Abstract
Bakgrunn
epigenetiske forandringer har vært innblandet i patogenesen av solide svulster, derimot, proto-onkogener aktiveres av arrangøren demetylering har vært sporadisk rapportert. Vi brukte en integrerende metode for å analysere uttrykk i primær hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) og farmakologisk demetylerte cellelinjer for å identifisere abnormt demetylert og uttrykte kandidat proto-onkogener og kreft testiklene antigener i HNSCC.
Metodikk /Principal funn
Vi bemerket koordinert promoter demetylering og samtidig transcriptional oppregulering av proto-onkogen kandidater med arrangøren homologi, og fylogenetisk footprinting av disse arrangørene viste potensielle gjenkjenningsseter for transkripsjonsfaktoren BORIS. Avvikende BORIS uttrykk korrelert med oppregulering av kandidat proto-onkogener i flere menneskerettighets maligniteter inkludert primær ikke-småcellet lungekreft og HNSCC, indusert koordinert proto-onkogen promoter demetylering og uttrykk i ikke-tumorigene celler, og forvandlet NIH3T3 celler.
Konklusjon /Betydning
koordinert, epigenetisk avsløring av flere gener med vekstfremmende aktivitet skjer i aerodigestive kreft, og BORIS er innblandet i det samordnede promoter demetylering og reaktivering av epigenetiske forstummet gener i kreft hos mennesker.
Citation: Smith IM, Glazer CA, Mithani SK, Ochs MF, Sun W, Bhan S, et al. (2009) Koordinert aktivering av Kandidat Proto-onkogener og kreft testiklene antigener via Arrangøren Demetyler i hode- og halskreft og lungekreft. PLoS ONE 4 (3): e4961. doi: 10,1371 /journal.pone.0004961
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA
mottatt: 5 oktober 2008; Godkjent: 03.02.2009; Publisert: 23 mars 2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. NIH T32 stipend, klinisk Innovator Award fra Flight Attendant Medical Research Institute, og National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetisk endringer i promoteren metylering og histon-acetylering er blitt assosiert med cancer-spesifikk ekspresjon forskjeller i humane maligniteter.
metylering er primært blitt betraktet som en mekanisme for tumorsuppressorgen (TSG) inaktivering, og omfattende hel-genom profilering tilnærminger til arrangøren hypermethylation har identifisert flere nye mulige TSGs forstummet av arrangøren hypermethylation.
Indirekte bevis støtter en rolle for
hypo
metylering i tumorutvikling. Globalt genomisk hypometylering har blitt rapportert i nesten alle solide tumorer [1] – [3]. Mus med funksjonell forstyrrelse av DNA metyltransferase 1 (
DNMT1
) -funksjonen viser betydelig genomisk hypometylering i alle vev og utvikle aggressive T-cellelymfom med ustabilitet kromosom [4]. I solide humane tumorer, viser meta-analyse en samlet sammenheng mellom global hypometylering og avansert tumor stadium [3].
Til dags dato, bare sporadiske eksempler på promoter hypometylering forbundet med umaskert uttrykk for antatte onkogener er rapportert, inkludert :
R-Ras
i magekreft [5],
c-Neu
i transgene musemodeller [6],
Hox11
proto-onkogen i leukemi [7] ,
BCL-2
genet hypometylering og høyt nivå uttrykk i B-celle kronisk lymfatisk lymfom [8], demetylering i MMTV /N-rasN transgene mus [9], og sjelden aktivering av to
RAS
familiemedlemmer i tykktarmskreft og småcellet lungekreft [10]. Disse observasjonene viser at proto-onkogener med vev-spesifikk eller utviklingshemmede begrenset uttrykks dvs. under tidlig vekst, differensiering eller gametogenesis-kan være feilaktig gjen uttrykt i kreft via epigenetisk endring, inkludert demetylering.
HNSCC er nyttig som et fast stoff tumormodellsystem, på grunn av den etablerte rolle epigenetiske endringer i patogenesen [11], så vel som tilgjengeligheten av normale, minimalt transformerte cellelinjer for anvendelse i gen-funn strategier [12]. Ved hjelp av farmakologisk demetylering i normal, minimalt-transform muntlige keratinocyte cellelinjer kombinert med kreft avvikende Profil Analyse (COPA) i primær vev som et funn tilnærming, vi var i stand til å definere et sett med kandidat proto-onkogener som gjennomgår avvik demetylering og økt uttrykk i primære humane svulster.
