Abstract
Prostatakreft er en veldig vanlig kreft blant menn. Tradisjonelle behandlinger for prostata kreft har begrenset effekt; Derfor må nye terapeutiske strategier og /eller nye adjuvant medikamenter bli utforsket. Red gjær ris (RYR) er en tradisjonell mat krydder laget i Asia av fermen hvit ris med
monascus purpureus
Gikk gjær. Samle bevis indikerer at RYR har antitumor aktivitet. I denne studien ble PC-3 celler (menneskelige prostata kreft celler) som brukes til å undersøke anti-kreft effekt av ioniserende stråling (IR) kombinert med monascuspiloin (MP, et gult pigment isolert fra
monascus pilosus M93 Anmeldelser – gjæret ris) og for å bestemme de underliggende mekanismene for disse effektene
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant ut at IR kombinert med MP viste økt terapeutisk effekt sammenlignet med hver behandling alene i PC-3 celler. I tillegg er den kombinerte behandling forbedrede DNA-skade og endoplasmatisk retikulum (ER) stress. Den kombinerte behandling induseres primært autophagy i PC-3-celler, og den celledød som ble indusert ved den kombinerte behandling var hovedsakelig et resultat av inhibering av Akt /mTOR signalveier. I en
in vivo
studie viste kombinasjonsbehandlingen større antitumorvekst effekter. Disse nye funn tyder på at den kombinerte behandling kan være et potensielt terapeutisk strategi for prostatakreft
relasjon:. Chiu H-W, Fang W-H, Chen, Y-L, Wu M-D, Yuan G-F, Ho S-Y, et al. (2012) Monascuspiloin Forbedrer Stråling Sensitivity of Human prostata kreft celler ved å stimulere endoplasmic nettet Stress og Induksjon Autophagy. PLoS ONE syv (7): e40462. doi: 10,1371 /journal.pone.0040462
Redaktør: Kevin Camphausen, NIH, USA
mottatt: 17 april 2012; Godkjent: 18 mai 2012; Publisert: 03.07.2012
Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Food Industry Research and Development Institute og økonomisk støtte (101-EC-17-A-01-04-0525) av Ministry of Economic Affairs, National Science Council, Taiwan (NSC 100-2314-B- 006 -055), den Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan, Food and Drug Administration, Avdeling Executive Yuan (DOH101-FDA-41301) og satse på Top Universitetet Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Red gjær ris (RYR), også kjent som rød Koji eller «Hongqu», består hovedsakelig nonglutinous ris, rød gjær, og biprodukter av gjæring. RYR er en tradisjonell mat krydder som forbrukes i hele Asia [1]. Den er produsert av fermen mat sopp, en
Monascus
arter, med kokt ris og har vært brukt i mer enn 600 år å produsere viner og andre gjærede matvarer. Flere arter av sopp
monascus
har vært mye brukt i å lage rødvin og rødt soya ost [2].
Monascus
-fermented produkter har mange funksjonelle sekundære metabolitter, inkludert Monacolin K, citrinin, ankaflavin, og monascin. På flere nyere studier, disse sekundære metabolitter vist anti-inflammatorisk, anti-oksyderende, og antitumor-aktivitet [3], [4]. Mange studier har også undersøkt den anti-kreft evne av RYR, så som i tykktarm, bryst, lunge og prostata cancer [3]. Klassene av polyketide strukturer som følge av gjæringsprosessen kalles monacolins, og de store Monacolin funnet i RYR er Monacolin K [5]. Imidlertid RYR viste en mer potent inhibering av kreftcellevekst sammenlignet med Monacolin K [6], [7]. Imidlertid kan de andre polyketider i RYR gi en botanisk tilnærming til kreftbehandling som er verdig til videre undersøkelser.
