Abstract
Omorganisering av cytoskjelettet via aktin ombygging er en grunnleggende trinn i cellebevegelse. Selv om cellemigrering fra normale celler og kreftceller kan stimuleres av en rekke av intra- og ekstra-cellulære faktorer, alle veier endelige på regulering av cofilin aktivitet. Cofilin er en liten actin-bindende protein i stand til å binde begge former for aktin, kuleformet og filament, og er regulert ved fosforylering ved Serine 3. Etter fosforylering ved serin 3 cofilin er inaktiv, kan derfor ikke binde aktin-molekyler og cytoskjelettet remodeling er svekket. Den histone metyltransferase EZH2 er ofte over til uttrykk i mange tumortyper, inkludert tykktarmskreft (CRC). EZH2 overaktivitet, noe som resulterer i epigenetisk gen-stanse, har vært forbundet med mange tumor egenskaper inkludert invasjon, angiogenese og metastasering, men lite er kjent om under molekylære mekanismene. Heri, rapporterer vi at EZH2 er i stand til å kontrollere cofilin aktivitet og dermed cellebevegelse av CRC cellelinjer gjennom en ikke-konvensjonell roman aksen som innebærer intesignalering. Faktisk viser vi hvordan genetiske og farmakologisk hemming (DZNep og GSK343) av EZH2 funksjon produserer hyper fosforylering av cofilin og reduserer celle migrasjon. Vi har tidligere demonstrert av kromatin immuno-nedbør som Inte alfa 2 (ITGα2) uttrykk er regulert av EZH2. I den foreliggende undersøkelse gir vi bevis på at i EZH2-stilnet celler signaleringsaktiviteten av det de-trykt ITGα2 er i stand til å øke cofilin fosforylering, noe som i sin tur reduserer cellemigrering. Denne studien foreslår også nye mekanismer som kan gi nye anti-metastatiske strategier for CRC behandling basert på hemming av epigenetisk faktor EZH2 og /eller sitt mål genet
Citation. Ferraro A, Boni T, Pintzas A ( 2014) EZH2 Regulerer Cofilin aktivitet og tykktarmskreft cellevandring ved målretting ITGA2 Gene. PLoS ONE 9 (12): e115276. doi: 10,1371 /journal.pone.0115276
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 6 august 2014; Godkjent: 20 november 2014; Publisert: 30.12.2014
Copyright: © 2014 Ferraro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av EU FP7 innvilger FP7-241783 EpiDiaCan til AP
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Tumor celle migrasjon er viktig for metastatisk evne oppkjøp [1], [2]. Migrasjon kompetanse krever aktivering av signalveier som konvergerer til aktin polymerisasjon og de-polymerisering som kjører dannelsen av spesielle celle-membran fremspring som lamellipodia, invadopodia og filopodia. Actin dynamikk blir regulert av en rekke actin-bindende proteiner, deriblant actin-depolymerisering faktor (ADM), cofilin-1 (ikke-muskel-type) og cofilin-2 (muskel type) er de som tillater cellebevegelse gjennom den ovenfor beskrevne membran struktur [3], [4]. Siden cofilin-en er den mest utbredte formen for aktin-bindende proteiner, i denne studien analyserte vi bare denne typen, og her vi referere til det som cofilin. Cofilin aktiverings er et viktig skritt for tumorcellevandring [5], [6], selv om det, mest sannsynlig er det samlede aktiviteten av cofilin regulerende trasé som driver motiliteten av kreftceller [4]. Flere mekanismer for regulering cofilin er kjente [3], [4]. Den best karakteriserte er gjennom fosforylering ved Serine 3 (p-cofilin) ved LIM kinase 1 og 2 (LIMK1, LIMK2) [7], ved testikkel proteinkinase 1 og 2 (TESK1, TESK2) [8], og ved å de-fosforylering ved serin 3 av fosfatase sprettert (SSH) og chronophin [9], [10]. Fosforylering ved serin 3 inaktiverer cofilin, og hindrer dens binding til de store substrater kuleformet-aktin (G-aktin) og filament-aktin (F-aktin) [11], mens de-fosforylering ved Serine 3 tillater substratbindende og F-aktin skille . Flere signalmekanismer styre cofilin funksjoner og dermed celle-form og -locomotion. De varierer fra Rho familien små GTPases opptrer på LIMKs, til inte-mediert signale handler på TESK1 /2 [12]. SSH fosfatase kan aktiveres av F-aktin, 14-3-3 proteiner, PKDs og ved PLCβ /PI3Kγ-gsk3 signalveien [12].
Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2) tilhører polycomb gruppe familien [13] og er den katalytiske subenhet av histon-metyltransferase kompleks kalt Polycomb Undertrykkende kompleks 2 (PRC2). PRC2 binder seg til målet genet arrangører for epigenetisk undertrykkelse via di- eller trimethylation av histon H3 på lysin 27 rest (H3K27me2-3). EZH2 over-uttrykk er forbundet, i mange aggressive svulster [14], [15], med dårlig prognose [16] og tilstedeværelse av fjernmetastaser ved kolorektalkreft (CRC) [17]. EZH2 downregulation kan redusere veksten av invasiv brystkreft [18], tumor angiogenese [19] og
in vitro
celle migrasjon /invasjon av CRC cellelinjer [17].
veldefinert arkitektur epitelvev, slik som kolon mukosa, i stor grad er avhengig av ekspresjonen av spesifikke celleoverflate-adhesjons-molekyler slik som integriner, som interagerer med ekstracellulære matriks (ECM) og nabocellene. Pattedyr-genomet koder for 18 α- og 8 β-integrin-subenheter, som i kombinasjon fremstille 24 forskjellige integrin (α-β-) heterodimerer uten dobbeltfunksjoner som varierer fra ekstracellulære kollagenreseptorer til signaltransduksjon mediatorer [20]. Endringer i inte uttrykk forekommer i mange krefttyper og om inte fungere kun som tumor forsterkere eller tumor suppressors er fortsatt debattert. ITGα2 danner heterodimerer med ITGβ1 -α2β1- og samhandler med ECM er kollagenfibre [20]. Det har blitt rapportert at integrin α2β1 er i stand til å blokkere celleformering [21] – [23], og for å undertrykke metastase hos mus og mennesker [24]. I prostata cancer, har ITGα2 nedregule blitt foreslått som potensielle tumor markør [25]. Vi har nylig vist at EZH2 epigenetiske undertrykker ITGα2 uttrykk [17]. Interessant, under karakterisering av det nyetablerte EZH2-forstummet cellelinje (kalt HCT-shez-2), en bemerkelsesverdig hyper-fosforylering av cofilin i HCT-shez-2 i forhold til HCT116 foreldre celler ble oppdaget.
Selv cofilin funksjonen har blitt beskrevet i tumorcellebiologi, regulatoriske nettverk som integrerer epigenetiske faktorer, deregulering av signaltransduksjonsveiene og cofilin aktivitet er dårlig beskrevet. Her viser vi at histone metyltransferase EZH2 kontroller cofilin fosforylering, og dermed cellebevegelse, gjennom en roman bane som involverer ITGα2 og dets signalomformingsaktivitet.
Materialer og metoder
Cell kultur
Caco-2, DLD-1, HT-29, HCT116 og RKO cellelinjer ble holdt i DMEM-medium, inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1X penicillin, 1X streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Celler ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i fuktig atmosfære. Alle cellelinjer som benyttes i studien har blitt kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Kloningsprosedyren for HCT-shez-2-cellelinjen er beskrevet i Ferraro et. al. [17].
Western blot og antistoffer
Total-protein ble ekstrahert med 60 ul RIPA lysebuffer og Western blotting ble utført i henhold til standard protokoller. Blottene ble inkubert over natten ved 4 ° C med de passende primære antistoffer. Antistoffer brukes: EZH2 BD Bioscience, USA kode 612667; fra Millipore, USA H3K27me3 kode 07-449; RAC-1 kode 05-389; fra Santa Cruz, Tyskland: H3 total kode sc-8654; Tubulin kode sc-8035; ITGα2 kode sc-74466; RhoA kode sc-418; ROCK1 kode sc-17794; Cdc42 kode sc-87; p-cofilin (Serine 3) kode sc-12912-R; cofilin sc-33779; TESK1 kode sc-366681 (for å øke spesifisiteten av TESK1 antistoff i WB analyser nitrocellulose blotting membraner ble kuttet horisontalt mellom -60 og ~80 kDa). Proteinekstrakter er blitt fremstilt fra minst to uavhengige eksperimenter og blots gjentas minst to ganger.