Funksjonell data og tidligere publiserte observasjoner tyder på at uttrykket av disse genene er assosiert med tumorvekst. Ytterligere analyser viste arrangøren homologi og koordinert oppregulering i enkelte svulster for undergrupper av disse målgener (proto-onkogener). Vi var i stand til å utvide disse observasjonene til en rekke solide tumortyper og implisere en nøkkel transkripsjonsfaktor, BORIS, i Coordinated epigenetisk aktivering av proto-onkogener. Disse dataene indikerer at avvikende demetylering av flere, fysiologisk fortrengte proto-onkogener oppstår på en koordinert måte i enkelte svulster fra flere solide tumortyper.
Resultater
Integrative Funn av epigenetiske avslørt gener i HNSCC
Vi antok at normale cellelinjer som inneholder metylert gener som vanligvis er undertrykt i normalt vev, men at disse genene kan bli re-uttrykkes ved farmakologisk manipulasjon. En undergruppe av disse genene vil inkludere kandidat proto-onkogener aktiveres ved demetylering i humane kreftformer som kan bli ytterligere valgt på basis av primærtumor uttrykk rekke analyse ved hjelp av integrerende metoder. Vi valgte å tilpasse kjente fremgangsmåter for epigenetisk screening ved anvendelse av 5-aza /TSA behandling som har vist seg å være vellykket i å definere kandidat tumorsuppressorgener. To tert-transformerte normale oral keratinocytt-cellelinjer ble behandlet med 5 uM 5-aza deoksycytidin i fire dager og Trichostatin A for en dag før høsting total RNA for ekspresjon rekke analyse ved bruk av dChip [12], [13].
Samtidig utførte vi en komparativ epigenetisk tilnærming utnytte Cancer avvikende Profiling Analysis (COPA) med 49 primær HNSCC og 19 normale slimhinnevevet analysert for mRNA uttrykk på Affymetrix U133A mRNA uttrykk microarray plattform (16,383 probe sett) samlet fra tidligere arbeid og offentlig kilder uttrykk (oncomine.org). COPA er spesielt nyttig for å fastslå forskjeller i uttrykk for bestemte gener i undergrupper av primærtumorprøver, med forbedret ytelse sammenlignet med statistiske verktøy som er avhengige av median eller gjennomsnitt uttrykk forskjell mellom to datasett [14]. Vi beregnet COPA på 90
th persentil for våre endelige rangeringen av alle 16,383 funksjoner av arrays, som resulterte dette i de mest markante forskjeller i uttrykk med vår utvalgsstørrelsen. Statistisk signifikans av uttrykket forskjeller i COPA diagrammene ble målt ved hjelp av Mann-Whitney U-test (figur 1B).