Prostatakreft er verdens vanligste kreftformen og den nest største årsaken til død av kreft [8]. Tidlige stadier av prostatakreft er androgen-avhengig og kan behandles effektivt med androgen ablasjon, stråling og /eller kirurgi. Men prostata kreft celler videre til en androgen-uavhengig stat hvor de kan utvikle seg og føre til metastasering og død [9]. Fordi kjemoterapi og strålebehandling er stort sett ineffektiv og metastatiske sykdommer ofte utvikle selv etter operasjonen, det er begrenset behandlingstilbud tilgjengelig for prostatakreft [10]. Derfor må nye fremgangsmåter for behandling av prostata cancer bli utviklet. Akkumulerende bevis har vist at ervervet resistens mot strålebehandling kan overvinnes ved å benytte små-molekyl-forbindelser som er rettet mot sentrale proteiner involvert i strålingsmotstanden [11]. Anticancer terapeutiske tilnærminger som ioniserende stråling (IR), kan aktivere mobilnettet apoptotisk maskiner i androgen-uavhengig prostatakreftceller [12]. Imidlertid kan ervervet stråling resistens utvikler seg i hormon ildfaste prostatakreft som er assosiert med apoptose motstand [13]. Tidligere studier har også vist at mangler ved apoptotisk maskiner er korrelert med motstand av kreftceller til dagens terapeutiske intervensjoner, inkludert IR [14].
Autophagy er en viktig katabolsk prosess ansvarlig for nedverdigende og gjenvinning langlivede proteiner, cellulære aggregater og ødelagte organeller. I tillegg til den godt dokumentert rolle autophagy i celleoverlevelse, har en funksjon for autophagy i celledød lenge vært foreslått [15]. De siste årene har rollen autofagi som et alternativ celledød mekanisme vært et tema for debatt. Studier pågår for å definere optimale strategier for å modulere autofagi for kreft forebygging og behandling, og for å utnytte autofagi som et mål for anticancer stoffet funnet [16]. Aktivering av PI3 kinase /Akt vei, en velkjent metode for å hemme apoptose, også hemmer autophagy [17]. Akt fosforylerer pattedyr målet for rapamycin (mTOR), som har blitt rapportert å hemme induksjon av autophagy [18]. Tidligere studier har vist at det endoplasmatiske retikulum (ER) stressrespons, i kombinasjon med autofagi, representerer en adaptiv mekanisme for å understøtte celleoverlevelse som respons på et stort utvalg av uheldige betingelser [19]. ER stress aktiverer et sett med signalveier som er kollektivt betegnet utbrettet Protein Response (UPR). Vanligvis fremmer UPR signalecelleoverlevelse ved å forbedre balansen mellom proteinet belastning og folde kapasitet i ER [20]. Imidlertid, hvis cellene er utsatt for langvarig eller robust ER stress, cellene dør ved apoptose [21]. Økende bevis har indikert at ER stress er også en potent trigger av autofagi [22]. Således, en bedre forståelse av de signalveier som kontrollerer ER stress-indusert autofagi og cellulær skjebne forhåpentligvis vil åpne nye muligheter for behandling av kreft.
(A) Kjemisk struktur av MP. (B) konsentrasjonsavhengig effekt av MP på levedyktigheten til PC-3 celler. Celler ble behandlet med 5, 15, 25, 35 eller 45 uM MP i 48 timer. *,
p
0,05, MP versus kontroll. (C) Cytotoksiske effekter i celler behandlet med IR (4 Gy) og /eller universal (25 uM). #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, MP versus kombinert behandling. (D) De strålingsdoserespons overlevelseskurvene for PC-3-celler med eller uten MP. Data er presentert som gjennomsnittet ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
Monascuspiloin (MP), et gult pigment først isolert ved vår gruppe fra
Monascus pilosus M93
-fermented ris, er et strukturelt ligner den velkjente
monascus
pigment monascin. Men mekanismene bak effekten av MP i kombinasjon med IR på prostatakreft er i stor grad ukjent. I denne studien ble det PC-3 celler (androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft celler) som brukes til å undersøke anti-kreft effekt av IR kombinert med MP
in vitro Hotell og
in vivo
. De typer av celledød indusert av IR når de kombineres med MP ble undersøkt. Vi har også undersøkt de mulige mekanismene bak celledød indusert av IR og /eller MP i PC-3 celler.