Konfokalmikroskopi
Celler som brukes for immunofluorescens-analyser ble fiksert med metanol /acetonoppløsning (8:01), vasket, permeabilized med 0,3% Triton-X-100, og blokkert med 5% BSA før inkubasjon med primære antistoffer eller med Alexa Fluor 546 phalloidin (Invitrogen USA, kode A22283). Kjerner ble kontra med Hoechst.
hemmere og siRNA transfeksjon
ROCK-en inhibitor (Y-27632 Sigma, USA kode Y0503-1MG) ble brukt ved en sluttkonsentrasjon på 30 mikrometer i 24 timer . EZH2 inhibitorer (3-Deazaneplanocin A (DZNep) Santa Cruz, Tyskland kode sc-351 856; GSK-343 Aktiv Biochemicals, Hong Kong kode A-1416) ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 1, 3 og 5 uM i 48-72 timer . For siITGα2 transfeksjon ble cellene sådd i 6-brønners plater og transfektert med Lipofectamnine 2000, siEZH2_4 og siEZH2_7 (Quiagen, Tyskland koder SI00063973, SI02665166) siITGα2 (Quiagen, Tyskland koder SI02664081, SI02664088) og siRhoA (Dharmacon, USA kode L-003860 -00 til 0005) har blitt brukt på en endelig konsentrasjon på 50 mikrometer i henhold til produsentens instruksjoner.
tredimensjonal kultur
for tredimensjonale kultur Matrigel (BD, Bioscience) ble brukt . Poly-lysin pre-belagte dekkglass ble satt i 24-brønns plate. Matrigel ble fortynnet med kaldt komplett DMEM-medium til en sluttkonsentrasjon på 50%, ble 200 ul avsatt på hver brønn inneholdende dekkglass og platen ble inkubert ved 37 ° C i 15 «. 0,5 x 10
3-celler ble fortynnet i 100 ul kald DMEM og blandet med 100 ul av 100% Matrigel. De resulterende 200 ul ble tilsatt til brønnene med forvarmet Matrigel. Platen ble inkubert i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2 i 3 dager.
Migration assay
Cellene ble trypsinert, vasket med medium inneholdende 1% FBS, og tellet . 10
5-celler ble sådd inn i øvre kammer av en 8 um porestørrelse Transwell filter (Corning), montert i en 24-brønners skål inneholdende 10% FBS-medium. Filtrene ble pre-belagt med fibronektin. Celler ble tillatt å migrere ved 37 ° C, 5% CO
2 i 36-40 timer, fiksert med metanol og farget med 0,1% w /v krystallfiolett. Undersiden av filtre ble observert med 40X objektiv og trekkende celler ble bestemt i hver brønn. Forsøk ble utført i duplikat og gjentatt to ganger. For migrering analyse kombinert med siITGα2 transfeksjon ble cellene trypsinert 24 timer etter transfeksjon ble sådd på transwell og inkubert ved 37 ° C i andre 24 timer. For migrering analyse kombinert med ROCK1 inhibitor, ble cellene sådd ut på transwell i nærvær av inhibitoren, og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 24 timer.
Globular (G-) og filament (F) aktin assay
80-85% konfluente cellene ble vasket direkte på 15 cm petriskåler to ganger med PBS ved romtemperatur, skrapet inn PBS og pelletert. Cellepelletene ble resuspendert i 800 pl av 37 ° C lyseringsbuffer (1 mM ATP, 50 mM PIPES pH 6,9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 5% volum /volum glycerol og 0,1% vol /vol for: Nonidet P-40, Tween 20, og Triton X-100) supplementert med proteasehemmere. Celler ble homogenisert ved forsiktig pipettering 10 ganger opp og ned og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 16000 g i 75 min ved 22-25 ° C. Supernatanter ble fjernet for bestemmelse av G-aktin. Pellets inneholder F-aktin ble blandet med 800 mL av RIPA buffer og ultralydbehandlet på is i 5 min (30 sek. ON /30 sek OFF, maks effekt) ved hjelp Bioruptor ultrasonicator (Diagenode, Belgia) for å oppløse dem. Tyve mikroliter av hver fraksjon ble blandet med SDS-ladningsbuffer, denaturert i 8 minutter ved 95 ° C og applisert på polyakrylamidgel. Actin påvisning ble utført ved hjelp av en anti-aktin monoklonalt antistoff (kode sc-8432) som er kjøpt fra Santa Cruz, Tyskland.
RNA Utvinning /revers transkripsjon og Real Time PCR
Total RNA isolert fra dyrkede celler ble utført ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Revers transkripsjon ble utført fra 3,0 mikrogram av renset RNA bruker Super revers transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) etter produsentens anvisninger.