(a) Til å begynne med minimalt-transformerte cellelinjer ble behandlet med 5-aza-deoksycytidin og TSA til avdekke epigenetiske dempede gener. For å korrelere epigenetisk avsløring med meningsfulle oppregulert kreftspesifikke gener, utførte vi en komparativ epigenetisk tilnærming med kreft avvikende Profiling Analysis (COPA) med 49 svulster og 19 normalt vev som hadde blitt karakterisert på Affymetrix U133A mRNA uttrykk microarray plattform. Gener (etter probeset) ble rangert først av graden av upfold regulering med 5-aza /TSA behandling og andre med COPA oppregulering på 90
th persentil. Produktet fra disse rekkene ble benyttet til å rangere alle mål og en betydning terskel (α = 0,005) ble valgt som resulterer i 106 gener av hvilken de beste 26 gener ble evaluert. For å kunne ikke utelukke gener utenfor U133A plattformen, vi også vurdert alle andre gener i U133 Plus 2,0 plattformen på den eneste grunnlag av 5-aza /TSA upfold regulering. Gener ble senere undersøkt ved tilstedeværelse av CpG øyer bruker MethPrimer og alle genene ble validert av bisulfite sekvensering av tumor og normalt vev, og QRT-PCR av cellelinjer og primære svulster. Av de integrerende mål 7/26 gått vår validering, mens 2/46 av de ikke-integrerende mål passert. Funksjonelle eksperimenter ble deretter gjennomført på disse genene. (B) Representant COPA graf av
MAGEA3
demonstrere statistisk tilnærming til å finne kandidater overexpressed onkogener. Forskjell i tumor (n = 49) sammenlignet med normal (n = 19) ekspresjon var signifikant, p-verdi 0.001 målt ved hjelp av Mann-Whitney U-test. (C) Arrangøren demetylering fører transkripsjonen oppregulering. Oppregulering etter behandling med 5-aza /TSA er vist i cellelinjer som målt ved QRT-PCR. Forholdet mellom 5-aza /TSA behandlet uttrykk til baseline er vist for
C19ORF28
,
H19
,
TKLT1
,
GPR17
,
GRIN1
,
MAGEA2
,
MAGEA3 /6
,
MAGEA4
,
MAGEA11
. Hvert gen viste betydelig oppregulering av 5-aza /TSA behandling i minst en celle-linje. Feilsøylene viser SE
Vi er fast bestemt gen rekker på to måter:. 1) COPA ranking på 90
th persentil av oppregulering i primær svulstvev versus normalt vev uttrykk og 2) upfold regulering etter farmakologisk demetylering etter dChip normalisering i cellelinjer.
En integrerende rang produktet ble beregnet (figur 1A). Ved hjelp av en betydning terskel (α = 0,005) og påfølgende tilfeldig permutasjon av våre rang-lister, identifiserte vi 106 gener som var signifikant forskjellig oppregulert basert på epigenetisk screening og vev microarray uttrykk (tabell S1). Vi empirisk valgt toppen scoring 26 gener for videre analyser. Sytten av 26 gener som inneholder promoter-forbundet CpG øyer utnytte MethPrimer programvaren ble valgt for videre studier [15].
I en egen parallell analyse for å redegjøre for mulige aktiverte proto-onkogener ikke inngår i U133A-plattformen, vi analysert 32.500 gener i U133plus2 plattformen rangert på eneste grunnlag av 5-aza /TSA upfold regulering i våre normaliserte cellelinjer som ikke ble inkludert i primærtumor uttrykk rekke analyse. Vi identifiserte 46 målgener med . 2 ganger oppregulering ved 90% konfidensintervall og en gjennomsnittlig forskjell verdi uttrykk i forhold til utgangspunktet større enn 50. Blant disse 30 ble bekreftet å ha CpG øyer (Tabell S2)
Validering av svulst promoter demetylering av målgener
CpG øyer i promoter-regionen i de 47 utvalgte genet mål med CpG øyer ble bisulfite sekvensert i normale slimhinneprøver fra pasienter uten en kreftdiagnose for å bekrefte epigenetisk stanse i moden øvre aerodigestive veisslimhinnen (Tabeller S1 S2). Bare 18/47 promoter regioner viste fullstendig metylering til enhver sekvensert CpG områder i alle normale vev. Disse målene ble deretter sekvensert bisulfitt i 10 primær HNSCC å analysere for tilstedeværelsen av hypometylering. (Figur 2A). Av disse målene, 9/18 viste demetylering (se tabell 1) i tumorvev i mer enn 30% av prøvene, inkludert
TKTL1 plakater (4/10, p 0,05),
H19
(6/10, p 0,05),
MAGEA2 plakater (5/10, p 0,05),
MAGEA3 /6 plakater (5/10, p 0,05),
MAGEA4 product: (5/10, p 0,05),
MAGEA11 plakater (5/10, p 0,05),
GPR17 plakater (3/10, p 0,10),
GRIN1 product: (6/10, p 0,05),
C19ORF28 plakater (5/10, p 0,05), (chi-kvadrat). For å bekrefte transcriptional oppregulering av målgener med 5-aza /TSA behandling i vår cellelinje system (sett i figur S1), utførte vi kvantitativ RT-PCR på 5-aza /TSA-behandlede normale celler sammenlignet med mock-behandlede celler for disse ni gener (figur 1C). Hvert gen viste betydelig oppregulering av 5-aza /TSA behandling i minst én cellelinje som støtter funksjonelt gen regulering av promoter hypometylering. Ved hjelp av den innledende kohort av 10 primærtumor, utførte vi en foreløpig analyse for å bestemme forholdet av promoteren hypometylering til uttrykk. QRT-PCR uttrykket med bisulfitt sekvensering av de respektive promoteren nedenfor er vist i figur 2b-j. Vi ansatt Mann-Whitney U test for å sammenligne QRT-PCR uttrykk for denaturert og unmethylated grupper. Tre gener hadde statistisk signifikant økt uttrykk i unmethylated gruppe:
MAGEA2 product: (p = 0,007),
MAGEA3 /6 product: (p = 0,007),
MAGEA11 plakater (p = 0,05). Mulige sammenhenger mellom uttrykk og formidler metylering status i denne lille kohorten ble også foreslått for
TKTL1 product: (p = 0,06),
MAGEA4 product: (p = 0,09),
C19ORF28 product: ( p = 0,09),
GRIN1 product: (p = 0,06), men
H19 product: (p = 0,7), men
GPR17 product: (p = 0,38) viste ikke denne foreningen.