Gy) og MP (25 mm). De haler viser DNA-skader. (B) Effekten av MP eller IR alene eller i kombinasjon i 48 timer i gjennomsnitt hale-DNA. #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, MP versus kombinert behandling
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige prostatakreft cellelinje. PC-3 (ATCC CRL-1435) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplert med antibiotika inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, New York) og 10% føtalt bovint serum (HyClone, sør Logan, UT, USA). Cellene ble inkubert i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Eksponentielt voksende celler ble løsnet ved bruk av 0,05% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) i RPMI 1640-medium.
(A) Tidlig apoptose, påvises ved hjelp av Annexin V apoptose deteksjon kit, ble målt ved bruk av strømnings cytometri. Celler ble behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 uM) i 48 timer. (B) Utvikling av AVOS i PC-3 celler. Påvisning av grønn og rød fluorescens i AO-fargede celler ved hjelp av flowcytometri. (C) Kvantifisering av avos med AO-fargede celler behandlet med IR (4 Gy) eller MP (25 uM) alene eller i kombinasjon ved hjelp av flow cytometri. #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, MP versus kombinert behandling. Data er presentert som gjennomsnittet ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. (D) EM mikrofotografier av PC-3-celler behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 uM) i 48 timer.
hvite piler
poeng å autophagic vakuoler og autolysosomes. (E) Western blotting for LC3-I, LC3-II, p62 /SQSTM1 og Atg5-12 i PC-3 celler. Cellene ble behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 mm) i 48 timer.
Mikroorganisme og utarbeidelse av monascuspiloin (MP)
monascus pilosus M93
ble hentet fra BCRC, FIRDI (Hsinchu, Taiwan) og vedlikeholdes på potet dekstrose agar (PDA, Difco). Stammen ble sådd ut på PDA-plater og dyrket ved 25 ° C i 7 dager. Sporene ble så vasket ut fra PDA-platen ved hjelp av sterilt vann og konsentrasjonen av den resulterende sporesuspensjon ble justert til 1 x 10
6 /ml. Ved å følge sporene berikelse trinn, ble 1 ml sporesuspensjon ble inokulert i 250 ml rysteflasker inneholdende 50 ml rgy medium (3% risstivelse, 7% glycerol, 1,2% polypepton, 3% soyabønnepulver, 0,1% MgSO
4 og 0.2 % nano
3) og dyrket med rysting (150 rpm) ved 25 ° C i 3 dager for å oppnå mycel av kjøttkraft M93. For produksjon av RYR, femti 450 ml glassflasker, hver inneholdende 75 g ris og 75 ml D.I. vann, ble sterilisert i 20 minutter ved 121 ° C. M93 mycelium buljong (7,5 ml) og rgy medium (7,5 ml) ble tilsatt til hver flaske. De bottltes ble deretter inkubert ved 25 ° C i 21 dager (7,5 ml rgy medium ble tilsatt til hver flaske på 10
th dags inkubering), og innholdet ble deretter lyofilisert for å fjerne vann. Den RYR (1 kg) ble ekstrahert ved bruk av 95% etanol (3 liter) ved 25 ° C i 24 timer, og etanolen ble fjernet ved vakuumtørking for å oppnå den urene RYR ekstrakt. Mengden av MP i de rå ekstraktene ble målt ved bruk av HPLC med en stjerne Purospher® RP-18-kolonne (Merck). Den mobile fasen besto 60% acetonitril inneholdende 0,1% fosfat ved en strømningshastighet på 1,0 ml /min. Den RYR (1 kg) ble deretter ekstrahert med 70% etanol (3 liter) ved 25 ° C. Etter filtrering ble etanolen ekstraktet konsentrert og etylacetat (EA) ble tilsatt for å oppnå en EA-løselige fraksjon. EA-løselige fraksjon var injeksjon i en silikagel-kolonne (70-230, 230-400 mesh, Merck) og eluert ved anvendelse av n-heksan /etylacetat (02:01). For å oppnå MP, ble den eluerte fraksjon ble konsentrert under redusert trykk og renset ved hjelp av preparativ tynnsjiktkromatografi (silikagel 60 F-254, Merck) med
n
heksan /EtOAc (02:01).
