (30 ug /brønn) ble underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulose filtermembraner. Membranene ble inkubert med primære antistoffer (anti-Pax6, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, -RB, eller -RB S780 fosforylering) over natten ved 4 ° C. Sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase ble senere brukt. Signaler ble påvist ved anvendelse av ECL og eksponert for Kodak X-OMAT film. Resultatene ble skannet og analysert ved hjelp av Alpha Vis analyseverktøy.
Statistisk analyse
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Gjennom real-time RT-PCR, MTS analysen, kolonidannelse, soft-agar-analyser, cellesyklus analyse, og western-blot analyse, for sammenligning mellom hjelp av 2 grupper, ble statistiske forskjeller testet med uparede Student
t
-UNDERSØKELSER. Statistisk signifikans ble testet ved hjelp av SPSS statistikk, versjon 13.0. P 0,05 (*) ble betraktet som annerledes; P 0,01 (**) ble ansett som signifikant forskjellig
Resultater
Pax6 mRNA uttrykk ble hemmet i celler infisert med Pax6 shRNA lentiviral vektor
Pax6 mRNA uttrykk ble bestemt. I denne studien. Som vist i figur 1A, ble Pax6 sterkt uttrykt i de fleste lungekreft cellelinjer. I kontrast, MRC-5, en normal menneskelig fetal lunge fibroblast cellelinje, ikke uttrykke Pax6 (figur 1A).
A, Real-time PCR-analyse for Pax6 mRNA uttrykk nivå i H460, A2, 95C , 95D, H1299, H446, 801 D, A549, og L lungekreft linjer, så vel som i den normale human fetal lunge fibroblast cellelinje MRC-5. B, -C, Bekreftelse av Pax6 mRNA knockdown etter sanntids RT-PCR-analyser utført på total RNA isolert fra A549 (B) og H1299 (C) celler infisert med Pax6-shRNA, eller en tilfeldig shRNA. De Pax6 mRNA-ekspresjonsnivåer i A549 og H1299-celler ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR. Y-aksen representerer den normaliserte Pax6 mRNA-ekspresjon i forhold til A549 (B) eller (C) H1299 celler. ** P 0,01. D, ble Protein nivåene av Pax6 bestemt ved western-blot og GAPDH ekspresjonsnivået ble anvendt som en kontroll. Kvantifisering ble gjort ved å bestemme den grå nivået av Pax6 protein som ble normalisert mot GAPDH-nivåer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av uavhengige eksperimenter (tidene for forsøkene er oppført ovenfor histogrammene). Pax6 uttrykket ble åpenbart svekket i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler.
For å belyse hvorvidt Pax6 uttrykket har noen effekt på veksten av lungekreft celler, RNAi ble brukt til å generere Pax6 knock-down ( Pax6 KD) cellelinjer. Vi har valgt to target cellelinjer: H1299, som viste høye nivåer av Pax6 uttrykk, og A549, som viser lave nivåer av ekspresjon. I denne studien ble pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP smittet i H1299 og A549 celler. Celler ble også infisert med pGCSIL-NS shRNA-GFP (Pax6 NS) som en negativ kontroll (NC). For å bestemme funksjonen av Pax6, H1299, H1299NC, A549 eller A549NC celler ble brukt som kontroller i alle analyser.
Pax6 mRNA nivå i H1299 Pax6 KD og A549 Pax6 KD celler ble bestemt ved real-time PCR for å bekrefte om Pax6 uttrykket ble spesielt hemmet gjennom RNAi i A549 og H1299 celler. Som vist i figur 1B, ble Pax6 ekspresjon i A549 Pax6 KD celler inhibert med 80-90% sammenlignet med celler infisert med lentivirus-mediert NS-shRNA. Vi fant lignende resultater i H1299 Pax6 KD celler. Pax6 mRNA-ekspresjon i disse cellene ble også inhibert med 90-95% sammenlignet med NC-celler (*
* P
0,01; figur 1C).
Pax6 protein ekspresjon i disse cellene var oppdaget av Western blotting. Som vist i figur 1D, Pax6 protein i H1299 Pax6 KD og A549 Pax6 KD-celler ble ikke lett detektert, mens en klar Pax6 proteinbånd var tydelig i kontrollcellene.