(a) Vist er de bisulfitt sekvense resultatene i 10 svulster og 10 normaler for:
TKTL1 plakater (4/10, p 0,05),
H19 plakater (6 /10, p 0,05),
MAGEA2 plakater (5/10, p 0,05),
MAGEA3 /6 plakater (5/10, p 0,05),
MAGEA4
(5/10, p 0,05),
MAGEA11 plakater (5/10, p 0,05),
GPR17 plakater (3/10, p 0,10),
GRIN1
(6/10, p 0,05),
C19ORF28 plakater (5/10, p 0,05). (B-j) QRT-PCR uttrykket med bisulfitt sekvensering av det respektive promoteren under (hvit er unmethylated, er grå denaturert). Signifikans ble målt ved sammenligning av ekspresjon av denaturert å unmethylated ved Mann-Whitney U-test. Signifikans ble funnet i MAGEA2 (p = 0,007), MAGEA3 /6 (p = 0,007), MAGEA11 (p = 0,05). Sterke assosiasjoner mellom uttrykk og formidler metylering status ble også funnet for TKTL1 (p = 0,06), MAGEA4 (p = 0,09), C19ORF28 (p = 0,09), GRIN1 (p = 0,06). H19 (p = 0,7) og GPR17 (p = 0,38) viste ikke sammenheng mellom bisulfite sekvensering og uttrykk i denne kohorten. Feilfelt skildre standard feil.
Funksjonell validering av kandidatgener
Vi deretter utført transient transfections å evaluere og /eller bekrefte vekstfremmende effekten av disse ni mål som viser svulst promoter hypometylering. Selv om H19 koder for et ikke-translatert RNA transkripsjon, vises H19 produkt å indusere vekst i lunge- og brystkreftcellelinjer [16] og kan indusere resistens i lever og cellular carcinoma [17]. Figur 3A viser resultatene oppnådd ved transient transfeksjon av en
H19
bygge inn i OKF6-tert-1R-celler. På fire dager, var det en 41,4% (± 15%) økning i vekst over transfektert tom vektor. Den MAGE-familien består av beslektede familiemedlemmer som er kjent for å være oppregulert i en rekke forskjellige tumortyper [18], men har nylig blitt implisert i indusering av transkripsjonen omprogrammering i tumorceller [19].
MAGEA2
induserte en 72,7% (± 26%) økning i veksten på dag tre (figur 3B).
MAGEA4
transfeksjon induserte en 203% (± 17%) økning i vekst (figur 3D). Funksjonelle vekst forskjeller ble testet, men ikke funnet for
C19ORF28
.