Sanntids kvantifisering på mRNA-nivået ble utført i 96-brønns PCR plater ved hjelp av en Bio-Rad iCycler og iQ5 Multicolor real-time PCR deteksjon system (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Hver reaksjonsblanding inneholdt 1 x iQ SYBR grønn Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og 150 nmol /L av hver primer. Alle gener ble testet i triplikater. Resultatene ble analysert på iCycler programvare. Verdiene ble normalisert til GAPDH. Primere som ble brukt var følgende: glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH): GAAGGTGAAGGTCGGAGT (FW) og CATGGGTGGAATCATATTGGAA (Rv); TESK1. GCCCTGACACACAATCAG (Fw) og AAGAGGTCTGACCGGCTTC (Rv)
GST rullegardin analysen
For Rac1-GTP og CDC42-GTP GST pull-down analysen ble cellene dyrket i 10 cm petri retter og cellelysatene ble forberedt med lysebuffer som brukes til western blotting. 50 ug av det samme proteinekstrakt ble inkubert med GST-PAK (p21-aktivert kinase) til glutation-agarosekuler i 1 time ved å rotere ved 4 ° C og kulene ble vasket 4 ganger i vaskebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin og 0,2 mM PMSF).
Resultater
Cofilin fosforylering øker ved genetisk taushet farmakologisk hemming av EZH2 i CRC cellelinjer
Vi har tidligere transfektert HCT116 kolon carcinoma celler med en kort hårnål RNA (shRNA) vektor som bærer en stilk sløyfe oligonukleotid mot EZH2 mRNA. De stabile shEZH2 kloner (HCTshEZ-2) skjerm svært lav mengde EZH2 protein samt lavt trimethylation på lysin 27 av histon H3 (H3K27me3), den EZH2-spesifikt substrat (Fig. 1a). Vi rapporterte at HCTshEZ-2 celler viser redusert trekkfugl og invasiv kapasitet sammenlignet med foreldre og mock transfekterte (HCTshpSUP) HCT116-celler [17]. Å identifisere potensielle faktorer som kan styre cellebevegelse av HCTshEZ-2 celler, protein uttrykk analyse av faktorer involvert i reguleringen av cytoskjelett dynamikk som RhoA, CDC42, ROCK1, Rac1, Cofilin og p-cofilin (nedstrøms effektorer av Rho GTPase pathway) har blitt analysert av western blot (WB). Som rapportert i fig. 1B, stanse av EZH2 ikke påvirke protein uttrykk nivåer av ingen av de analyserte aktin-modulerende faktorer. Motsatt, ble en bemerkelsesverdig hyper-fosforylering ved Serine 3 av den lille actin-bindende protein cofilin påvist (Fig. 1B). Videre gjorde i HCTshEZ-2 celler stanse av EZH2 ikke endre GTPase aktivitet av CDC42 og Rac1 som ble evaluert med GST-PAK trekke ned analysen (S1 fig.). Vi har også undersøkt indirekte potensialet aktivering av RhoA i HCTshEZ-2 celler. Ved å stanse RhoA med siRNA-teknologi har vi funnet at p-cofilin nivå forble den samme i alle cellelinjer (HCT116, HCTshpSUP og HCTshEZ-2). Derfor uttømming av EZH2 uttrykk påvirket ikke RhoA aktivitet og dermed cofilin fosforylering (S2A fig.). For å bevise at den observerte hyper-fosforylering av cofilin er ikke en off-target virkning av kloningsprosedyren, ble EZH2 transient utarmet med to forskjellige sirnas oligoer i HCT116 og RKO celler og 48 timer etter nivåer av p-cofilin ble analysert ved WB. Som vist på fig. 1C for HCT116 og i S2B fig. for RKO, forbigående EZH2 stanse resulterte i en signifikant økning av p-cofilin samt av ITGα2 nivåer i begge cellelinjer.
A. Proteinekspresjon og global-metyltransferase-aktiviteten av EZH2 i HCT116 og i HCTshEZ-2 stabile kloner, så vel som i HCTshpSUP mock kontrollcellene analysert ved WB. B. Protein uttrykk analyse av Rho GTPase familie komponenter og ITGα2 i HCT116, HCTshEZ-2 og HCTshSUP celler. C. Transient uttømming av EZH2 med to forskjellige siRNA oligos øker cofilin fosforylering på samme måte som stabil demping. D. fasekontrastmikroskop bilder av HCT116, HCTshEZ-2 og HCTshSUP celle-fenotyper, skala bar 150 mikrometer. E. Representative bilder av konfokal fluorescerende mikroskop i HCT116 og HCTshEZ-2 celler hvor p-cofilin ble farget (grønn). Kjerner er kontra med Hoechst (blå). Scale bar størrelse 150 mikrometer. F. EZH2 proteinnivåer sammenlignes med cofilin og p-cofilin nivåer i 7 CRC-cellelinjer. Tallene nedenfor blotter indikere bandet kvantifisering som ble utført ved hjelp av en dedikert programvare og Tubulin uttrykk som referanse lasting kontroll. Alle WB eksperimenter har blitt gjentatt minst tre ganger, er representative blotter og kvantifisering presentert.