Gy) og /eller MP (25 mm) i 48 timer.
Optiske rotasjoner ble målt ved hjelp av en Jasco P-1020 digital polarimeter. UV-spektra ble oppnådd i MeOH ved hjelp av en Jasco UV-240 spektrofotometer, og IR-spektra (KBr eller ublandet) ble oppnådd ved anvendelse av et Perkin-Elmer System 2000 FT-IR-spektrometer. 1D (
1 H,
13C, DEPT) og 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) NMR spektra bruker CDCh
3 og CD
3OD som løsemidler, ble registrert med en Varian Unity Plus 400 (400 MHz for
1H-NMR, 100 MHz for
13C NMR) og Varian INOVA-500 (500 MHz for
1H-NMR, 125 MHz for
13C NMR) spektrometer. Kjemiske skift ble referert til de interne signaler i oppløsningsmiddel CDCh
3 (
1 H, δ 7,26;
13C, δ 77,0), og TMS ble anvendt som intern standard. Lav oppløsning ESI-MS spektra ble oppnådd ved hjelp av en API 3000 (Applied Biosystems), og høy oppløsning ESI-MS spektra ble obstained bruker en Bruker Daltonics APEX II 30e spektrometer.
Gy) eller MP (1 mg /kg x 6) alene eller i kombinasjon. (A) Kroppsvekt i nakne mus, målt en gang per uke. (B) Tumorvolumet i nakne mus, målt hver annen dag. Data er presentert som den relative tumorvolum (gjennomsnitt ± standardfeil) normalisert til den opprinnelige tumorvolum målt på dag 0. (C) Direkte observasjon av mus med tumorer. Følgende eksperimenter, ble musene avlivet og tumorene ble fjernet. (D) Måling av tumorvekt i naken mus etter offer. (E) Immunhistokjemisk (IHC) og hematoxylin og eosin (H E) farging av PC-3 mus xenograft vev. IHC ble anvendt for å bestemme uttrykket nivåer av LC3 og p62 /SQSTM1 (x 100 objektiv forstørrelse).
MP, isolert som en gulaktig olje, ble tilordnet molekylformelen C
21H
28O
5NA av ESI-MS ([m + Na]
+
m /z
383) og HR-ESI-MS ([m + Na]
+
m /z
383,1832). MP var lik den av en kjent forbindelse, monascin ble strukturen av MP bestemt til å være (3
S
,3a
R
,9a
R
)-3a,4-dihydro-3-((
S
)-1-hydroxyhexyl)-9a-methyl-6-((E)-prop-1-enyl)-3
H
-furo [3, 2-
g
] isochromene-2,9 (8
H
, 9a
H
) -dion (Fig. 1a).
Bestråling behandling og celleviabilitet analysen
IR ble utført med 6 MV røntgen ved hjelp av en lineær akselerator (Digital M Mevatron Accelerator, Siemens Medical Systems, CA, USA) ved en dose på 5 Gy /min. Ytterligere 2 cm av et vev-ekvivalent bolus ble plassert på toppen av plast vev-kulturflasker for å sikre elektroniske likevekt, og 10 cm av vev-ekvivalent materiale ble plassert under kolbene for å oppnå full tilbake-sprednings. De behandlede celler ble sentrifugert og resuspendert i 0,1 ml PBS. Hver cellesuspensjon (0,02 ml) ble blandet med 0,02 ml trypanblått-oppløsning (0,2% i PBS). Etter 1 eller 2 minutter, ble hver oppløsning plassert på et hemocytometer, og de blå fargede celler ble tellet som ikke-intakt.
klonogene assay
Cellene ble bestrålt ved bruk av 2, 4 eller 6 Gy. MP ble tilsatt til cellene ved konsentrasjoner på 15 eller 25 uM. Cellene ble trypsinisert og tellet. Kjente antall celler ble deretter sådd ut i 6 cm kulturskåler og returneres til inkubatoren for å tillate koloni utvikling. Etter 7 dager ble kolonier (inneholdende ≥50 celler) farget med 0,5% krystallfiolett oppløsning i 30 min. Pletterings effektivitet (PE) er forholdet mellom antallet av kolonier til antall celler utsådd i den ikke-bestrålt gruppe. Beregning av overlevelses fraksjoner (SFS) ble utført ved anvendelse av ligningen: SF = kolonier telles /(celler sådd x PE), med den enkelte PE
Bestemmelse av tidlig apoptose
Apoptose ble bestemt ved. kvantifisere translokasjon av fosfatidylserin til celleoverflaten, oppdaget med en Annexin V apoptose deteksjon kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA), i henhold til vår forrige rapport [23].