(a) Transient transfeksjon av en
H19
bygge inn OKF6-tert-1R celler (i dag 4 , ± 41,4% 15% vekst økning). (B) Transient transfeksjon av en
MAGEA2
bygge inn OKF6-tert-1R-celler (på dag 3, 72,7% ± 26% vekst økning). (C) Transient transfeksjon av en
TKTL1
bygge inn OKF6-tert-1R celler (på dag fire, 50,1% ± 38% vekst økning). (D) Transient transfeksjon av
MAGEA4
bygge inn OKF6-tert-1R-celler (i dag 4, 203% ± 17% vekst økning). For (e) vi utviklet en kvantitativ analyse for å måle unmethylated arrangører, kalt Kvantitativ Unmethylation Spesifikke PCR (QUMSP). QUMSP prosentandel av
C19ORF28
,
GRIN1
,
H19
,
MAGEA11
,
MAGEA2
,
MAGEA3 /6
,
GPR17
, og
TKTL1
ble gjennomført i en egen kohort av hode- og nakkekreftpasienter som bruker 25 svulster og 11 videregående aerodigestive slimhinneprøver til analyse promoter demetylering. Statistisk signifikante forskjeller ble funnet i
GRIN1
,
MAGEA11
,
MAGEA2
. Neste promoter demetylering ble ansett som en årsak til mRNA uttrykk øker sett i EXPO datasett. (F) viser QUMSP resultater for en uavhengig kohort av 14 lunge normaler og 13 lunge kreftpasienter. Signifikante forskjeller i QUMSP ble funnet i
H19
,
MAGEA11
,
MAGEA2
, og
MAGEA3 /6
.
i figur 3C,
TKTL1
induserte en 50,1% (± 38%) økning i veksten på dag fire. Forbedret uttrykk for TKTL1 har nylig vært innblandet i konvertering av celler til aerobic, glycolytic metabolisme samt økt spredning i tykktarm kreft celler [20] – [25]. TKTL1 uavhengig er assosiert med dårlig overlevelse i laryngeal karsinom, tykktarm og urothelial kreftformer, så vel som fjernmetastaser i eggstokk-karsinom [22], [23], [26] For å ytterligere bekrefte TKTL1 som en kandidat proto-onkogenet i HNSCC, utførte vi adherente koloni fokusforsøk i TKTL1 lav-uttrykkende cellelinjer HNSCC JHU-011 og JHU-028, og fant betydelig vekst økning i begge cellelinjer (figur 4 A, B). Vi så anvendt shRNA konstruerer i et TKTL1 høy-uttrykkende cellelinje UM-22B i forankringsuavhengig vekst analyser, og bemerket en dramatisk reduksjon i størrelse og antall kolonier (figur 4 C, D) sammenlignet med narretransfekterte celler.
(a) TKTL1 tvungen overekspresjon via forbigående transfeksjon i bakgrunnen lav uttrykke JHU-011-celler induserer øket forankringsavhengig kolonidannelse og (b) TKTL1 shRNA i høy-uttrykkende Fadu cellelinje induserer veksthemming. (C) forankringsuavhengig vekst av UM-22B-celler blir hemmet signifikant ved TKTL1 shRNA (d), sammen med reduksjon i kolonistørrelse. (* = P 0,01, ** = p 0,001, chi kvadrat).
Kandidat proto-onkogen uttrykk og formidler demetylering i andre menneskelige krefttyper
For å finne ut om kandidaten proto-onkogen ekspresjon ble endret på et bredere spekter av tumortyper, analyserte vi uttrykk data tilgjengelig gjennom Expo datasettene for 1041 humane svulster i alle histologier [27]. Data var første median-uttrykk normalisert ved hver matrise og senere av median normalisering av probe sett har over 1041 svulster fra mange krefttyper, inkludert lunge og urothelial, men ikke HNSCC. Vi har valgt et delsett av disse tumorer, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), lymfom, melanom, kreft i bukspyttkjertelen, prostatakreft, og urothelial kreftformer, for presentasjon (figur 5A-D).
H19
var signifikant oppregulert i NSCLC (p = 0,008) og i urothelial kreft (p = 0,0013), som beregnet ved Mann-Whitney U-test for sammenligning rekke normaliserte ekspresjon i tumortypen til alle andre tumorer. Vi bemerket signifikant økt uttrykk av MAGEA2 i NSCLC (p = 0,005), men ikke i uroteliale kreft (p = 0,18).