Effekten av cofilin inaktive på fenotype og vekstegenskapene til HCTshEZ-2 celler er vel tydelig i standard todimensjonalt kultur. Faktisk er i HCTshEZ-2-celler antall celle-membran fremspring fattig, mindre fremtredende og den langstrakte formen av kontroll HCT116-celler går tapt, blir HCTshEZ-2-celler mer rund og flat (fig. 1D). Ved hjelp av konfokal mikroskopi og fluoressens-immunologisk til flekk p-cofilin vi bekreftet at inaktive p-cofilin økes i HCTshEZ-2-celler sammenlignet med foreldre HCT116-celler, og at p-cofilin er hovedsakelig lokalisert i kjernen av HCT116, mens i HCTshEZ- 2 celler p-cofilin er lokalisert både i kjernen og i cytoplasma (fig. 1E).
for å verifisere om forholdet mellom EZH2 og p-cofilin er en generell karakteristikk av CRC cellelinjer, analyserte vi cofilin , p-cofilin og EZH2 uttrykk nivåer i 7 CRC cellelinjer. I disse 7 CRC-cellelinjene en foregående sammenligning mellom EZH2 protein og globalt nivå av dets substrat H3K27me3 viste at celler overuttrykkende EZH2 (HCT116, RKO og SW620) også viser høye nivåer av H3K27me3 (data ikke vist, se ref. [17] ). Interessant nok har cellelinjer med høy EZH2 proteinnivåer vist nesten umulig å oppdage (HCT116) eller lav (SW620 og RKO) p-cofilin sammenlignet med de andre undersøkte cellelinjer, med unntak av Caco-2-mellomproduktet adenom-cellelinje (Fig. 1F ). I motsetning nivåer av cofilin protein (total-cofilin) var i det vesentlige den samme over hele de 7 cellelinjer undersøkt. For å kvantifisere sammenhengen mellom EZH2 ekspresjon og cofilin fosforylering i alle CRC-cellelinjer, med unntak av Caco2, den absolutte intensitet av EZH2 WB bånd av fig. 1F har blitt plottet mot den absolutte intensiteten av p-cofilin WB band som bruker et punktdiagram. En signifikant negativ korrelasjonskoeffisient (
R
= -0,7532) av den rette linje som oppnås med datapunktene indikerer at p-cofilin nivåer er omvendt korrelert med hensyn til EZH2 nivåer i 6 av 7 CRC-cellelinjer ( S3 fig.).
for ytterligere å validere p-cofilin western blot data og bekrefter at p-cofilin bidrar ikke til celle migrasjon når lokalisert i kjernen, HCT116, HCTsh-EZ-2, HT29 (høyeste WB p-cofilin nivå) og RKO (lav WB p-cofilin nivå) cellelinjer ble analysert med konfokalmikroskop av co-farging p-cofilin med G-aktin og separat med total-cofilin. Fig. 2A viser at i HT29-celler p-cofilin farging er høy sammenlignet med HCT116, HCT-shez-2 og RKO, som bekrefter WB data. Videre, p-cofilin i HT29-celler ble kun påvist i cytoplasma i motsetning HCT116, HCTshEZ-2 og RKO cellelinjer. I HT29, ble det samme mønsteret cytoplasmatiske også oppdaget at for total-cofilin (HT29 enkelt plan skisse i fig. 2B). Interessant, i HCT116, HCT-shez-2 og RKO celler total cofilin var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma i motsetning til p-cofilin (fig. 1E og 2B). Når det gjelder G-aktin, co-flekker eksperimenter påpekes at G-aktin er lokalisert i cytoplasma, så vel som i kjernen av alle cellelinjer. Vi observerte at kjernekraft p-cofilin sjelden co-lokalisere med G-aktin i HCT116 og RKO celler, som beviser at p-cofilin er ikke i stand til å binde G-aktin i kjernen. Videre, selv om HCT-shez-2 celler avledet fra HCT116 de viser p-cofilin også i cytoplasma i likhet med HT29 celler preget av lav trekkende kapasitet (Fig. 2A).