Comet assay
For å påvise DNA-skader i enkeltceller, vedtok vi en komet analysen. I korthet ble celler (2 x 10
4) ble oppsamlet etter behandlingene, og resuspendert i 0,2 ml PBS inneholdende 0,5% lavt smeltepunkt agarose. Åttifem ul av blandingen ble påført på objektglass, som deretter ble nedsenket i kald lyseringsoppløsning (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 (pH 10)). Elektroforese ble utført ved 300 mA og 25 V i 20 min. Etter elektroforese, ble objektglassene nøytralisert med 0,4 M kald Tris-HCl-buffer (pH 7,5) og deretter farget ved hjelp av etidiumbromid. Komet ble visualisert ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Olympus, Japan). DNA-skader ble undersøkt i 100 celler hvor halen øyeblikk (hale lengde multiplisert med brøkdel av DNA i halen) ble kvantifisert ved hjelp av Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.).
Supravital cellefarging med acridinoransje for påvisning av autofagi
Cell farging med acridinoransje (Sigma Chemical Co.) ble utført i henhold til publiserte prosedyrer [23].
elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC
Celler ble løst ved hjelp av en løsning inneholdende 2,5% glutaraldehyd og 2% paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Etter fiksering ble prøvene postfiksert i 1% OsO
4 i den samme buffer i 30 min. Ultratynne snitt ble deretter observert under et transmisjonselektronmikroskop (JEOL-JEM 1200EX, Japan) ved 100 kV.
Western blot-analyse
totalt celleprotein lysater ble fremstilt ved å høste celler i protein ekstraksjon buffer i 1 time ved 4 ° C, som tidligere beskrevet [24]. Tettheten av båndene ble kvantifisert ved hjelp av en datamaskin densitometer (AlphaImager
TM 2200 System Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). GAPDH ble anvendt som protein lasting kontroll. Antistoffer for påvisning av Akt, fosfor-Akt, fosfor-mTOR, fosfor-AMPK, AMPK og fosfor-p70S6K ble innhentet fra Cell Signaling Technology (Ipswich, MA, USA); anti-GAPDH ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-LC3 og anti-Atg5-12 ble oppnådd fra Abgent (San Diego, CA, USA); anti-p62 /SQSTM1 antistoff ble oppnådd fra MBL (Nagoya, Japan), og anti-mTOR og anti-p70S6K ble oppnådd fra Epitomics (Burlingame, CA, USA).