TKTL1
også viste overekspresjon i NSCLC (p = 0,05), men ikke urothelial kreft (p = 0,55), og
MAGEA4
ble overuttrykt i NSCLC (p = 0,04), men ikke vesentlig så i urothelial kreft (p = 0,12). For å bekrefte target-spesifikke demetylering angitt i primære tumorer, utarbeidet vi en hurtig, kvantitativ analyse for spesifikt å måle ikke-metylert promotorer, som vi har betegnet Kvantitativ Unmethylation-spesifikke PCR (QUMSP). Tjuefem HNSCC tumorer og 11 videregående aerodigestive slimhinneprøver ble analysert for arrangøren demetylering (Figur 3E). Tumor-spesifikke demetylering ble funnet i
GRIN1 product: (p = 0,005),
MAGEA11 product: (p = 0,001), og
MAGEA2 product: (p = 0,002). Vi utførte en lignende analyse ved hjelp av en egen, uavhengig kohort av 13 NSCLC prøver med 14 lunge prøver fra pasienter uten neoplastisk sykdom og bekreftet arrangøren hypometylering i målgener. Vesentlige forskjeller på
H19 product: (p = 0,02),
MAGEA11 product: (p = 0,03),
MAGEA2 product: (p = 0,005) og
MAGEA3 /6 product: (p = 0,02). Se figur 3F.
Expo datasett depotet ble utvunnet for svulstvev genuttrykk målt ved Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform. Til å begynne med data var median-normalisert ved ekspresjon matrise og hvert gen var median normalisert til denne figuren. Bare de undergrupper av ikke-småcellet lungekreft, lymfom, melanom, bukspyttkjertel cancer, og cancer urothelial vises. (A) viser et uttrykk for
H19
i disse kreftformene. (B)
MAGEA2
uttrykk, (c)
TKTL1
uttrykk, og (d)
MAGEA4
. Statistisk signifikans ble målt i hver tumortype ved å sammenligne genekspresjon i tumortype til ekspresjon i alle de gjenværende 1041 prøvene. Tumortyper uten p-verdiene nærmer ikke statistisk signifikans. Lunge og urothelial viste signifikant uttrykk overlapping.
Aberrant uttrykk for kandidat proto-onkogener oppstår på en koordinert måte i enkelte primære svulster
I løpet av disse analysene, vi raskt bemerket at transkripsjonen oppregulering via promoter hypometylering tendens til å skje synkront i en undergruppe av svulster. I vår kohort av 49 primær HNSCC analysert via uttrykk rekke analyse, bygget vi en matrise av Pearsons korrelasjonskoeffisienter mellom uttrykket nivåer av hvert mål (figur 6A). For våre ni mål gener, ble betydelig gruppering av økt uttrykk bemerket innenfor MAGEA familie av gener. H19 ble ikke inkludert på grunn av sitt fravær på U133A-plattformen. En egen klynge av forbundet overekspresjon var kjent for
TKTL1
,
GRIN1
, og
GPR17
. Fra NSCLC uttrykk data fra Expo datasett vi opprettet tilsvarende matriser til å undersøke sammenhenger mellom enkeltgener. Vi merket oss at MAGEA familie uttrykk og
H19
uttrykk viste signifikante sammenhenger i enkelte NSCLC (se figur 6B). I kontrast, var det ingen target-målet korrelasjoner for NSCLC uttrykk for den andre gruppen (
TKTL1
,
GRIN1
, og
GPR17
) som viste koordinert uttrykk i HNSCC.
(a) viser den genekspresjon korrelasjons p-verdi matrise for koekspresjonen for hvert gen par på tvers av alle tumorer. Denne sammenligningen viser korrelasjonen av hvert gen par i 49 svulster i hode og hals. (B) Gene par uttrykk p-verdi korrelasjonsmatrise for 80 NSCLC. Av notatet C19ORF28 ikke er flislagt på denne array plattform. (C) Analyse av promoter-regionene for genene. Vist er en phylogram av våre arrangører av interesse basert på ClustalW analyse etter gjen sekvens justering. Regionen betydelig homologi vises etter sekvens justering og E statistikk fra EMBL-EBI er PromoterWise sammenligning. (D) Arrangøren hypometylering (QUMSP) korrelasjon p-verdi matrise for HNSCC (25 svulster). (E) Arrangøren hypometylering (QUMSP) korrelasjon p-verdi matrise for NSCLC (13 svulster).