Hemming av Pax6 ekspresjon fører til en nedgang i celleproliferasjon
Pax6 er en kritisk transkripsjonsfaktor som spiller en viktig rolle i regulering av proliferasjon og differensiering i løpet av humane embryonale utvikling [3]. En celle proliferasjonsanalyse ble utført for å bestemme hvorvidt Pax6 spiller en rolle i cellevekst. A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD, og kontroll-celler ble sådd i 96-brønners plater og celleproliferasjon aktivitet ble målt ved anvendelse av en celleproliferasjonsanalyse kit. A549 og H1299 cellevekst var åpenbart undertrykket da Pax6 ekspresjon ble inhibert med RNAi (figur 2A og B). Som vist i figur 2A og B, er reduksjon i cellevekst forårsaket av hemning av Pax6 ekspresjon i H1299 var mye sterkere enn det i A549-celler. Disse ulike resultater kan tilskrives de ulike Pax6 uttrykket nivåer mellom H1299 og A549 celler som vises i figur 1A og D.
A, -B, A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD celler og kontrollceller ble sådd i 96-brønners plater og en MTS-analyse ble utført. Absorbansen ved 490 nm (y-aksen) ble målt ved 24-timers intervaller, opp til 120 timer. C, D, Colony formasjon effektivitet i A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD celler og kontrollceller. Y -aksen representerer den normaliserte kolonidannelse hastighet i forhold til A549 (C) eller (D) H1299 celler. E, -F, A myk -agar analyse ble utført for å undersøke effektene av Pax6 på tumorgenese in vitro. Y -aksen representerer den normaliserte myk -agar kolonidannelseshastigheten i forhold til A549 (E) eller H1299 (F) celler. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. Times of forsøkene er oppført over grafen * P. 0,05, ** P. 0,01
Redusert kolonidannelse og soft-agar-kolonidannelse i Pax6 KD celler
kolonidannelse representerer et tap av kontakt-inhibering eller evnen til å opprettholde cellevekst og bevegelse til tross for kontakt med omgivende celler. For å klargjøre hvorvidt Pax6 kan gi et tap av kontakt-inhibering, celler infisert med pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP, så vel som deres kontroll celler ble sådd i 6-brønns plater og dyrket i 7 dager. Etter 2% gentian fiolett farging, ble kolonier som inneholdt mer enn 50 celler tellet under et lysmikroskop. Som vist i figur 2C og D, inhibering av Pax6 ekspresjon i A549 og H1299-celler førte til en tydelig reduksjon i antall foci som genereres i forhold til kontrollcellene (*
* P
0,01).
for ytterligere å studere funksjonen av Pax6, ble soft-agar-kolonidannelse analyseres for å fastslå om Pax6 bidratt til forankringsuavhengig kolonidannelse i lungekreftceller. Satsen for soft-agar-kolonidannelse falt i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler i forhold til NC celler (*
* P
0,01,
* P
0,05; Figur 2E og F).
Pax6 uttrykket økt cellevekst ved å fremme raskere progresjon i S-fasen av cellesyklusen
for å påvise effekten av Pax6 på cellesyklusprogresjon, cellesyklus progresjon av A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD, A549 Pax6 NC, H1299 Pax6 NC, A549, og H1299 celler ble analysert ved flowcytometri. Som vist i figur 3A, ble prosentandelen av celler som kommer inn i S-fasen ble redusert i A549 Pax6 KD cellelinje sammen med en økning i populasjonen av G0-G1 faseceller. Et lignende resultat ble observert i H1299 Pax6 KD, H1299 Pax6 NC, og H1299 celler (Figur 3B). I disse eksperimentene, Pax6 uttrykk ført til cellevekst ved å indusere cellesyklusprogresjon.
A, B, cellesyklusanalyse. Celler ble farget med propidiumjodid (PI) og analysert for cellesyklus fasefordeling. Histogrammet var statistiske data fra tre uavhengige eksperimentelle replikater. * P 0,05, ** P. 0,01
I denne studien, uttrykket nivået av cyclin D1, et relevant cyclin regulerer G1-S progresjon [15], [16], var oppdaget i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler. Som indikert i figur 4A, ble cyklin D1 ekspresjon ble redusert i A549 Pax6 KD cellelinjer sammenlignet med kontrollceller. Vi fant et lignende resultat i H1299 Pax6 KD celler (figur 4A). En annen relevant cyclin regulerer G1 /S progresjon er cyclin E [17]. Vi har også bestemt om cyclin E ble regulert av Pax6 uttrykk. Som et resultat ble cyclin E uttrykk ikke påvirkes av den stabile shRNA-mediert knockdown av Pax6 i lungekreftceller (data ikke vist). Dette viser at Pax6 kan fremme cellevekst ved å fremkalle cyclin D1 uttrykk.