In vivo tumorvekstmålinger ved hjelp av PC- -3 svulst modell i naken mus
Alle forsøk på mus ble utført i henhold til retningslinjene for vårt institutt (guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, National Cheng Kung University). Bruken dyr protokollen oppført nedenfor er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (Godkjenning No: 99 138). Seks til åtte uker gammel mann naken mus (BALB /cAnN.Cg-Foxn1
nu /CrlNarl) ble kjøpt fra National Laboratory Animal senter (Taiwan). Dyrene ble plassert fem i hvert bur ved 24 ± 2 ° C og 50% ± 10% relativ fuktighet og underkastet en 12-timers lys /12-timers mørk syklus. Dyrene ble akklimatisert i en uke før starten av forsøkene og matet med et Purina Chow diett og vann ad libitum. Svulster ble indusert ved subkutan (s.c.) injeksjon av PC-3 celler (2 × 10
6 celler i 0,1 ml PBS) på ett område av høyre flanke. Svulster (visualiseres som små knuter på nettstedene til injeksjon) dukket opp ~ 7 dager etter injeksjon, og dyrene ble tilfeldig fordelt i hver gruppe. Mus ble behandlet med: (1) bærer (maisolje), (2) 1 mg /kg MP tre ganger per uke i to uker, (3) en enkelt dose av 6 Gy IR, eller (4) en kombinasjonsbehandling som omfatter ett mg /kg MP tre ganger per uke i to uker initiert umiddelbart etter en enkeltdose på 6 Gy IR. Mus kroppsvekt ble målt en gang i uken og ble brukt som en indikator for systemisk toksisitet av behandlingen. Tumorvekst ble målt hver to dager, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen vist nedenfor, [25]:
tumor volum (mm
3) = større diameter (mm) × liten diameter (mm )
2/2
data er uttrykt som den relative tumorvolum sammenlignet med forbehandling volum målt på dag 0. tumorvolum firedobling tid (TVQT, i dager) ble bestemt ved en best-fit regresjon analyse. Den tumorvekstforsinkelse (TGD) Tiden er definert som differansen mellom den TVQT av de behandlede tumorer sammenlignet med den ubehandlede kontrolltumorer. Den TVQT og TGD tid ble beregnet for hver enkelt mus, og deretter midlene ble samlet i hver gruppe. Tumorvekst inhibering ble beregnet som følger: a. Inhibering (%) = (gjennomsnittlig tumorvolum av ubehandlede kontrollmus – tumorvolum av behandlede mus) /bety tumorvolum av ubehandlede kontrollmus x 100
Immunhistokjemisk (IHC) flekker analyse
Parafin-vevssnitt (4 mikrometer) ble tørket, deparaffinized, og vannes ut. Etter mikrobølge forbehandling i citrat-buffer (pH 6,0; for antigen gjenfinning), ble platene neddykket i 3% hydrogenperoksid i 20 minutter for å blokkere aktiviteten til endogen peroksidase. Etter intensiv vasking med PBS, ble objektglassene inkubert over natten ved 4 ° C med anti-LC3 og anti-p62 /SQSTM1 (MBL, Japan) antistoffer. Snittene ble deretter inkubert med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur, og objektglassene ble utviklet ved hjelp av Starr Trek Universal HRP deteksjonssett (Biocare Medical, Concord, CA). Til slutt ble de lysbildene kontra hjelp hematoxylin. Hver side ble skannet på lav effekt (× 200).
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av Students t-test for sammenligning mellom de midler eller enveis analyse av varians med post-hoc Dunnetts test [26]. Forskjeller ble ansett for å være av betydning når p. 0,05
Resultater
cytotoksiske effekter og overlevelseskurver av MP og IR behandlet alene eller i kombinasjon med PC-3 celler
levedyktighet av cellene ble observert ved forskjellige konsentrasjoner av MP (0 til 45 uM) i 48 timer (fig. 1B). MP alene redusert levedyktighet av cellene i en konsentrasjonsavhengig måte. Etter behandling med 25 uM MP i 48 timer, levedyktigheten av PC-3-celler ble redusert til 60%. Figur 1C viser levedyktigheten til MP og IR behandles alene eller i kombinasjon på PC-3-celler. Vesentlig forbedret toksisitet ble funnet for den kombinerte behandlingen sammenlignet med MP og IR behandling alene i PC-3 celler. Videre viser figur 1D strålingsdoserespons overlevelseskurver for PC-3-celler med eller uten MP behandling. Overlevelseskurver dramatisk forskjøvet nedover. MP (15 eller 25 mm) økt IR-indusert klonogene celledød i PC-3 celler. MP betydelig redusert overlevelse fraksjonen på en doseavhengig måte sammenlignet med IR alene.