A. HCT116, RKO, HCT-shez-2 og HT29 har vært co-farget med p-cofilin (grønn) og G-aktin (rød) for å studere intracellulær lokalisering av både proteiner. Kjerner er kontra med Hoechst (blå). En flettingen av alle tre farger er også vist (slå sammen). Scale barer 10 mikrometer. B. Cofilin (grønn) farging i CRC celler. Bare HT29 celler presentert nesten eksklusivt cytoplasmisk lokalisering som vist ved enkelt-fly konfokalt bilde. Scale barer 50 mikrometer. C. Farmakologisk forstyrrelse av EZH2 protein ved DZNep i CRC cellelinjer med høy EZH2 protein uttrykk. D. Farmakologisk hemming av EZH2 enzymatisk aktivitet ved GSK343. Lave nivåer av H3K27me3 i behandlede celler indikerer at GSK343 effektivt blokkerer EZH2 aktivitet. E. TESK1 protein (øverst) og mRNA (nederst) uttrykk analyser på CRC celler med høy (HCT116 og HCT-shpSUP) og forstummet (HCTsh-EZ-2a /b) EZH2 protein nivåer. F. sirnas versus ITGα2 mRNA har blitt brukt til å redusere ITGα2 protein uttrykk. Effektene av ITGα2 lyddemping på cofilin og p-cofilin ble analysert ved hjelp av WB. Tallene nedenfor blotter indikere bandet kvantifisering som ble utført ved hjelp av en dedikert programvare og Tubulin uttrykk som referanse lasting kontroll. For p-cofilin kvantifisering i HCT116 og HCT-shez-2 celler alle verdiene er normalisert med hensyn til p-cofilin verdien av utransfekterte HCT116. Alle WB eksperimenter har blitt gjentatt minst to ganger og representative blotter vises.
Forholdet mellom EZH2 og p-cofilin ble også undersøkt ved å blokkere metyl-transferase aktivitet av EZH2 med to EZH2 hemmere 3 -Deazaneplanocin A (DZNep) og GSK-343 [26], [27] i cellelinjer hvor EZH2 er sterkt uttrykt: HCT116, SW620 og RKO. DZNep behandling forstyrret EZH2 protein i alle cellelinjer som resulterer i p-cofilin tilvekst uten at det påvirker den totale cofilin uttrykk (Fig. 2C). Lignende resultater ble oppnådd med GSK-343 behandling, som effektivt blokkerte den enzymatiske funksjon av EZH2, ettersom en bemerkelsesverdig global reduksjon av H3K27me3 merke ble observert i behandlede celler, uten å påvirke EZH2 og cofilin uttrykk nivåer, til tross for cofilin fosforylering (fig. 2D).
De EZH2-target-genet ITGα2 delvis kontroller cofilin fosforylering /de-fosforylering i CRC cellelinjer
etter kromatin immuno-nedbør (Chip) vi tidligere vist [17] som EZH2 hyper- methylates lysin 27 av histon H3 på ITGα2 genet arrangøren forårsaker epigenetisk gen-undertrykkelse (fig. 1B). Interessant, TESK1, en kinase kan fosforylere cofilin på serin 3 og dermed i stand til å regulere sin aktivitet, kan aktiveres ved inte-mediert signalisering [8], [28] som foreslår ITGα2 sti som kandidat for videre undersøkelser. Den de-undertrykket signaleringsaktiviteten av ITGα2 gjennom TESK1 kan være ansvarlig, i det minste delvis, for forbedring av p-cofilin i EZH2-stilnet celler. For å bekrefte denne hypotesen, ble første Real-Time PCR og WB analyser utført for å bekrefte uttrykk for TESK1 i CRC cellelinje som brukes for studien. Det er vist (Fig. 2E) som TESK1 ble uttrykt i HCT116-celler og at knebling av EZH2 ikke påvirke dens uttrykk ettersom ingen endringer av TESK1 mRNA og protein nivåer har blitt påvist blant kontroll og EZH2-silinced celler. Så, for å ta rollen som ITGα2 på cofilin sti, ble små interfererende RNA oligonukleotider versus ITGα2 (siITGα2) brukes til å redusere ITGα2 uttrykk i HCTshEZ-2 og HCT116 kontrollceller. Interessant, reduksjon av ITGα2 proteinnivå negativt påvirket p-cofilin hovedsakelig på HCTshEZ-2-celler (fig. 2E). Sammenlignbare resultater ble oppnådd også etter behandling av celler med DLD1 siITGα2. DLD1 uttrykker høye nivåer av ITGα2 protein i forhold til HCT116 (Fig. 2E) [17].