A, B, Uttrykk for cyclin D1, pRB og fosforylert pRB i A549 Pax6 KD, A549 NC, A549 celler samt H1299 PAX6KD , H1299NC, H1299-celler ble bestemt ved Western blotting. β-aktin og GAPDH uttrykket nivået ble målt som interne laste kontroller hhv. Cyklin D1 og PRB-nivåene ble målt ved grånivået og ble normalisert av interne lasting kontroller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Times of forsøkene er oppført ovenfor histogrammene. * P 0,05, ** P. 0,01
Den store substrat av cyclin D1-CDK4 /6 kompleksene er retinoblastom protein (pRB) [18]. Således pRB S780 protein-fosforylering ble også påvist ved Western blotting (figur 4B). Den S780 fosforylering av pRB ble redusert ved Pax6 uttrykket ble hemmet i A549 celler. Et lignende resultat ble oppnådd da H1299 Pax6 KD celler ble anvendt (figur 4B).
MAPK signalveien ble undertrykket ved hemming av Pax6
MAPK (mitogen-aktivert protein kinase) reaksjonsveien har vært implisert i reguleringen av G1 /S overganger og celle mitosen [19]. I vår studie, ble noen sentrale regulatoriske molekyler av MAPK trasé undersøkt ved hjelp av western blot analyse. Som vist i figur 5, ble fosforylering nivåene av ERK1 /2 og p38 ble redusert både i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler. Det indikerte at MAPK signalet ble svekket resultat av RNAi forstyrrelser av Pax6.
Western-blot analyse av A549, A549 NC, A549 Pax6 KD, H1299, H1299NC, H1299 Pax6 KD med antistoffer mot ERK1 /2 ( A), ble p38 (B) og deres fosforylerte formene vist i figuren. GAPDH og β-actin ble brukt som intern lastkontroller henholdsvis. ERK1 /2 og p38-nivåer ble normalisert ved GAPDH og β-aktin respektivt. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger. * P 0,05, ** P. 0,01
Pax6 ble sterkt uttrykt i kreftvev lunge
Pax6 mRNA i lungekreft vev, samt matchet tilstøtende vev, ble påvist å bekrefte rollen Pax6 i lungekreft. De kliniske karakteristika for de 52 pasienter er angitt i tabell 1. Som vist i figur 6A, ble Pax6 mRNA rikelig uttrykt i tumorvevet i forhold til tilstøtende normale vev. Ekspresjonen av Pax6 representert av en kreft-til-tilstøtende nontumorous vev-forhold for hver enkelt er vist på figur 5B. Pax6 ekspresjon i lungekreft vevet var høyere enn det i hver avstemt tilstøtende normalt vev i alle bortsett fra tre tilfeller (figur 6B). Statistikken Resultatene ble oppført i tabell 2 og forholdet (svulst /tilstøtende vev) på 65% av pasientene (34 prøver) overskrides 100. Det vil si, i de fleste tilfeller, ble Pax6 hovedsakelig uttrykt i lungekreft vev.
A, real-time PCR-analyse av Pax6 uttrykket nivå i lungekreft vev, samt matchet tilstøtende vev, fra 52 pasienter. Den Pax6 mRNA-nivået ble normalisert ved β-aktin uttrykk nivå. B representerer hver kolonne den relative forholdet mellom Pax6 mRNA i primær NSCLC versus tilstøtende lungevev, og den linje tvers over grafen representerer verdien henholdsvis 1 og 10. Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger. ** P. 0,01
Diskusjoner
I vår studie, er funksjonen av Pax6 i lungekreftceller ble undersøkt. Veksten evne til A549 og H1299 celler ble avvist da Pax6 uttrykket ble hemmet av spesifikke Pax6 shRNA. Vi foreslår at Pax6 fremmer G1-S progresjon ved aktivering av MAPK signalveien. Og Pax6 ble sterkt uttrykt i lungekreft vev og lungekreft cellelinjer.
transkripsjonsfaktor Pax6 spiller ulike roller i ulike svulster. Det er ofte uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og retinoblastomceller, impliserer en onkogen funksjon, mens Pax6 er anerkjent som en tumor suppressor i hjernesvulst og prostatakreft [6], [10], [11], [20], [21] .PAX6 uttrykket er betydelig redusert i glioblastom og ekspresjonsnivået er korrelert med lengre pasientoverlevelse [22]. Pax6 undertrykker glioblastoma cellevekst, forankrings-uavhengig vekst og gliom angiogenese, så vel som invasivitet av glioblastoma celle, via inhibisjon av matriksmetalloproteinase-2 (MMP2) ekspresjon og vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) ekspresjon [20], [23], [24]. I prostatakreft, Pax6 uttrykket var lavere i kreft vev og kreftcellelinjer enn normale epitelceller [21]. Overekspresjon av Pax6 trykt spredning og kolonidannelse av prostatakreftceller [8].