DNA skade bestemmes av komet analysen og ekspresjon av ER stress-relaterte proteiner i PC-3-celler behandlet med MP og IR alene eller i kombinasjon
IR spiller en nøkkelrolle i kreftbehandling grunn av sin evne til å direkte indusere DNA-skade [27]. Den komet assay er et følsomt verktøy for estimering av DNA-skade og reparasjon på cellenivå, som bare krever et lite antall celler [28]. I komet assay for PC-3-celler, en begrenset eller ingen hale ble funnet i de ubehandlede kontroller, mens halen vokste etter bestråling og kombinert behandling (Fig. 2A). Halen lengde økte signifikant etter IR (4 Gy) sammenlignet med kontroller (fig. 2B). Vesentlig forbedret DNA-skader ble funnet for den kombinerte behandlingen sammenlignet med IR alene. Disse resultatene antydet at DNA-skade var involvert i anti-proliferative effekter av kombinert behandling i PC-3 celler. I tillegg viser nyere bevis at en av mekanismene hvorved IR aktiverer ER stress og UPR er ved induksjon av DNA-skade [29]. Derfor, for å påvise ekspresjon av ER stress-relaterte proteiner, utførte vi western blotting med lysater fra PC-3-celler som mottar hver av de forskjellige behandlingene (Fig. 2C). Våre resultater viste at IRE1α og fosforylering av eIF2α økt med kombinasjonsbehandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene, noe som bekrefter at den kombinerte behandlingen indusert ER stress i PC-3 celler.
Måling av apoptose og autofagi i PC- 3-celler behandlet med MP og IR alene eller i kombinasjon
Som vist i figur 3A, tidlig apoptose i PC-3-celler ble målt ved flowcytometri med Annexin V apoptose deteksjon kit. Kvantitative resultater viste at forekomsten av tidlig apoptose i PC-3-celler behandlet med MP og /eller IR var lav. Dermed vi videre analysert som type II programmert celledød (autofagi). Det er preget av dannelsen av mange sure vesikler, som kalles sure vesikulær organeller (AVOS) [30]. Acridinoransje (AO) farging ble kvantifisert ved hjelp av flowcytometri (fig. 3B, 3C). En betydelig økning i AO-positive celler ble funnet i celler som fikk den kombinerte behandlingen med sammenlignet med de som ble behandlet med IR- eller MP alene. Videre ble ultrastructures av PC-3 celler for hver behandlingsgruppe observert av EM fotomikrografi (Fig. 3D). Den kombinerte behandlingen resulterte også i et stort antall autophagic vakuoler og autolysosomes i cytoplasma. I tillegg var det ingen kromatin kondens eller kjerne pyknosis, noe som er karakteristisk for apoptose, forekom i noen av behandlede celler. For å detektere ekspresjonen av autophagy-relaterte proteiner, utførte vi western blotting med lysater fra PC-3-celler som mottar hver av de forskjellige behandlinger (fig. 3E). Uttrykket nivåer av LC3-II, p62 og Atg5-12 proteiner økt med kombinasjonsbehandling, noe som tyder på at den kombinerte behandlingen indusert autofagi i PC-3 celler.
Den Akt /mTOR signalveien er involvert i den kombinerte behandlingen indusert autofagi i PC-3 celler
Tidligere studier har vist at Akt /mTOR veien er involvert i regulering autofagi [31]. Derfor, for å undersøke om Akt /mTOR signalveien var involvert i den kombinerte behandlings indusert autofagi, utførte vi western blotting å påvise protein fosforylering tilstand (Fig. 4). Fosforylerte proteiner som er involvert i Akt /mTOR signalveier ble også undersøkt. Fosforylering av Akt, mTOR og p70S6K redusert i celler behandlet med kombinasjonsbehandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene.
Tumor vekst i hårløse mus ble undertrykt av IR og MP
Vi neste evaluert anti-tumorvekst effekten av IR og MP
in vivo
. Svulster ble indusert ved s.c. injeksjon av PC-3-celler i nakne mus. Vi målte kroppsvekten til musene på ukentlig basis, og tumorvolumet hver andre dag. Resultatene av denne studien viste at ingen av de behandlingsregimer produsert noe tap av kroppsvekt, noe som kan være et tegn på toksisitet (Fig. 5A). Den kombinerte behandling undertrykte tumorvolum, og tumorvekten i nakne mus, sammenlignet med MP eller IR-behandlinger alene (fig. 5B, 5C, 5D). Som vist i tabell 1, ble tumorvolumet firedobling tid (TVQT) for kontrollgruppen målt på dag 10 (10,3 ± 2,4). Den tumorvekstforsinkelse (TGD) tid for 10 dagers behandling av MP alene var 10,4 ± 4,2 dager, som var betydelig annerledes enn for kontrollgruppen (
p
0,05). IR alene produsert en TGD tid på 17,8 ± 6,2 dager (
p
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen). Den kombinerte behandlingen resulterte i en TGD tid med 52,3 ± 7,1 dager (
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen eller MP alene). Kombinasjonsterapi av IR og MP resulterte i en tumorvekst-inhibering på 71% på dag 10. Således, den kombinerte behandling i besittelse av anti-tumorvekst effekt
in vivo
.