Cell behandling med EZH2 hemmere gitt ytterligere bevis for romanen foreslåtte epigenetisk mekanisme p-cofilin regulering. Som vist på fig. 2C og 2D, DZNep og GSK-343 behandlinger effektivt de-trykt ITGα2 genet i HCT116, RKO og SW620 celler, som er preget av lav ITGα2 uttrykk [17]. Faktisk EZH2 inhibitor behandlinger resulterte i en bemerkelsesverdig økning av p-cofilin i HCT116 og SW620 celler, og hadde mindre, men fortsatt betydelig effekt på p-cofilin nivåer i RKO celler.
Tredimensjonal cytoskjelettet organisasjon og migrasjon evnen til CRC cellelinjer er kontrollert av cofilin fosforylering
De morfologiske endringene som skjer når HCTshEZ-2 celler sås på matrigel (tredimensjonal kultur, 3D) indikerer at cofilin veien kan også være ansvarlig for vedheft egenskaper avgjørende for metastatisk celle spredning. HCT116 og HCTshEZ-2-celler dyrket i 3D er blitt farget med phalloidin, som binder F-aktin, konjugert til en fluorescerende kjemisk forbindelse og analysert med fluoriserende konfokal mikroskopi (fig. 3A). I HCTshEZ-2 celler inaktive p-cofilin stabiliserer aktin strukturer som er nødvendige for samhandling med ECM. Faktisk, etter 3 dager på matrigel, HCTshEZ-2-celler viste en flat celle-legemet, tydelig synlige kjerner og, enda viktigere, en enkelt celle monolag med godt synlige aktin filamenter (pilene i fig. 3A). I kontrast, gjorde HCT116 cellene ikke viser høye nivåer av F-aktin og cellene var i stand til å vokse som en svulst sfære.
A. F-aktin ble farget med phalloin konjugert til en fluorofor (rød) i HCT116 og HCTshEZ-2 celler dyrket i matrigel. Representative fasekontrastmikroskopi bilder av de samme kulturer blir også presentert for hver cellelinje. Pilene viser lange F-aktin molekyler. Scale bar 20 mikrometer. B. Analyse av relative mengden av F- og G-aktin i CRC celler med høy (HCT116 og HCT-shpSUP) og forstummet (HCTsh-EZ-2a /b) EZH2 protein nivåer. Intensitet av WB band har blitt kvantifisert og forholdet er beregnet i vilkårlige enheter. Representative blot av F- og G-aktin er også vist for hver cellelinje. Student T-test ble brukt for å evaluere statistikken betydning (*** = p-verdi 0,01) mellom HCTsh-EZ-2a /b celler og HCT116-celler. C. Migrasjon evne CRC cellelinjer transfektert med siITGα2. D. WB analyse av p-cofilin nivåer i CRC celler med høy (HCT116 og HCT-shpSUP) og brakt til taushet (HCTsh-EZ-2) EZH2 protein behandlet med ROCK1 inhibitor (Y27632) sammenlignet med ubehandlede celler. E. Migrasjon evne CRC cellelinjer behandlet med ROCK1 inhibitor (Y27632) sammenlignet med ubehandlede celler.
For å bedre kontrollere omfordeling av aktin filamenter i HCTshEZ-2 celler, G-aktin og F- aktin ble ulikt isolert fra HCTshEZ-2-celler, så vel som fra kontrollcellene dyrket i standard 2D kultur. Som tydelig vist i fig. 3B F-aktin nivåer i HCTshEZ-2-celler var mye rikere enn i kontroll HCT116-celler. Faktisk, er den gjennomsnittlige F-aktin /G-aktin-forholdet var ca. 3,5 ganger høyere i HCTshEZ-2-celler sammenlignet med kontrollene. Til slutt, for å bevise at avvikende inaktivering av ITGα2-cofilin aksen, mediert av EZH2, øker tumor cellemigrasjon vi målt vandrende evne HCT116, HCTshSUP, HCTshEZ-2 og DLD1 celler etter ITGα2 lyddemping. Som allerede vist i fig. 2D og omtalt ovenfor, siITGα2 effektivt redusert uttrykk for ITGα2 i alle cellelinjer analysert med påfølgende reduksjon av cofilin fosforylering som forverrer F-aktin /G-aktin omsetning. Spesielt siITGα2 hovedsakelig på HCTshEZ-2 og DLD1 celler økt migrasjon kapasitet med om lag 25% og 12% henholdsvis bekrefter at EZH2-silenced ITGα2-cofilin aksen er viktig for kreftcellebevegelse (Fig. 3C). Sammenlignbare resultater er blitt oppnådd også med sårheling analyse (S4 fig.).