Expression mønstre korrelerer med arrangøren homologi for arrangøren demetylert målgener
Vi ønsket å avgjøre om promoter homologi ble assosiert med den koblede uttrykk for de to proto-onkogen klynger. Vi senere brukte europeiske Bioinformatikk Institute ClustalW verktøyet (figur 6C) for phylogram analyse etter gjen sekvens innretting av de respektive arrangører. For å bekrefte homologi kvantitativt, brukte vi EMBL-EBI sin PromoterWise sammenligning verktøy som fant signifikante parvise områder av arrangøren homologi i
GPR17
,
GRIN1
, og
TKTL1
. Som forventet fra tidligere studier, den MAGE-En familie gruppert sammen, som MAGE-A familiemedlemmer og H19 er kjent for å ha konsensus-bindingsseter for metylering følsomme bindende faktorer
CTCF Hotell og
CTCFL
/
BORIS
. I tillegg har denne andre gruppen av
GRIN1
,
GPR17
, og
TKTL1
gruppert sammen av sekvens homologi.
Til slutt, vi ønsket å se om graden av arrangøren hypometylering var korrelert i enkelte svulster. For både primær HNSCC (figur 6D) og NSCLC (figur 6E), ble flere signifikante sammenhenger mellom metylering status funnet mellom mål, men metylering status ikke klynge i grupper definert av MAGE-A familie /H19 uttrykk klynge eller av
TKTL1
,
GRIN1
,
GPR17
klynge. Snarere var det signifikante sammenhenger mellom alle identifiserte kandidat proto-onkogener. Hypometylering derfor ut til å forekomme i en relatert mote i enkelte svulster for alle målgener, men samtidig uttrykk av gener innenfor de to klyngene ble assosiert med arrangøren homologi snarere enn metylering status. Dette innebar at spesifikke transkripsjonsfaktorer kan være involvert i reguleringen av epigenetisk avsløring og /eller transkripsjonen aktivering basert på arrangøren homologi mellom disse søker proto-onkogener.
BORIS uttrykket er assosiert med proto-onkogen aktivering i primære svulster, induserer promoter demetylering, kandidat proto-onkogen uttrykk, og celletransformasjon
Den åpenbare tilstedeværelsen av flere MAGE gener blant våre mål bedt oss å studere oppstrøms regulatoriske trasé kjente kreft-testis antigener. BORIS og CTCF er en unik beslektet par av transkripsjonsfaktorer som er involvert i epigenetisk regulering som deler en identisk DNA-bindende domene. BORIS er transcriptionally forstummet i de fleste normale vev, men uttrykt i normal embryo, bakterie celle, og kreft vev. Vi er fast bestemt om uttrykk for BORIS korrelert med kandidat proto-onkogen uttrykk i en egen kohort av 36 primær HNSCC. Figur 7A presenterer et varmekart laget av median normalisert, QRT-PCR ekspresjonsdata av våre proto-onkogener, sortert etter BORIS uttrykk. I disse 36 kreftformer, ble BORIS overekspresjon signifikant korrelert til overekspresjon av 6/9 proto-onkogener inkludert:
MAGEA3 /6 product: (p = 0,0017),
MAGEA4 product: (p = 0,04),
MAGEA11 product: (p 0,001),
GPR17 product: (p = 0,01), og
C19ORF28 product: (p = 0,001). For ytterligere å undersøke korrelasjonen mellom BORIS uttrykk med våre målgener i solide kreftformer, analyserte vi Expo datasett data for 1041 humane svulster i en rekke vev kilder og histologier. Signifikant positiv korrelasjon av BORIS uttrykk med uttrykk for hver av våre ni proto-onkogener ble bemerket:
GRIN1 product: (p 0,001),
C19ORF28 product: (p 0,001),
H19
(p 0,001),
MAGEA11 product: (p 0,001),
MAGEA2 product: (p 0,001),
MAGEA3 /6 product: (p = 0,003),
MAGE4 product: (p 0,001),
TKTL1 product: (p 0,001),
GPR17 product: (p 0,001), (figur S2). Selv BORIS transkripsjoner er vanligvis umulig å oppdage i normale celler, bestemte vi at 59% av alle svulster har en BORIS nivå som overstiger median uttrykk for alle gener, og 90% av svulster har en BORIS uttrykk nivå 25% av median uttrykk verdi for alle gener, noe som indikerer at avvik BORIS uttrykk er en vanlig hendelse i kreft hos mennesker.