Deretter histologisk undersøkelse ble analysert ved hematoxylin og eosin (H & Co. E) farging (figur 5E.). Svulsten av kombinert behandling var sammensatt av celler med den nedre kjerne-til-cytoplasma-forhold enn MP eller IR-behandling alene. Videre ble LC3 og p62 uttrykk mønstre i PC-3 svulster undersøkt ved hjelp av IHC farging. LC3 og p62 ble økt i svulster fra mus behandlet med kombinasjonsbehandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene.
Diskusjoner
Nylig ble det rapportert at RYR, en tradisjonell kinesisk mat urt og moderne kosttilskudd, demonstrerte
in vitro
effekter, inkludert hemming av proliferasjon og stimulering av apoptose i humane tarmkreftceller [6]. I tillegg RYR betydelig redusert tumorvolumer av prostata xenografttumorer [32]. Kombinasjonen av IR med andre midler som oppnår radiosensitizing potensialet har blitt viktige tiltak for pasienter med prostatakreft [33]. Tidligere studier har også vist at naturlige produkter som de nye radiosensibiliserende midler for behandling av hormon ildfaste prostata kreft som er resistent mot strålebehandling [11], [34]. I denne studien, viste vi for første gang at MP sensitizes menneskelige prostata kreft PC-3 celler til IR både
in vitro Hotell og
in vivo
i naken mus xenograft modell (fig. 1, 5). For de fleste av historien til kreftterapi, ble apoptose antatt å være den eneste mekanismen for medikament-indusert celledød. Mer nylig er det blitt rapportert at en type II programmert celledød, autophagy, kan delta i cancerterapi-indusert kreft celledød. Nylige funn, inkludert vårt laboratorium, har antydet at aktivert autophagy er en tumor suppressor [23], [24], [35]. Her, PC-3 celler behandlet med kombinasjonsbehandling indusert autofagi potensielt skjedde da apoptotiske sti av PC-3 celler ble blokkert (Fig. 3). I
in vivo
studie av PC-3 xenografttumorer, LC3 og p62 ble økt etter den kombinerte behandlingen (Fig. 5E).
Stråling spiller en nøkkelrolle i behandlingen på grunn av sin evne til direkte indusere DNA-skade, spesielt DNA dobbel-tråd pauser, og dermed fører til celledød [27]. I denne studien, ble betydelig forbedret DNA-skade som finnes i den kombinerte behandlingsgruppen sammenlignet med IR- eller MP alene (fig. 2A, 2B). Imidlertid detalj av den mekanisme er ennå ikke fullt ut forstått. Det er mulig at MP forstyrrer behandlingen og reparasjon av IR-indusert DNA dobbelttrådbrudd. Alternativt MP kan virke forstyrrende på en post-reparasjon trinn med selve reverseringen av γH2AX, slik som defosforylering eller degradering og /eller et histon utveksling av γH2AX [36]. Nyere bevis viser at en av mekanismene hvorved IR aktiverer ER stress er induksjon av DNA-skade [29]. Dermed kan dobbelttrådet DNA pauser tjene som en kobling mellom IR og ER stress aktivering. Våre resultater viste at IRE1α og fosforylering av eIF2α økt med kombinasjonsbehandling, noe som indikerer at kombinert behandling indusert ER stress i PC-3 celler (Fig. 2C). ER-stress kan aktivere signalveier involvert i apoptose og autofagi [22].