Men Pax6 spiller en onkogen rolle i kreft i bukspyttkjertelen og retinoblastom [4], [22] .I bukspyttkjertelen adenokarsinom og bukspyttkjertelkreft cellelinjer , nedregulering av Pax6 av spesifikke siRNA fører til en nedgang i cellevekst og celle apoptose [12]. Metylering av Pax6-arrangører er økt i tidlig blærekreft og denaturert Pax6-arrangører kan være et representere biomarkør for denne sykdommen [25]. Og undertrykkelse av Pax6 mRNA-ekspresjon resulterte i en inhibert vekst og økt apoptose av dyrkede humane retinoblastom-celler [26]. Våre funn viser også at Pax6 impliserer en onkogen funksjon i lungekreft. I våre resultater, ble Pax6 mRNA sterkt uttrykt i både lungekreft vev og lungekreftcellelinjer. A549 og H1299 cellevekst ble hemmet av spesifikke Pax6 shRNA. Undertrykkelse av Pax6 uttrykk førte til redusert cellevekst og kolonidannelsen, i tillegg til forankrings-uavhengig kolonidannelse. Men våre funn tyder på at celle apoptose ikke ble påvirket av hemming av Pax6 (data ikke vist). Og cellemigrering ble heller ikke påvirket av undertrykkelse av Pax6 mRNA (data ikke vist)
Pax6 er kreft avhengig og har forskjellige signalveier i forskjellige tumorer [13], [20] – [24]., [26]. I HeLa-celler, regulerer Pax6 celle-syklusprogresjon ved å fremskaffe ekspresjon av human RFPL1 (hRFPL1), som nedregulerer cyclin B1 og Cdc2 uttrykk og fører til akkumulering av celler i G2-M-fase [27]. Vi har også fokusert på rollen av Pax6 i regulering av cellesyklusprogresjon i lungekreft. I vår cellesyklusanalyse ble cyclin D1 trykt i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler. Det indikerte at Pax6 uttrykket fremmet cellecyklusprogresjonen ved overgangen celler fra G1 til S-fasen. I samsvar med disse funnene, viste cellesyklus analyse en betydelig reduksjon av G0 /G1 arrest og en betydelig induksjon av G2 /M arrest i Pax6 overekspresjon menneskelige retinoblastomceller [28].
Cyclin D1-CDK4 og cyclin d1- CDK6 komplekser i tidlig til midten av G1 fase phosphorylate og inaktivere pRB [29], [30]. Våre funn i denne studien impliserer at pRB S780 fosforylering nivået ble svekket da Pax6 uttrykket ble hemmet. Således viste vi at Pax6 økt ekspresjon av cyclin D1 og forbedret cellevekst ved å fremme G1-S-overgangen. Mitogen-indusert Ras-signalisering fremmer transkripsjon av cyklin D1-genet og det avhenger av MAPK-reaksjonsveien signal [31]. Våre funn tyder på at hemming av Pax6 reduserer fosforylering nivået ERK1 /2 og p38. Disse studiene tyder på at Pax6 regulerer celle G1 /S progresjon via MAPK signalveien i lunge kreftceller.
Det er imidlertid fortsatt uklart reguleringsmekanisme av Pax6 i lungekreft. En fersk studie viste at Pax6 fremmer cellevekst ved å aktivere MET tyrosin kinase reseptor genet i bukspyttkjertelen karsinom [13]. I lungekreftceller, blir ERK1 /2-signal pathway involvert i reaksjonsveien MET [32]. Våre funn indikerer at ERK1 /2 ble aktivert av Pax6 uttrykk. Slik at vi antar at Pax6 aktiverer MAPK signal og fremmer cellecyklusprogresjonen via MET gentranskripsjon i lungekreft
Pax6 er først og fremst til uttrykk under embryogenese.; lite eller ingen Pax6 protein er detektert i voksent vev [3]. Som Pax6 er ofte uttrykt i svulster [9], bestemt vi Pax6 nivå i grunnskolen lungekreft vev. Den Pax6 Ekspresjonsnivået i passet tilstøtende vev ble målt som en kontroll. I likhet med pankreastumorer, Pax6 uttrykket var sterkere i lungekreft vev enn i tilstøtende vev. Kreften-til-tilstøtende nontumorous vev forhold på Pax6 mRNA-ekspresjon for hver enkelt ble beregnet. Bare tre forhold var mindre enn ett, og de fleste av forholdene var mye mer enn 100. Alle disse funnene viste at Pax6 fungerte som et onkogen faktor i lungekreft.
Konklusjoner
I denne studien, vi rapportere at økt uttrykk av Pax6 ble notert i primær lungekreft vev. Pax6 fremmet cellevekst ved å aktivere MAPK signalering og akselererende cellesyklusprogresjon. Videre Pax6 regulert G1-S progresjon ved å fremkalle cyclin D1 uttrykk og pRB fosforylering. Våre data tyder på at Pax6 er en ny potensielt mål i lungekreft.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Meng Gu for å få hjelp med prøver samling.