(a)
BORIS
uttrykk korrelerer med uttrykk av målgener i HNSCC (QRT-PR) varmekartet (Pearson korrelasjon) (b) Transient transfeksjon av
BORIS
bygge inn NIH-3T3 og OKF6-Tert1R cellelinjer.
BORIS
overekspresjon resulterte i øket cellevekst i 3T3-cellelinje (ved dag 3, 77% ± 34% vekst økning) og i den OKF6-Tert1R cellelinje (ved dag 3, 161% ± 78% vekst øke). Cellevekst i forhold til utgangspunktet beregnet ved å dividere verdier for dag 1 er Calcein signal. (C) Anchorage uavhengig vekst ble analysert etter transfeksjon med tom vektor (EV), CTCF, og BORIS på ulike konsentrasjoner av doksycyklin, med representative koloni (nedenfor). (D) QUMSP av ni mål av interesse etter transfeksjon med tom vektor (ubehandlet) og BORIS konstruere (behandlet) i nærvær av 0,0625 ug /ml doksycyklin. (E) Brett øke Quantitiative RT-PCR ni mål av interesse etter BORIS transfeksjon normalisert til verdier etter transfeksjon med tom vektor.
For å utforske de funksjonelle og epigenetiske effekter av BORIS, tetracyklin induserbar pBIG2i-BORIS konstruksjoner ble transient transfektert inn i NIH-3T3 og OKF6-Tert1R cellelinjer i nærvær av doksycyklin, noe som resulterer i øket vedhengende cellevekst i vill-type, BORIS ikke-uttrykkende NIH3T3, og OKF6-Tert1R cellelinjer. 3T3 celler hadde en 77% ± 34% vekst økning på dag tre. OKF6 cellelinjer hadde en 161% ± 78% vekst økning på dag tre (figur 7B). Viktigere, ble disse effektene sett når nivåene av
BORIS
uttrykk ble regulert til å være lik de nivåene funnet i primære svulster.
Denne effekten ble ikke sett med økt konsentrasjon av doksycyklin som induserte høye nivåer av
Boris
transkripsjoner. En analyse av vitnemål viste at uttrykk for syv av ni mål gener øker betydelig hos OKF6-Tert1R celle uttrykker BORIS (figur 7E). For å teste om BORIS uttrykt ved lave nivåer kan bidra til transformasjon, studerte vi NIH3T3 celler for forankringsuavhengig vekst. Etter 12 dager ble et betydelig antall kolonier (30 +/- 3) observert i tester av BORIS-uttrykkende celler men ikke i celler transfektert med et plasmid kontroll (figur 7C).
Til slutt, for å teste muligheten som BORIS kan være forbundet med epigenetiske endringer samt transcriptional oppregulering av våre målgener, vi kvantitativt analysert for metylering status av de kandidat proto-onkogener etter BORIS transfeksjon og bemerket at seks av ni mål (C19 ORF28, GPR17, GRIN1, MAGEA2 , MAGEA3 /6, og MAGE11) viste en større enn 100% økning i demetylert arrangøren så tidlig som 48 timer etter induksjon av BORIS (figur 7D).
Diskusjoner
dataene presentert ovenfor indikerer at HNSCC og NSCLC gjennomgå aktivering av kandidat proto-onkogener med tilhørende demetylering på en koordinert måte i enkelte svulster. Vi var i stand til å demonstrere transformasjon assosierte effekter av BORIS uttrykt ectopically i BORIS-negative cellelinjer samt veksteffekter med individuelle mål gener som har vist seg å være epigenetiske aktivert og uttrykt av BORIS. Men dette betyr ikke utelukke bidrag som ennå uidentifiserte gener til BORIS relaterte effekter eller en samarbeidende effekt mellom identifiserte målgener.