sentral rolle p-cofilin i aktin dynamikk og cellemigrering ble også bekreftet av en farmakologisk hemning av ROCK1 aktivitet, som ikke involverer manipulering av ITGα2 uttrykk. Spesielt har vi brukt ROCK1 inhibitor Y-27632 for å blokkere cofilin fosforylering [29]. ROCK1 hemmer redusert p-cofilin i HCT116, HCTshpSUP og HCTshEZ-2 cellelinjer (Fig. 3D). Reduksjon av p-cofilin forbedret brøkdel av aktive cofilin som ble oversatt til en gevinst på migrasjon evne hovedsakelig på HCTshEZ-2 (Fig. 3E). Disse resultatene viser at i CRC celler forholdet p-cofilin /cofilin er avgjørende for kreft-celle spredning og at ITGα2 kan regulere cofilin også gjennom veier som involverer ROCK1.
Diskusjon
Ulike mekanismer har blitt beskrevet for å forklare den pro-metastatisk aktivitet av histon metyltransferase EZH2 i forskjellige krefttyper [30] – [32], men lite er kjent om dets rolle om CRC. I denne studien har vi undersøkt dette problemet ved å bruke en tap-av-funksjon tilnærming for å vurdere rollen til den histone modifiserings EZH2 i CRC celle migrasjon. Nærmere bestemt, tok vi fordel av muligheten for å ytterligere karakterisere en CRC-cellelinje (HCT-shez-2) hvor EZH2 er permanent taushet og av en ny forbindelse i stand til å spesifikt inhibere EZH2 metyltransferase-aktivitet, kalt GSK-343, så vel som en forbindelse i stand til å forstyrre PRC2 komplekse, heter DZNep. Det er vist at i denne cellelinjen EZH2 styrer epigenetiske cellebevegelse ved å holde cofilin stadig aktiv. Faktisk, etter genetiske og farmakologisk hemming av EZH2 ble cofilin fosforylering på serin 3 økt. Serin-3-fosforylert cofilin er inaktiv. Som en konsekvens av cofilin inaktivering, invadopodia montering på den fremre kant av migrerende celler, så vel som demontering bak-celle-side kan ikke moduleres, noe som resulterer i en reduksjon av cellebevegelse [3], [6]. Dette kan forklare den bemerkelsesverdige reduksjonscelle mobilitet av HCT-shez-2 sammenlignet med foreldre HCT116-celler [17]. Den direkte stanse handlingen av EZH2 på up-stream komponenter cofilin veien ble ekskludert. Faktisk har ingen endringer i proteinuttrykk og aktivitet blitt oppdaget av WB, GST-PAK trekke ned og siRNA analyser for, CDC42, Rac1, RhoA, ROCK1 samt total cofilin i HCT-shez-2-celler med hensyn til å kontrollere celler. For å bekrefte hypotesen om at EZH2 regulerer cellemigrasjon via en alternativ biologisk akse, og ikke ved å undertrykke Rho GTPase familie komponenter, forsøkte vi å undersøke på hvilken rolle ITGα2 genet. Faktisk er ITGα2 direkte regulert av EZH2 [17] og potensielt kan opptre på cofilin pathway. Følgelig har tidligere undersøkelser vist at TESK1 er i stand til å fosforylere cofilin ved serin 3 og særlig TESK1 kan aktiveres ved integrin-mediert signalisering [8], [28]. Kvantitativ PCR og WB analyse viste at TESK1 er uttrykt i HCT116-cellelinjen, og at EZH2 lyddemping ikke ble endret TESK1 ekspresjonsnivå. Det er videre vist at ITGα2 er den viktigste regulatoren av cofilin fosforylering av stanse ITGα2 protein i HCT116, HCT-shez-2 og i DLD1 celler. Faktisk, etter ITGα2 støydempere p-cofilin nivåene er redusert, beviser en direkte sammenheng mellom ITGα2 og p-cofilin muligens mediert av TESK1, selv om vi ikke kan utelukke involvering av andre kinaser målrettet av inte. [35].
